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与马立克病病毒编码的miR-M31-3p互作的宿主靶基因筛选与鉴定 预览
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作者 滕蔓 +4 位作者 李会珍 朱志坚 刘豪丽 罗俊 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期441-448,共8页
血清Ⅰ型马立克病病毒(MDV-1)编码26个病毒miRNA,前期研究发现这些miRNA可能在鸡马立克病肿瘤发生中发挥重要调控作用。为研究MDV-1编码的miRNA基因miR-M31-3p在病毒感染及致病过程中的作用机制,本研究利用杂交PCR方法构建宿主cDNA文库... 血清Ⅰ型马立克病病毒(MDV-1)编码26个病毒miRNA,前期研究发现这些miRNA可能在鸡马立克病肿瘤发生中发挥重要调控作用。为研究MDV-1编码的miRNA基因miR-M31-3p在病毒感染及致病过程中的作用机制,本研究利用杂交PCR方法构建宿主cDNA文库,对与miR-M31-3p互作的宿主候选靶基因进行初步筛选,结果获得了49个候选靶基因。通过双荧光素酶报告试验证实miR-M31-3p与鸡GNPAT、TCF12、FIGNL1、CNDP2、MGST1和CD99L2的3'-UTR在体外存在相互作用。进一步通过qRT-PCR分析显示:过表达miR-M31-3p的CEF中,上述6个候选基因mRNA转录水平均显著下调;当MDV感染CEF时,除CD99L2之外的5个候选靶基因的转录水平均显著下调,而在miR-M31-3p基因缺失的MDV株感染的CEF中这5个靶基因均正常转录。上述结果证实CNDP2、GNPAT、TCF12、FIGNL1和MGST1为与miR-M31-3p互作的宿主靶基因。本研究为进一步揭示miR-M31-3p调控MDV感染宿主的致病机制奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病病毒 miRNA miR-M31-3p 宿主靶基因 CDNA文库
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狂犬病病毒G蛋白在水稻中的表达及遗传稳定性鉴定
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作者 申雪静 二芹 +8 位作者 许倩茹 刘林科 万博 刘运超 孙亚宁 赵东 牛香香 邓瑞广 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期204-211,共8页
狂犬病病毒(Rabies virus, RV) G蛋白是唯一能激发机体产生细胞免疫,并诱导产生中和抗体的结构蛋白,也是狂犬病病毒中唯一糖基化的结构蛋白,此外还介导细胞融合、受体结合以及参与病毒的致病等。本研究将优化的狂犬病G基因(GenBank登录... 狂犬病病毒(Rabies virus, RV) G蛋白是唯一能激发机体产生细胞免疫,并诱导产生中和抗体的结构蛋白,也是狂犬病病毒中唯一糖基化的结构蛋白,此外还介导细胞融合、受体结合以及参与病毒的致病等。本研究将优化的狂犬病G基因(GenBank登录号:ABI53869.1)序列插入到中间载体pMP3上,成功构建中间载体pMP3-G,然后将中间载体pMP3-G和植物载体pCAMBIA1300通过双酶切、连接,成功地构建了植物表达载体pCAMBIA1300-G。挑选空白未转基因水稻(Oryza sativa)种子TP309消毒,在愈伤诱导培养基上31℃光照3 d,使其长出愈伤组织,用已经转入狂犬病G基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105去侵染愈伤组织,并与愈伤组织共培养3 d,将狂犬病G基因导入水稻愈伤组织中。愈伤组织再经过潮霉素抗性筛选、分化、出芽、生根,获得313株植株,取313株植株的叶片通过十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)法提取叶片基因组DNA,对其进行PCR扩增,经核酸胶进行初步鉴定,有79株为阳性,经过炼苗、种植共获得50株阳性表达植株。分别随机挑选50株阳性植株的种子,切半,标记,将不含胚乳的一半研磨,用提取液提取蛋白后通过抗原检测试纸条和Western blot检测,结果表明,G蛋白在转基因水稻种子中成功表达,且具有良好的反应原性。从50株阳性表达植株中挑选出高表达、反应原性最好的4个株系,将这4个株系T1代中与检测阳性结果相对应的含有胚乳的另一半种子进行组织培养种植,在植株移栽大田前后,再次用CTAB法提取T1代植株叶片基因组DNA,并以水稻的内源基因水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)为内参基因,通过相对荧光定量PCR(relative fluorescence quantitative PCR)方法筛选阳性植株中的纯合植株,通过绝对荧光定量PCR(absolute real-time PCR)计算纯合植株的拷贝数,结果显示,132株植株中35株为� 展开更多
关键词 狂犬病病毒 G基因 转基因水稻 荧光定量 纯合子 拷贝数
两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析 预览
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作者 李翔 郭振华 +3 位作者 阮海宇 乔松林 以芳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第3期881-890,共10页
