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口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定
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作者 王省 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 李冬 李平花 孙普 白兴文 陈应理 付元 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期939-946,共8页
为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区... 为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单个B细胞抗体技术 单克隆工程抗体 衣壳蛋白VP2
VP3 G-H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响
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作者 陈冬冬 白兴文 +12 位作者 宫晓华 李平花 李冬 付元 白启峰 袁红 孙普 马雪青 曹轶梅 陈应理 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1285-1294,共10页
【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP3 G-H环 定点突变体 生物学特性 内吞作用
化肥减施条件下配施生物有机肥对番茄生长及品质的影响 预览
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作者 唐宇 +5 位作者 詹发强 侯敏 王宁 杨蓉 林子敬 龙宣杞 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期841-854,共14页
【目的】研究以生物有机肥替代常规化肥对番茄生长及品质的影响,为化肥减施和提高番茄品质、稳定现有产量提供应用和理论基础。【方法】化肥常规用量减施30%、50%,根据不同减施比例配施生物有机肥,小区采用随机区组设计,土样及番茄果实... 【目的】研究以生物有机肥替代常规化肥对番茄生长及品质的影响,为化肥减施和提高番茄品质、稳定现有产量提供应用和理论基础。【方法】化肥常规用量减施30%、50%,根据不同减施比例配施生物有机肥,小区采用随机区组设计,土样及番茄果实采用随机取样法,测定减施化肥配施生物有机肥对土壤养分转化、及番茄果实营养品质、产量、发病率的影响。【结果】用生物有机肥代替化肥可增加土壤中速效N、P、K的含量,降低土壤pH值和电导率,与常规施肥处理相比,番茄果实总酸提高7.87%,VC含量提高24.95%,可溶性糖提高17.19%,产量与常规持平,差异不显著,番茄脐腐病发病率较常规施肥降低56.83%。【结论】在加工番茄种植中,用生物有机肥代替化肥的施肥方式可以降低化肥的施用量,有利于番茄果实的生长,品质提高,降低番茄脐腐病发病率。 展开更多
关键词 番茄 生物有机肥 土壤养分 营养品质 产量 发病率
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宿主细胞基因序列插入亚洲1型口蹄疫病毒导致病毒对牛的致病性减弱的研究
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作者 邹兴启 朱元源 +13 位作者 孙普 郭晓宇 徐璐 万建青 夏应菊 张乾义 徐嫄 李翠 王兆 王琴 刘在新 朱鸿飞 赵启祖 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期152-158,共7页
1株Asia 1型口蹄疫疫苗毒株在BHK21悬浮培养细胞中传代时与宿主BHK21细胞m RNA重组,导致VP1第206位与第207位氨基酸之间插入了VDLV序列,该插入突变使得疫苗免疫效果大幅下降,不能产生有效保护。比较发现,含12 nt插入序列的变异毒株(Vac-... 1株Asia 1型口蹄疫疫苗毒株在BHK21悬浮培养细胞中传代时与宿主BHK21细胞m RNA重组,导致VP1第206位与第207位氨基酸之间插入了VDLV序列,该插入突变使得疫苗免疫效果大幅下降,不能产生有效保护。比较发现,含12 nt插入序列的变异毒株(Vac-Asia1-VDLV)与亲本毒株(Asia 1/HN/06)在BHK21细胞上的生长曲线存在较大差异,变异毒株可感染CHO-K1,pgsA-745,pgsB-618,pgsD-677细胞,毒价可达到1×10^5PFU/mL以上,而亲本毒不能感染CHO类细胞并产生蚀斑。动物试验结果显示,乳鼠半数致死量(LD50)与亲本毒株相比变化不明显。但牛感染试验表明,大剂量(1×10^7LD50)接种牛舌面,Vac-Asia1-VDLV不引起体温反应和其它临床症状,荧光定量PCR检测鼻拭子和血液时未发现病毒,而Asia 1/HN/06引起典型的口蹄疫症状,鼻拭子和血液中检出病毒。上述试验结果表明,与亲本毒相比,变异毒株Vac-Asia 1-VDLV对牛的致病性明显降低。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 ASIA 1型 重组 致病力
