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口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定
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作者 王省 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 李冬 包慧 李平花 孙普 白兴文 陈应理 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期939-946,共8页
为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区... 为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单个B细胞抗体技术 单克隆工程抗体 衣壳蛋白VP2
VP3 G-H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响
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作者 陈冬冬 白兴文 +12 位作者 宫晓华 包慧 李平花 李冬 白启峰 袁红 孙普 马雪青 曹轶梅 陈应理 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1285-1294,共10页
【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP3 G-H环 定点突变体 生物学特性 内吞作用
三种大肠杆菌表达的口蹄疫病毒A型多表位蛋白对猪的免疫原性比较
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作者 曹轶梅 王兴凯 +5 位作者 王省 李坤 李冬 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期711-718,共8页
【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。... 【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化复性后,制苗免疫猪。分别于免疫前和免疫后14和28d采血分离血清,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测血清IgG抗体滴度。免疫28d后用FMDV强毒攻毒,以评估免疫保护效果。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果证实A10、IA10和FA10三种蛋白均获得表达,分子量分别为35、57和64 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。LPB-ELISA结果表明,A10+201免疫组IgG滴度低于灭活疫苗组,但高于其他免疫组。攻毒后A10+201免疫组和灭活疫苗免疫组全部猪(5/5)获得保护,IA10+201和FA10+201免疫组80%(4/5)猪保护,A10和FA10免疫组只有20%(1/5)猪保护,而PBS+201组所有猪均未保护。【结论】A10+201免疫保护效果较好,可作为候选疫苗进行进一步评价。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 A型 多表位蛋白疫苗
猪波形蛋白的原核表达及其对口蹄疫病毒浸染PK-15细胞的作用 预览
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作者 令瑛 马雪青 +7 位作者 李平花 张婧 李坤 冯若飞 马忠仁 卢曾军 刘在新 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期12-19,共8页
为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行... 为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪波形蛋白 原核表达 口蹄疫病毒 PK-15细胞
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黑小麦阿拉伯木聚糖酶提工艺优化及抗氧化活性研究 预览
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作者 陈卓昀 +4 位作者 曾凡航 王舒婷 韩国全 王利娜 陈洪 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2019年第3期374-382,共9页
【目的】研究黑小麦阿拉伯木聚糖(arabinoxylan,AX)的最佳酶提工艺及其抗氧化活性。【方法】以黑小麦为原料,利用响应面法优化木聚糖酶提取AX的最佳工艺条件,与纤维素酶提作对比;将两种酶提残渣用碱进行提取,比较分析酶提与残渣碱提所... 【目的】研究黑小麦阿拉伯木聚糖(arabinoxylan,AX)的最佳酶提工艺及其抗氧化活性。【方法】以黑小麦为原料,利用响应面法优化木聚糖酶提取AX的最佳工艺条件,与纤维素酶提作对比;将两种酶提残渣用碱进行提取,比较分析酶提与残渣碱提所得AX的抗氧化性。【结果】木聚糖酶提AX(xylanase extract arabinoxylan,XAX)的最佳工艺为木聚糖酶量39.99 mg、超声时间90.20 min、超声温度56.13 ℃、超声功率150 W,AX得率为4.83%,碱提残渣XAX-1得率为11.21%;纤维素酶提AX(cellulase extract arabinoxylan,CAX)得率为2.33%,碱提残渣CAX-1 得率为15.98%。XAX、CAX对·OH 和DPPH 的清除能力强于XAX-1和CAX-1;XAX、CAX、XAX-1、CAX-1的还原力较弱且差异不显著;铁离子螯合率为XAX-1、CAX-1>XAX、CAX,而XAX 及XAX-1的O2^-清除率优于CAX 及CAX-1。【结论】使用碱处理酶提所得残渣可以提高AX得率;4种方式提取的AX 均具有一定的抗氧化性,但其抗氧化性不完全与阿魏酸含量呈正相关。 展开更多
关键词 黑小麦 阿拉伯木聚糖 木聚糖酶 纤维素酶 响应面 抗氧化
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猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建
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作者 魏国燕 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 孙普 白兴文 李冬 陈应理 包慧 李平花 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期177-182,共6页