为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。... 为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID50法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36h病毒滴度分别可达10^8.35和10^6.63 TCID50/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD50分别为10^2.13及10^3.25 TCID50。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒(PRV) 分离鉴定 噬斑纯化 感染试验 序列分析
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猪瘟抗体检测试纸研发及制备工艺的优化 预览
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作者 孙亚宁 王丽 +6 位作者 王栋 杨苏珍 陈鑫鑫 刘亚伟 立林 邓瑞广 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期169-175,共7页
为研制灵敏、准确、稳定的猪瘟抗体检测试纸,对胶体金标记猪瘟病毒(CSFV)Erns-E2蛋白的pH、封闭液、保存液及样品垫等试纸生产各环节的保护剂、稳定剂及缓冲系统进行优化,确定猪瘟抗体检测试纸生产的工艺参数,使试纸的准确性、灵敏度及... 为研制灵敏、准确、稳定的猪瘟抗体检测试纸,对胶体金标记猪瘟病毒(CSFV)Erns-E2蛋白的pH、封闭液、保存液及样品垫等试纸生产各环节的保护剂、稳定剂及缓冲系统进行优化,确定猪瘟抗体检测试纸生产的工艺参数,使试纸的准确性、灵敏度及稳定性满足批量生产要求。该试纸在室温干燥条件下可稳定保存1a以上,为实现猪瘟抗体检测试纸的商业化及广泛应用奠定基础。 展开更多
关键词 猪瘟 抗体 试纸 优化
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PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达
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作者 许瑞勤 郭嘉 +9 位作者 魏凤灵 冯延 马思续 留君 李想通 李闻 孙杨杨 杨国宇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期609-614,621共7页
参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的O... 参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。 展开更多
关键词 PRRSV GP5 杆状病毒表达系统 真核表达
马立克病病毒编码的miR-M11-5p宿主靶基因的筛选与鉴定 预览
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作者 刘豪丽 滕蔓 +5 位作者 李会珍 余祖华 刘金玲 丁轲 罗俊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1026-1038,共13页
作为α疱疹病毒的重要成员,马立克病病毒(MDV)感染鸡可引起免疫抑制及快速发作的T细胞淋巴瘤,即马立克病(MD)。此前发现MDV基因组编码大量病毒miRNA,可能在病毒复制、潜伏感染及肿瘤发生中起重要作用。基因敲除miR-M11-5p可显著增强MDV... 作为α疱疹病毒的重要成员,马立克病病毒(MDV)感染鸡可引起免疫抑制及快速发作的T细胞淋巴瘤,即马立克病(MD)。此前发现MDV基因组编码大量病毒miRNA,可能在病毒复制、潜伏感染及肿瘤发生中起重要作用。基因敲除miR-M11-5p可显著增强MDV致病性及致瘤性,表明其可能是MD肿瘤抑制因子。为进一步揭示miR-M11-5p介导的调控机制,本研究利用鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA的cDNA为模板,通过hybrid-PCR扩增miR-M11-5p的候选宿主靶基因片段,然后连接至pMD19-T载体、转化至E.coliJM109中构建cDNA文库。对文库菌落进行PCR鉴定、测序分析以及Blast序列对比,共获得77个候选宿主靶基因,其中37个miRNA结合靶点位于候选靶基因的3'-UTR中。进一步通过双荧光素酶报告试验、miR-M11-5p过表达以及RT-qPCR分析,最终鉴定鸡MAFB、LOC776816和RFX7为miR-M11-5p的宿主靶基因。本研究为进一步阐明miR-M11-5p在MDV肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病病毒 微小RNA miR-M11-5p hybrid-PCR 靶基因 实时荧光定量PCR
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禽腺病毒4型XZ株增殖与纯化方法的建立 预览
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作者 柴永笑 金前跃 +6 位作者 李旭锋 王垚 丁培阳 周稳 罗俊 郅玉宝 《动物医学进展》 北大核心 2019年第11期40-44,共5页
2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯... 2015年7月以来,禽腺病毒4型在中国的大部分地区暴发流行,并造成重大损失。为进一步对该病毒进行研究,采用两种方法对所分离的XZ株进行体外增殖培养,并利用透射电镜观察到完整的病毒粒子,同时采用超滤浓缩和凝胶层析的方法对病毒进行纯化。结果显示,成功建立了稳定的禽腺病毒4型XZ株增殖体系,以及温和、高效的病毒纯化工艺,且纯化病毒感染性强,具有很好的免疫原性。 展开更多
关键词 禽腺病毒4型 XZ株 增殖与纯化
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流感嗜血杆菌快速检测胶体金试纸的研制