两株PRRSV NSP2不同位置缺失基因工程病毒的生物学特性分析
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作者 谯雨 王治家 +9 位作者 张婧 孙普 白兴文 李坤 曹轶梅 李平花 李冬 刘在新 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1073-1081,共9页
为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2高变区对病毒复制及相关细胞因子表达水平的影响,以PRRSV GSWW/2015强毒株感染性分子克隆为基础,在前期缺失NSP2第519~565位47个氨基酸的D5毒株的基础上,进一步缺失了NSP2第628~747位120个氨... 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2高变区对病毒复制及相关细胞因子表达水平的影响,以PRRSV GSWW/2015强毒株感染性分子克隆为基础,在前期缺失NSP2第519~565位47个氨基酸的D5毒株的基础上,进一步缺失了NSP2第628~747位120个氨基酸(D14),并比较分析了缺失毒株与亲本病毒GSWW的复制能力。结果显示,D14缺失病毒相对于D5缺失毒与亲本病毒GSWW/2015的复制水平有所降低,但三者之间无显著差异。将亲本病毒、D5与D14缺失毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),于不同时间点检测了炎性细胞因子m RNA的表达水平。结果表明,在感染PAM后第24小时,相对于D14缺失病毒与亲本毒,D5缺失毒诱导IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1βm RNA表达水平显著上升;D5与D14缺失毒在感染PAM细胞后第12小时,诱导IL-10、HMGB1水平显著降低,D14的降低幅度更显著。提示D5缺失区有促进早期炎性应答的作用,D5与D14缺失均可以明显降低IL-10抑制性细胞因子的表达水平。说明NSP2在调节炎性应答与免疫抑制方面具有重要的作用。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性分子克隆 非结构蛋白2 生物学特性 细胞因子
猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建
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作者 魏国燕 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 孙普 白兴文 李冬 陈应理 李平花 付元 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期177-182,共6页
为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+)... 为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×10 7,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。 展开更多
关键词 猪CLEC8A基因 骆驼单域抗体 酵母展示文库 流式细胞术
红枣黑斑病拮抗细菌JK1产芽孢培养基的优化 预览
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作者 王宁 侯敏 +4 位作者 房世杰 艾尼江·尔斯满 侯新强 杨蓉 《新疆农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期1098-1106,共9页
【目的】采用响应面法对红枣黑斑病的拮抗细菌JK1培养基进行优化,提高其发酵产物中芽孢的浓度。为该菌应用提供数据。【方法】单因素实验确定培养基碳氮源物质,Plackett-Burman试验分析发酵培养基中对JK1发酵影响最重要的主要因素;运用... 【目的】采用响应面法对红枣黑斑病的拮抗细菌JK1培养基进行优化,提高其发酵产物中芽孢的浓度。为该菌应用提供数据。【方法】单因素实验确定培养基碳氮源物质,Plackett-Burman试验分析发酵培养基中对JK1发酵影响最重要的主要因素;运用最陡爬坡法对主要因素进行试验,获得主要因素的最适范围。通过响应面分析得到主要因素的最优水平。【结果】优化后的培养基组成为:麦芽浸粉25.00 g/L、葡萄糖0.57 g/L、大豆蛋白胨12.5 g/L、NaCl 2.7 g/L、K_2HPO_4 0.25 g/L、MgSO_4 0.625 g/L。【结论】在最优发酵培养基培养下,多粘类芽孢杆菌的芽孢数提高了3.4倍,达到4.92×10~9CFU/mL。 展开更多