为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+)... 为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×10 7,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。 展开更多
关键词 猪CLEC8A基因 骆驼单域抗体 酵母展示文库 流式细胞术
针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析
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作者 寻广谨 李平花 +10 位作者 孙普 马雪青 白兴文 卢曾军 陈应理 包慧 李冬 曹轶梅 张婧 刘在新 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期988-992,共5页
针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子... 针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 P1基因 构建 生物学特性分析
表达FMDVB7多表位基因的重组PRRSV的拯救与复制水平的测定
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作者 白伟杰 曹轶梅 +10 位作者 包慧 孙普 李平花 白兴文 陈应理 李坤 马雪青 刘在新 李冬 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期449-453,共5页
利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP... 利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP基因正确表达。随后,采用相同的策略构建了表达口蹄疫病毒(FMDV)B7多表位基因的重组PRRSV(v Fl12-B7),拯救病毒v Fl12-B7感染Marc-145细胞后,可观察到典型的CPE;对拯救病毒进行RT-PCR扩增和序列测定,表明多表位基因正确插入;荧光定量PCR检测,第1代和第4代拯救病毒的拷贝数分别为3.76×10^5 copies/L与1.58×10^8 copies/L,说明重组病毒具有较好的复制能力,为以PRRSV为载体表达口蹄疫多表位基因活载体疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PRRSV 感染性克隆 FMDV B细胞表位 病毒载体疫苗
表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建
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作者 袁红 李平花 +12 位作者 袁子文 白兴文 孙普 马雪青 李坤 寻广谨 卢曾军 包慧 陈应理 曹轶梅 张婧 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1746-1752,共7页
【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制... 【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 EGFP 口蹄疫病毒 复制子
O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定 预览 被引量:2
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作者 袁红 李平花 +11 位作者 马雪青 方先珍 白兴文 孙普 卢曾军 包慧 曹轶梅 李冬 陈应理 张婧 刘在新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期96-100,共5页
为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/9... 为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A91-105中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A91-105-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 型间嵌合 标记病毒
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嵌合O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性
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作者 姜韶东 李平花 +9 位作者 孙普 马雪青 白兴文 包慧 卢曾军 曹轶梅 李冬 陈应理 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2396-2406,共11页
【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯... 【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯救得到两株基因3-程嵌合病毒rGDexc、rGZexc;进而从病毒复制和病毒对乳鼠的致病力方面,对嵌合病毒、亲本基因工程病毒以及FMDVO/GSLX/CHN/2010株进行了评价。【结果】FMDVO/GsLx/cHN/2010株复制较慢,对乳鼠致病力较差。嵌合病毒和亲本基因工程病毒的复制能力、对乳鼠的致病力明显高于FMDVO/GsLX/cHN/2010株。【结论】研究表明FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段不能独自决定该病毒较差的复制能力和较弱的乳鼠致病力。这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制以及S片段对病毒生物学特性的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 感染性克隆 S片段 病毒生物学特性
猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立 被引量:1
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作者 范朋举 曹轶梅 +9 位作者 卢曾军 张萌 孙普 李平花 白兴文 包慧 陈应理 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期902-908,共7页