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作者 陶冶 郝惠文 +4 位作者 李杰 王猛 王毅 胡征 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期901-909,共9页
以流感嗜血杆菌外膜蛋白P 6为检测标志物,利用胶体金免疫层析技术建立一种快速、灵敏、准确检测流感嗜血杆菌的方法。对P6蛋白(GenBank登录号:AGH02799)进行生物信息学分析,获取其胞外结构域中抗原表位最丰富的肽段,预测其中的线性抗原... 以流感嗜血杆菌外膜蛋白P 6为检测标志物,利用胶体金免疫层析技术建立一种快速、灵敏、准确检测流感嗜血杆菌的方法。对P6蛋白(GenBank登录号:AGH02799)进行生物信息学分析,获取其胞外结构域中抗原表位最丰富的肽段,预测其中的线性抗原表位P6Line (62–75 aa),化学合成后经免疫、抗体纯化得到线性表位抗体,同时利用重组P6蛋白制备多克隆抗体,建立基于双抗体夹心免疫层析技术的流感嗜血杆菌快速检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性和稳定性作出评价,同时对该方法进行临床模拟试验,平板培养法验证其准确性。建立的检测方法可在15 min内完成对样本的检测,检测敏感度高(1×10~5 CFU/mL)、特异性强,与其他诸如肺炎链球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体、嗜肺军团菌等常见9种的呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃保存具有良好的重复性和稳定性;200份临床样品检测结果与平板培养法的阳性符合率为90.5%。P6蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为流感嗜血杆菌检测标的物,胶体金免疫层析法具有快速、简便、灵敏的特点,适用于呼吸道感染的临床快速检测。 展开更多
关键词 流感嗜血杆菌 线性抗原表位 胶体金免疫层析法 P6蛋白
猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选 预览
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作者 王垚 金前跃 +8 位作者 周稳 李旭锋 柴永笑 丁培阳 陈晓 邢云瑞 李艳华 郭军庆 《河南农业科学》 北大核心 2019年第10期133-139,共7页
为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,... 为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株。通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定。同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定。结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3。综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 gE蛋白 毕赤酵母 单克隆抗体
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土霉素完全抗原的制备及ELISA检测方法的建立 预览
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作者 曹金博 胡骁飞 +6 位作者 王耀 李燕虹 曹夕丹 邢云瑞 孙亚宁 邓瑞广 《食品与机械》 北大核心 2019年第9期77-83,共7页
为制备土霉素(Oxytetracycline,OTC)完全抗原,获得免疫学特性良好的土霉素鼠源多抗血清并建立OTC免疫学检测方法,采用重氮化法在OTC分子上引入羧基,进而利用改进碳二亚胺法将其与载体蛋白偶联制备完全抗原,通过红外扫描、紫外扫描和凝... 为制备土霉素(Oxytetracycline,OTC)完全抗原,获得免疫学特性良好的土霉素鼠源多抗血清并建立OTC免疫学检测方法,采用重氮化法在OTC分子上引入羧基,进而利用改进碳二亚胺法将其与载体蛋白偶联制备完全抗原,通过红外扫描、紫外扫描和凝胶电泳鉴定其偶联效果,然后将完全抗原免疫BLAB/c小鼠获得多抗血清(pAb)并对其免疫学特性进行鉴定,通过优化条件建立OTC间接竞争ELISA检测方法。结果表明,偶联效果良好,免疫的4只小鼠多抗血清效价均达到1 12 800;4只小鼠多抗血清均有抑制效果,其中2号小鼠产生的多抗血清效果最佳,基于该多抗血清建立的OTC间接竞争ELISA检测方法半数抑制浓度(IC 50)为32.92 ng/mL,检测限(LOD)为1.3 ng/mL,牛奶样品中添加回收率在84.70%~87.45%,与金霉素、四环素的交叉反应率分别为5.27%,4.10%,与其他竞争物交叉反应率<0.4%。该试验成功合成了OTC完全抗原,获得了免疫学特性良好的OTC多抗血清,并建立了OTC免疫学检测方法。 展开更多
关键词 土霉素 完全抗原 多抗血清 ELISA
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PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析 预览
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作者 李闻 马思续 +6 位作者 李想通 孙杨杨 魏凤灵 许瑞勤 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期373-381,共9页