关键词 红枣黑斑病 多粘类芽孢杆菌 芽孢产量 培养基优化 响应面试验
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双指标优化黑曲霉液态发酵条件及降解棉秆效果 预览
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作者 郭凯 侯敏 +6 位作者 王宁 詹发强 杨蓉 杨文绮 龙宣杞 崔卫东 《新疆农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第11期2122-2133,共12页
【目的】以羧甲基纤维素钠酶活(Carboxymethylcellulose sodium enzyme activity,CMCase)和滤纸酶活(Filter paper enzyme activity,FPAase)作为双指标,通过响应面法对黑曲霉(Aspergillus niger)ZD产纤维素酶的液体发酵条件进行优化,研... 【目的】以羧甲基纤维素钠酶活(Carboxymethylcellulose sodium enzyme activity,CMCase)和滤纸酶活(Filter paper enzyme activity,FPAase)作为双指标,通过响应面法对黑曲霉(Aspergillus niger)ZD产纤维素酶的液体发酵条件进行优化,研究黑曲霉对棉花秸秆的降解效果。【方法】通过单因素试验确定主要影响因素,通过Plackett-Burman和Box-Behnken设计进行因素优化和交互作用的影响,测定棉秆中纤维素含量。【结果】单因素试验确定碳源为淀粉,氮源为蛋白胨,无机盐为K 2 HPO 4,培养时间168 h,转速150 r/min,温度30℃,接种量7%;利用Plackett-Burman设计筛选出影响产酶的显著因素是淀粉质量浓度、蛋白胨质量浓度、转速和接种量;最后通过Box-behnken确定产酶的最佳发酵条件,淀粉质量浓度1.21 g/100 mL,蛋白胨质量浓度0.25 g/100 mL,K 2 HPO 4质量浓度0.1 g/100 mL,培养时间168 h,转速170 r/min,温度30℃,接种量7.8%,比初始发酵条件提高了35.96%。【结论】利用黑曲霉通过液体发酵降解棉秆效果显著,可以有效降解棉秆中纤维素和半纤维素,用真菌实现棉秆饲草化极具前景。 展开更多
关键词 黑曲霉 液体发酵 纤维素酶 棉花秸秆 半纤维素
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LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响 被引量:1
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作者 甘利鹏 张婧 +10 位作者 孙普 白伟杰 王治家 曹轶梅 李坤 白兴文 李平花 李冬 刘在新 卢曾军 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期537-544,共8页
应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_0017904... 应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。 展开更多
关键词 PRRSV LncRNA TCONS00179042 MARC-145细胞 过表达 复制
新疆艾丁湖中度嗜盐苯酚降解菌多样性研究 预览 被引量:1
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作者 王芸 倪萍 +3 位作者 蒋刚强 黄玲 唐蜀昆 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2018年第4期18-24,共7页
高盐含酚废水属于极难处理的废水之一,筛选具有生物学降解能力的嗜盐菌有助于解决这一难题。从新疆艾丁湖盐湖中分离筛选能够降解苯酚的中度嗜盐菌,了解盐湖中度嗜盐苯酚降解菌的多样性组成和降解能力。研究结果表明,10%(质量分数)的... 高盐含酚废水属于极难处理的废水之一,筛选具有生物学降解能力的嗜盐菌有助于解决这一难题。从新疆艾丁湖盐湖中分离筛选能够降解苯酚的中度嗜盐菌,了解盐湖中度嗜盐苯酚降解菌的多样性组成和降解能力。研究结果表明,10%(质量分数)的盐浓度条件下,分离得到166株嗜盐菌,通过以苯酚为唯一碳源的培养基进行降解活性筛选后得到45株阳性菌,根据细菌16S rRNA基因序列系统进化分析,这45株菌分别归类到3个门,5个科,9个属。其中拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)是优势菌,占总量的68.8%,其余菌分布于Bacillus、Gracilibacillus、Pontibacillus、Halobacillus、Marinococcus和Halomonas属。在含100 mg/L苯酚的液体培养基,经过10 d培养后,这45株菌降解效率为1%~17%。本研究为工业应用提供了嗜盐微生物种质资源,极具进一步发掘和研究价值。 展开更多