利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0... 利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白主要抗原表位区 原核表达 间接ELISA 血清检测
一株口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的表位肽段鉴定 预览 被引量:1
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作者 王娜 卢曾军 +5 位作者 曹轶梅 李平花 孙普 曾巧英 刘在新 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第10期7-9,共3页
为鉴定口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体3A24#识别的表位区,对非结构蛋白3A分两个肽段进行原核表达,其中3A1和3A2肽段分别包含3A蛋白的第1位~89位和77位~153位氨基酸。分别针对两肽段基因设计并合成引物,PCR扩增后定向克隆到原核表... 为鉴定口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体3A24#识别的表位区,对非结构蛋白3A分两个肽段进行原核表达,其中3A1和3A2肽段分别包含3A蛋白的第1位~89位和77位~153位氨基酸。分别针对两肽段基因设计并合成引物,PCR扩增后定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)-PES-SUMO,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)pLys,IPTG诱导表达。用单克隆抗体3A24#对表达的3A1和3A2肽段进行Western blot检测,以鉴定单克隆抗体3A24#的识别表位肽。SDS-PAGE分析表明,成功表达了3A1和3A2肽段,大小分别为26ku和25ku。Western blot分析表明,FMDV牛阳性血清与两肽段均能识别,而单克隆抗体3A24#只能与3A2肽段发生反应,与3A1肽段不发生反应。3A24#单克隆抗体识别的抗原表位位于3A2肽段,即3A蛋白的第89aa~第153aa肽段上。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单克隆抗体 抗原表位
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N端嵌合口蹄疫病毒中和表位的猪圆环病毒2型衣壳蛋白的表达及其免疫原性 被引量:2
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作者 李艳丽 曹轶梅 +7 位作者 卢曾军 孙普 李平花 白兴文 包慧 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期907-914,共8页
采用口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白VP1G-H环132~160位和C-端200~213位氨基酸序列置换猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白的核定位信号序列,在大肠杆菌中表达嵌合FMDV表位的PCV2衣壳蛋白及完整的PCV2ORF2蛋白。通过C端的组氨酸标签采用亲和层... 采用口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白VP1G-H环132~160位和C-端200~213位氨基酸序列置换猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白的核定位信号序列,在大肠杆菌中表达嵌合FMDV表位的PCV2衣壳蛋白及完整的PCV2ORF2蛋白。通过C端的组氨酸标签采用亲和层析方法纯化获得目的蛋白,并成功进行复性。复性蛋白显示与PCV2、FMDV多克隆抗体有良好的免疫反应性。将复性蛋白加聚肌胞苷酸(Poly I:C)与ISA206制备油佐剂疫苗免疫小鼠,结果显示,复性与未复性蛋白均未能产生FMDV中和抗体,但产生了一定水平的FMDV特异性抗体。这可能是由于复性蛋白和包涵体蛋白N-端表位包埋,或细胞内转运受阻,或表位的不完全递呈影响了针对FMDV中和表位的抗体应答。表明,PCV2衣壳蛋白的N-端不适合插入FMDV中和性B细胞抗原表位。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 口蹄疫病毒 中和表位 嵌合衣壳蛋白 免疫原性
口蹄疫病毒非结构蛋白单克隆抗体阻断ELISA的建立与效果评价 被引量:5
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作者 厍大亮 卢曾军 +4 位作者 曹轶梅 孙普 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期1144-1151,共8页
使用组氨酸单克隆抗体作为捕获抗体,口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)3B单克隆抗体作为检测抗体,原核表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC作为抗原,建立了一种以区分疫苗免疫动物与康复带毒动物或持续感染动物为目的,检测口蹄疫病毒非结构蛋白3... 使用组氨酸单克隆抗体作为捕获抗体,口蹄疫病毒非结构蛋白(NSP)3B单克隆抗体作为检测抗体,原核表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC作为抗原,建立了一种以区分疫苗免疫动物与康复带毒动物或持续感染动物为目的,检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)。使用本研究建立的ELISA检测了大量牛、羊及猪的血清,并用公式(1-样品D450nm/阴性对照D450nm)来计算血清阻断率,最终确定:血清阴断率≥0.46判为阳性,血清阻断率〈0.46判为阴性。根据此标准检测试验感染牛、羊及猪血清,敏感性≥85.4%;检测免疫健康牛、羊及猪血清,特异性≥99.2%。通过比较发现本研究建立的ELISA与Ceditest NS ELISA试剂盒有很高的符合率,对感染动物血清与疫区田间牛血清的阳性检出率均高于同类试剂盒。表明,本研究建立的ELISA可以作为田间疫情监测方法,在口蹄疫灭活疫苗免疫动物群体中使用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白3ABC 3B单克隆抗体 阻断ELISA 免疫动物 感染动物 血清鉴别
口蹄疫病毒3A蛋白和FLAG标签的融合表达与血清学分析
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作者 祁国财 曹轶梅 +5 位作者 厍大亮 况文东 孙普 卢曾军 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期690-695,共6页