为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23... 为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于10^4拷贝·μL^-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于10^5拷贝·μL^-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1:2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1:2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1:2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1:4、1:8、1:4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10~100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 VR2332弱毒株 途径 病毒血症 中和抗体
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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用 预览
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作者 赵慧君 赵旭阳 +11 位作者 史西保 陈静 范小敏 司朝朝 王丽 李青梅 常晓博 李雪莹 付建蒙 徐雅甜 邓瑞广 《安徽农业科学》 CAS 2019年第12期115-119,131共6页
以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1mmol/LIPTG在37℃诱导表达6h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗... 以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1mmol/LIPTG在37℃诱导表达6h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Westernblot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSVBJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。 展开更多
关键词 PRRSV nsp1α 多克隆抗体
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2014—2018年猪流行性腹泻病毒N基因遗传变化分析 预览
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作者 邢广旭 焦文强 +5 位作者 刘运超 王治方 王克领 徐引弟 李海利 《山西农业科学》 2019年第10期1830-1833,1837,共5页
为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的分子流行病学情况,采用RT-PCR方法对2014—2018年采集到的河南、河北、山东、山西、甘肃、湖北、江西以及上海8省市共205份疑似PEDV阳性病料进行PEDV检测,使用RT-PCR方法扩增得到PEDV的N基因片段,回... 为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的分子流行病学情况,采用RT-PCR方法对2014—2018年采集到的河南、河北、山东、山西、甘肃、湖北、江西以及上海8省市共205份疑似PEDV阳性病料进行PEDV检测,使用RT-PCR方法扩增得到PEDV的N基因片段,回收PCR产物并与pMD20-T载体进行连接,挑选阳性克隆进行测序,分析研究PEDV遗传变异情况。结果显示,205份样品中,有191份样品为PEDV阳性,共得到19株PEDV的N基因序列,N基因全长均为1 326 bp,没有碱基的缺失和插入;将检测到的PEDV的N基因序列与国内外分离株进行比对发现,核苷酸的同源性为94.8%~99.5%,氨基酸的同源性为95.0%~99.3%。进化树分析发现,得到的19株N基因序列与CV777、CH-S等国内外毒株亲缘关系较远;其中,16株与MN、USA-Indiana-2013、USA-Iowa107-2013等近年分离株在一个分支上,为G2a亚群;CH-HENWZ-2015、CH-HENPY-2014、CH-HENZMDPY-2017这3株序列形成另一个分支,为G2b亚群。综上可知,我国PEDV流行广泛,病毒变异频繁。研究结果可为新型疫苗研发以及检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N基因 分子流行病学 序列分析
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IPMA筛选猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体方法研究 预览
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作者 杨艳艳 乔松林 +8 位作者 李睿 郭军庆 李青梅 滕蔓 王丽 赵东 李学伍 邓瑞广 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2019年第3期217-223,共7页