关键词 艾丁湖 中度嗜盐菌 16S RRNA基因 苯酚降解
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棉秸秆纤维素降解菌系构建及固体发酵条件优化 预览 被引量:2
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作者 侯敏 +6 位作者 王宁 詹发强 杨文琦 侯新强 杨蓉 龙宣杞 崔卫东 《新疆农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期936-948,共13页
【目的】构建棉秸秆降解菌系及其固体发酵条件优化。【方法】根据羧甲基纤维素酶活(CMC)和滤纸酶活(FPA)筛选纤维素降解能力强的菌株,与调节发酵品质的菌株配比,采用响应面法评价初始含水量、接种量、发酵天数及其交互作用对棉秸秆纤维... 【目的】构建棉秸秆降解菌系及其固体发酵条件优化。【方法】根据羧甲基纤维素酶活(CMC)和滤纸酶活(FPA)筛选纤维素降解能力强的菌株,与调节发酵品质的菌株配比,采用响应面法评价初始含水量、接种量、发酵天数及其交互作用对棉秸秆纤维素降解率的影响。【结果】得到24株纤维素降解菌,其中一株透明圈直径与菌落直径的比例最大值6.20,FPA酶活力9.699U/h,CMC酶活力10.435U/h,通过鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis),与产朊假丝酵母(Candida utilis)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)构建复合菌系按1∶1∶2∶1进行发酵,对模型进行方差分析,方程回归显著(P<0.0001),接种量15.0%,发酵时间35.0d,水分80.0%时,纤维素降解率达35.91%,接种量对纤维素降解率影响最大。【结论】构建了棉秸秆纤维素降解菌系,确定了固体发酵最佳条件,为棉秸秆饲料化提供了实验及理论依据。 展开更多
关键词 棉秸秆 纤维素 复合菌系 固体发酵
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口蹄疫病毒反向遗传操作技术体系建立及应用
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作者 刘在新 李平花 +3 位作者 白兴文 孙普 卢曾军 《中国科技成果》 2018年第21期40-42,共3页
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种烈性传染病。该病是OIE法定必报的动物传染病之一,我国也将其列为一类动物疫病。长期以来,口蹄疫在世界范围内广泛流行,危害巨大。有效防控该病需要厘... 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种烈性传染病。该病是OIE法定必报的动物传染病之一,我国也将其列为一类动物疫病。长期以来,口蹄疫在世界范围内广泛流行,危害巨大。有效防控该病需要厘清病原的特性,研发适合对路的疫苗。本研究历经16年,在国内率先建立了口蹄疫病毒反向遗传操作技术体系,通过对我国历史代表株和当前流行株的致病性、基因功能、遗传表型变异的分子基础等研究,创制了国际首例口蹄疫标记疫苗,契合国家推进口蹄疫免疫无疫区建设之急需,将为我国口蹄疫的净化提供不可或缺的技术支撑。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 反向遗传学 病原特性 标记疲苗
黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶条件优化 预览
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作者 郭凯 崔卫东 +3 位作者 王宁 侯敏 房世杰 《新疆农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第9期1717-1727,共11页
【目的】以棉花秸秆作为发酵基质,优化黑曲霉(Aspergillus niger)ZD固体发酵产纤维素酶的发酵条件。【方法】以固体发酵条件(棉花秸秆和玉米粉的比例、发酵时间、接种率、含水量和pH值)为优化因素,通过单因素试验和Plackett-Burman试验... 【目的】以棉花秸秆作为发酵基质,优化黑曲霉(Aspergillus niger)ZD固体发酵产纤维素酶的发酵条件。【方法】以固体发酵条件(棉花秸秆和玉米粉的比例、发酵时间、接种率、含水量和pH值)为优化因素,通过单因素试验和Plackett-Burman试验,确定主要影响因素;再由最陡爬坡试验确定优化中心点,最后通过Box-Behnken中心组合设计确定主要影响因素及其交互作用对固体发酵产酶的影响,并对其进行回归分析。【结果】由单因素试验和Plackett-Burman试验确定碳氮比,接种量和含水率为主要影响因素;最陡爬坡试验确定棉花秸秆与玉米粉的比例4∶1,接种量10%和含水率60%为中心点;Box-Behnken中心组合试验确定最佳发酵条件:棉花秸秆和玉米粉的比例为4.4∶1,接种量8.12%,含水率60%,发酵时间40 d,pH为4,此条件下羧甲基纤维素钠酶活最高,为310.885 U/mL;比未优化条件下的酶活207.496 U/mL提高了49.8%。【结论】确定黑曲霉ZD利用棉花秸秆固体发酵产纤维素酶的最优条件,为利用该菌制备棉花秸秆发酵饲料,降解棉花秸秆纤维素含量,提供了理论依据和工艺参数。 展开更多