通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OzK3A蛋白的93-102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6~8周龄雌性... 通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OzK3A蛋白的93-102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,采用ELISA和Western-blot分析融合蛋白的血清学反应活性。结果表明,3A蛋白和3AF蛋白均能在大肠杆菌中有效表达,且主要以可溶性形式表达。纯化的3AF蛋白能与FLAG单抗特异性反应而未能诱导免疫小鼠产生针对该标签的抗体,体现了体外和体内的生物反应性差异。FLAG标签对3A蛋白的表达水平、表达形式等未产生显著影响。本研究为下一步FLAG标记病毒的拯救及其应用奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3A蛋白 FLAG标签 酶联免疫吸附试验
猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析 预览 被引量:2
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作者 李平花 白兴文 +9 位作者 孙普 李冬 卢曾军 包慧 曹轶梅 陈应理 谢宝霞 殷宏 刘在新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期 1562-1569,共8页
近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染... 近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16)。O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株。 展开更多
关键词 猪口蹄疫 基因工程病毒 构建 免疫原性分析
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一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用 被引量:1
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作者 赵清 孙普 +7 位作者 刘在新 李平花 包慧 曹轶梅 白兴文 卢曾军 李冬 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2011年第9期1281-1291,共11页
主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码... 主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗(P〈0.01)和OA-VP1免疫组(P〈0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+T细胞数量显著增多I,FN-γ产生水平显著升高(P〈0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 T细胞表位 T细胞免疫原 灭活疫苗 亚单位疫苗
口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因在昆虫细胞中的表达及应用 预览 被引量:1
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作者 张小丽 卢曾军 +4 位作者 马小军 曹轶梅 刘在新 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第12期 1724-1731,共8页
研究口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面的意义。本研究将FMDV NSP 2C基因,克隆到穿梭载体pFast-bac-HT-B,将其转入含骨架载体Bacmid的DH10Bac,经蓝白斑筛选得到重组骨架质粒Bacmid-2C。将... 研究口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面的意义。本研究将FMDV NSP 2C基因,克隆到穿梭载体pFast-bac-HT-B,将其转入含骨架载体Bacmid的DH10Bac,经蓝白斑筛选得到重组骨架质粒Bacmid-2C。将Bacmid-2C转染昆虫细胞Sf9,鉴定正确后,经3次增殖获得高滴度的P-3代病毒后,在High Five细胞中进行目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果显示在High Five细胞中得到了相对分子质量约为38.93ku的目的蛋白2C,Western blotting及Dot-ELISA结果显示,该表达产物对FMDV感染动物阳性血清有良好的反应性。以电泳纯化的2C蛋白为抗原建立间接ELISA,检测健康非免疫动物、免疫动物及FM-DV试验感染动物血清,结果表明2C-ELISA不但能区分免疫动物和感染动物的血清,而且还能检测FMDV感染早期动物血清中的2C抗体。说明昆虫细胞表达的2C蛋白可作为FMDV疫苗免疫动物与自然感染动物鉴别诊断的良好抗原。2C基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为建立通过检测几种NSP抗体,筛查感染及隐性带毒动物,净化畜群的方法奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 2C基因 昆虫杆状病毒 表达 应用
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国内现有猪口蹄疫O型灭活疫苗对2010年流行毒株的抵抗力 预览
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作者 李冬 谢宝霞 +8 位作者 陈应理 孙普 白兴文 卢曾军 包慧 曹轶梅 李平花 刘在新 《中国动物保健》 2010年第12期 12-14,共3页
在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发... 在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3~5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2~3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。 展开更多
关键词 猪口蹄疫 O型 国内商品疫苗 流行毒株 抵抗力
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