为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12h后用含3%H2O2的甲醇固定细胞,以... 为了得到一种能够高通量检测细胞培养物的方法,并将其用于筛选特异性强、敏感度高的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体。用每孔能感染约100个细胞的病毒量接种单层覆盖96孔板的Marc-145细胞,12h后用含3%H2O2的甲醇固定细胞,以制备免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)反应板。以100μL/孔的量将融合后继续培养10d的杂交瘤细胞的培养上清加入至IPMA反应板,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗,以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为显色底物,于倒置显微镜下进行观察。结果表明,共筛选出1D1、7G8等39份PRRSV单克隆抗体,这39份单抗能够使PRRSV中高致病毒株HN07-1和经典毒株BJ-4感染的Marc-145细胞被特异性染色,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒感染的Marc-145细胞无交叉染色。因此,构建的IPMA方法能够敏感、准确地捕捉到PRRSV单克隆抗体。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验 筛选 单克隆抗体
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H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立 预览
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作者 石建州 李青梅 +5 位作者 王彦红 刘肖 李鸽 郭军庆 邓瑞广 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2691-2698,共8页
本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个... 本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10 2.63 TCID 50/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H 2O 2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。 展开更多
关键词 H1N1亚型猪流感病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA) 单克隆抗体
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猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 预览
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作者 李鸽 刘肖 +3 位作者 李青梅 杨艳艳 王彦红 《河南农业科学》 北大核心 2019年第8期129-133,共5页
为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获... 为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10^-6、1×10^-6和1×10^-5。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Westernblot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIVNP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。 展开更多
关键词 猪流感病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验 NP蛋白 单克隆抗体
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黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及基于该抗体的黄曲霉毒素B1免疫学检测方法的建立 预览
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作者 姚静静 胡骁飞 +6 位作者 韩俊岭 徐帆 滕蔓 邢云瑞 孙亚宁 邓瑞广 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期1405-1414,共10页
为了快速准确检测粮食与饲料中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量,本试验制备了具有高灵敏度的AFB1单克隆抗体,并将其应用于AFB1间接竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)方法的建立。采用碳二亚胺(EDC)法制备AFB1完全抗原[AFB1-牛血清白蛋白(BSA)和AFB1-... 为了快速准确检测粮食与饲料中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量,本试验制备了具有高灵敏度的AFB1单克隆抗体,并将其应用于AFB1间接竞争酶联免疫吸附测定(ELISA)方法的建立。采用碳二亚胺(EDC)法制备AFB1完全抗原[AFB1-牛血清白蛋白(BSA)和AFB1-鸡卵白蛋白(OVA)],并免疫BALB/c小鼠。经细胞融合,筛选出能够分泌高灵敏度AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法,大量制备AFB1单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。基于制备的AFB1单克隆抗体,建立AFB1间接竞争ELISA检测方法。结果显示:通过筛选,获得稳定产生抗体的杂交瘤细胞株9H1F5,经间接ELISA方法测定,获得的AFB1单克隆抗体的效价高达5.12×105,亲和力常数(Ka)=6.72×107L/mol,抗体亚型为免疫球蛋白G2(IgG2)。采用间接竞争ELISA方法测得AFB1的半数抑制浓度(IC50)为0. 232 ng/mL,检测范围为0.014~1.920 ng/mL,最低检测限为0.014 ng/mL。同时,该AFB1单克隆抗体与黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)的交叉反应率分别为40.21%、33.19%、31.96%、4.40%,与其他霉菌毒素无交叉反应。由上述结果可知,本试验成功制备了灵敏度高、特异性强的AFB1单克隆抗体,并基于该抗体建立了检测AFB1的间接竞争ELISA方法,为粮食与饲料中AFB1快速免疫学检测奠定了基础。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素B1 细胞融合 单克隆抗体 ELISA