关键词 黑曲霉 棉花秸秆 响应面 固体发酵
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针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析
14
作者 寻广谨 李平花 +10 位作者 孙普 马雪青 白兴文 卢曾军 陈应理 李冬 曹轶梅 付元 张婧 刘在新 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期988-992,共5页
针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子... 针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 P1基因 构建 生物学特性分析
2株番茄早疫病拮抗菌的分离筛选与拮抗作用研究 预览 被引量:2
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作者 杨蓉 杨文琦 +6 位作者 张峥 詹发强 侯敏 侯新强 王宁 龙宣杞 《新疆农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期1496-1504,共9页
【目的】从新疆昌吉、焉耆、喀什、乌苏、吉木萨尔五地多年种植番茄的农田土壤样品,进行拮抗菌的筛选,选取对番茄早疫病菌(Alternaria solani)有具有较强抑菌活性的菌株。【方法】采用平板分离培养法从加工番茄的根际土壤中分离拮抗菌... 【目的】从新疆昌吉、焉耆、喀什、乌苏、吉木萨尔五地多年种植番茄的农田土壤样品,进行拮抗菌的筛选,选取对番茄早疫病菌(Alternaria solani)有具有较强抑菌活性的菌株。【方法】采用平板分离培养法从加工番茄的根际土壤中分离拮抗菌,平板对峙培养实验进行初筛和复筛,根据培养特征、菌体形态及16S r DNA系统发育分析进行初步鉴定,显微观察法观察拮抗菌对病原菌菌丝生长的拮抗作用,盆栽法测定相对防效。【结果】共分离得到90株细菌菌株,初筛得到对番茄早疫病菌有明显拮抗作用的细菌,复筛选取2株抑制作用显著的细菌(J2-2、J2-4),并初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的近似种;显微镜下观察到2株拮抗菌的发酵液对番茄早疫病菌丝有明显的致畸作用;在盆栽试验中,拮抗菌发酵液对番茄早疫病菌的相对防效可达到35%以上。【结论】筛选到的2株拮抗菌对番茄早疫病菌表现出较好的拮抗作用,对番茄早期病害的生物防治具有一定的应用价值。 展开更多
关键词 番茄早疫病 分离 筛选 鉴定
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高产乙醇的酿酒酵母的筛选及性能检测 预览 被引量:1
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作者 靳正忠 王宁 +2 位作者 侯敏 陈福双 《甘肃农业》 2017年第1期34-37,共4页
目的是从新疆葡萄酒产地筛选适合当地生境的野生酵母菌种资源.采用可培养方法,分离符合条件的酵母菌株,对其生理生化、分子生物学及生长耐受性等各方面进行更细致研究.从酿酒葡萄鲜果、种植土壤及白兰地发酵基质中筛选到酵母菌36株,随... 目的是从新疆葡萄酒产地筛选适合当地生境的野生酵母菌种资源.采用可培养方法,分离符合条件的酵母菌株,对其生理生化、分子生物学及生长耐受性等各方面进行更细致研究.从酿酒葡萄鲜果、种植土壤及白兰地发酵基质中筛选到酵母菌36株,随后通过WL琼脂培养基初筛,获得符合产酒精特征的菌株10株.对这10株酵母菌进行生长发酵能力的复筛检测,编号为B5、B6、B9的三株菌经过48h的发酵,酒精发酵能力较好.进而结合生理生化及分子测序鉴定,分离的三株菌均属于酿酒酵母.在对供试菌株进行耐受性检测中,B5的酒精耐受性最高可达16%、B6、B9为14%;B5、B9最高可耐受2.0 mol/L KCl,B6最高可耐受2.25 mol/L KCl,同时,三株菌均能耐受50%的葡萄糖浓度,具有较广泛的酸碱适应性,热致死温度都为61℃~64℃之间,耐受10d饥饿后,仍能良好生长.获得3株有良好应用潜能的野生酿酒酵母菌株,为保护该区微生物资源及开发工业菌株具有重要意义. 展开更多
关键词 酿酒酵母 乙醇 耐受性
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表达FMDVB7多表位基因的重组PRRSV的拯救与复制水平的测定