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牛IgG2 Fc受体的真核表达、纯化与结晶 预览
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作者 黄晓静 李睿 +4 位作者 马红芳 冯丽丽 乔松林 邓瑞广 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第8期1-7,共7页
【目的】制备牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)蛋白并分析其结构与生物学功能,为进一步研究其免疫学功能奠定基础。【方法】PCR扩增boFcγ2R的胞外区基因片段,将其克隆至真核表达载体pMT/BiP/V5-His A构建重组pMT/BiP-boFcγ2R-His质粒,利用果... 【目的】制备牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)蛋白并分析其结构与生物学功能,为进一步研究其免疫学功能奠定基础。【方法】PCR扩增boFcγ2R的胞外区基因片段,将其克隆至真核表达载体pMT/BiP/V5-His A构建重组pMT/BiP-boFcγ2R-His质粒,利用果蝇胚胎Drosophila Schneider 2(S2)细胞表达boFcγ2R胞外区重组蛋白,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,利用Dot-blot验证其生物学功能;采用蒸汽扩散坐滴法对目的蛋白进行结晶,对晶体进行X-ray衍射分析;利用去糖基化酶Endo Hf和PNGase F对目的蛋白进行处理,以验证其糖基化修饰与晶体无衍射之间是否存在因果关系。【结果】PCR扩增获得了663 bp的boFcγ2R基因胞外区片段。成功构建了pMT/BiP-boFcγ2R-His载体,将其转染S2细胞后诱导表达出26 ku的boFcγ2R胞外区重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白;Dot-blot结果显示,该蛋白具有较好的生物学功能。蛋白结晶的2个条件是:体积分数15%TacsimateTM(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350。蛋白初筛晶体无衍射,去糖基化试验验证了boFcγ2R胞外区蛋白初筛晶体无衍射可能与其糖基化有关的推测。【结论】得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白,获得其初筛晶体。 展开更多
关键词 牛IgG2 FC受体 蛋白表达 蛋白结晶
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猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备
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作者 夏爽飞 陈鑫鑫 +4 位作者 乔松林 柴书军 罗雪刚 谢莎 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期707-714,共8页
为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等... 为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪SOCS1 生物信息学分析 原核表达 多克隆抗体
方形螺旋超材料吸波器的设计研究 预览
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作者 王爱霞 +4 位作者 闫明宝 雷兴罡 蒋进明 王静荔 高国棉 《现代电子技术》 北大核心 2019年第16期15-17,21共4页
文中设计一种方形螺旋超材料吸波器。为了更好地理解方形螺旋的吸波机理,将方形螺旋与闭合方环结构进行比较,以期为实现高灵敏度吸波器提供理论依据。仿真结果表明:超材料表面方形螺旋为一圈时,在4.22GHz,6.80GHz处吸收率分别为98.83%和... 文中设计一种方形螺旋超材料吸波器。为了更好地理解方形螺旋的吸波机理,将方形螺旋与闭合方环结构进行比较,以期为实现高灵敏度吸波器提供理论依据。仿真结果表明:超材料表面方形螺旋为一圈时,在4.22GHz,6.80GHz处吸收率分别为98.83%和95.47%;方形螺旋为两圈时,在4.22GHz,4.38GHz和6.86GHz处吸收率分别为97.37%,84.9%和98.46%;当方形螺旋增加至三圈时,在4.22GHz,4.44GHz,5.32GHz和6.96GHz处出现了4个吸收峰值,吸收率分别为99.36%,78.2%,93.27%和94.86%。结果表明,随着螺旋间距的增大,吸收频带发生了蓝移,因此,所设计吸波器能实现更强谐振及更加简便的性能调节方式。 展开更多
关键词 吸波器 螺旋形超材料 螺旋结构 谐振 吸收率分析 仿真设计
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