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作者 白伟杰 曹轶梅 +10 位作者 孙普 付元 李平花 白兴文 陈应理 李坤 马雪青 刘在新 李冬 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期449-453,共5页
利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP... 利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP基因正确表达。随后,采用相同的策略构建了表达口蹄疫病毒(FMDV)B7多表位基因的重组PRRSV(v Fl12-B7),拯救病毒v Fl12-B7感染Marc-145细胞后,可观察到典型的CPE;对拯救病毒进行RT-PCR扩增和序列测定,表明多表位基因正确插入;荧光定量PCR检测,第1代和第4代拯救病毒的拷贝数分别为3.76×10^5 copies/L与1.58×10^8 copies/L,说明重组病毒具有较好的复制能力,为以PRRSV为载体表达口蹄疫多表位基因活载体疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PRRSV 感染性克隆 FMDV B细胞表位 病毒载体疫苗
O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定 预览 被引量:2
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作者 袁红 李平花 +11 位作者 马雪青 方先珍 白兴文 孙普 卢曾军 曹轶梅 李冬 付元 陈应理 张婧 刘在新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期96-100,共5页
为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/9... 为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A91-105中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A91-105-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 型间嵌合 标记病毒
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表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建
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作者 袁红 李平花 +12 位作者 袁子文 白兴文 孙普 马雪青 李坤 寻广谨 卢曾军 陈应理 曹轶梅 付元 张婧 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1746-1752,共7页
【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制... 【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 EGFP 口蹄疫病毒 复制子
高效降解棉酚菌株的筛选及脱毒条件的研究 预览 被引量:2
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作者 侯敏 +4 位作者 王宁 詹发强 杨蓉 龙宣杞 崔卫东 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1114-1121,共8页
【目的】选育降解棉酚菌株,组建复合菌系,优化固体发酵条件。【方法】从实验室已有菌株、动物新鲜粪便和土壤中筛选降解棉酚菌株,确定共生菌株混合配比,采用响应面法评价水分、接种量、发酵天数及其交互作用对棉酚降解率的影响,在此基础... 【目的】选育降解棉酚菌株,组建复合菌系,优化固体发酵条件。【方法】从实验室已有菌株、动物新鲜粪便和土壤中筛选降解棉酚菌株,确定共生菌株混合配比,采用响应面法评价水分、接种量、发酵天数及其交互作用对棉酚降解率的影响,在此基础上,对主要影响因素进行回归分析。【结果】选育出10株符合《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定的降解棉酚菌株,确定共生菌株最优配比为QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶2∶1∶1,最优的固体发酵培养条件为水分68.8%、接种量12.8%、发酵天数42.5 d,在此条件下脱毒率可达到91.4%。【结论】确定了混合菌发酵棉秸秆脱毒的最佳条件,为混合菌棉秸秆固体发酵降低游离棉酚含量的研究提供了相应的工艺参数和理论依据。 展开更多
关键词 棉秆 棉酚 脱毒 固体发酵
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