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生物化学与分子生物学实验教学探讨
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作者 王睿 陈蕴 +3 位作者 蔡燕飞 惠人杰 朱瑞 金坚 《药学教育》 2018年第3期52-54,共3页
生物化学与分子生物学实验是制药工程专业重要的基础实验课程。江南大学药学院将生物化学实验与分子生物学实验合并,以验证性实验补充理解生化与分子生物学课堂教学的关键知识点,以综合性实验提高学生应用生化与分子生物学学科解决问题... 生物化学与分子生物学实验是制药工程专业重要的基础实验课程。江南大学药学院将生物化学实验与分子生物学实验合并,以验证性实验补充理解生化与分子生物学课堂教学的关键知识点,以综合性实验提高学生应用生化与分子生物学学科解决问题的能力,以设计性实验培养学生的创新能力。 展开更多
关键词 生物化学与分子生物学 验证性实验 综合性实验 设计性实验
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雌激素受体2(ESR2) mRNA 5'非翻译区内部核糖体进入位点活性的鉴定与分析
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作者 孙柳柳 黄方婷 +2 位作者 张旭燕 朱瑞 金坚 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期622-631,共10页
真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的翻译机制。雌激素受体2(estrogen receptor 2,ESR2)是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作... 真核生物除了传统的帽依赖型翻译机制外,还存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的翻译机制。雌激素受体2(estrogen receptor 2,ESR2)是雌激素受体家族成员之一,其编码的蛋白质在许多肿瘤中发挥重要的作用。ESR2蛋白的异常表达会导致众多肿瘤的发生,但其蛋白质翻译水平的调控机制至今仍不清楚。研究发现,在药物刺激的条件下,乳腺癌细胞MCF7/WT中ESR2蛋白的表达提高,但是其转录水平基本未见发生改变。猜测ESR2 mRNA5'非翻译区(5'untranslated region,5'UTR)具有IRES活性。为了验证ESR2 mRNA 5'UTR是否具有IRES元件,将ESR2 mRNA 5'UTR插入到双顺反子报告基因载体(pRF)中,构建pRL-ESR2-FL重组质粒载体,将其瞬时转染到HEK293细胞。结果发现,ESR2 mRNA 5'UTR有假定的IRES活性。并且通过3个排除实验验证了ESR2 IRES活性与其5'UTR中的内部潜在启动子(P〈0.0001)、内部剪切位点以及核糖体通读无关。进一步对其序列进行截短研究发现,ESR2 IRES活性发挥的关键区域是3'端的439~468 nt,且ESR2 IRES最大活性的发挥依赖于5'UTR序列的完整性。并且发现,ESR2 IRES活性的发挥不但需要特定的一级核酸序列,还要有稳定的二级茎环结构。此研究有望为ESR2蛋白调控的相关疾病提供新的药物治疗靶点。 展开更多
关键词 雌激素受体2 5'非翻译区 内部核糖体进入位点
利用核磁共振技术检测植物细胞凋亡 预览 被引量:2
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作者 张贵友 朱瑞 +2 位作者 徐烨 闫永彬 戴尧仁 《植物学报:英文版》 CSCD 2004年第6期 711-718,共8页
在细胞凋亡的研究中,通常以检测细胞核和细胞器的形态改变或生物化学特性变化为指标进行分析。已有的实验表明:动物细胞在凋亡过程中,细胞膜的脂质双分子层发生了一系列生物物理和生物化学改变,如膜电位的改变、磷脂酰丝氨酸由细胞... 在细胞凋亡的研究中,通常以检测细胞核和细胞器的形态改变或生物化学特性变化为指标进行分析。已有的实验表明:动物细胞在凋亡过程中,细胞膜的脂质双分子层发生了一系列生物物理和生物化学改变,如膜电位的改变、磷脂酰丝氨酸由细胞膜内侧向外翻转、细胞膜微粘度的改变等,这些变化会导致细胞中亚甲基信号强度的增加。我们利用质子核磁共振光谱分析(1H-NMR)方法,首次发现用物理和化学方法诱导的烟草(Nicotiana tabacuum L.cv.BY-2)和胡萝卜(Daucus carota L.)细胞在凋亡过程中伴随有亚甲基信号强度的明显增加。在用烟酰胺处理的烟草细胞中,亚甲基信号强度的增加与DNA Ladder几乎同时出现,随诱导时间的延长,亚甲基信号强度也逐渐增大,在24h亚甲基信号强度增加约2倍。而这种特征在坏死的细胞中并不存在。说明亚甲基信号强度的增加是动、植物细胞凋亡过程中所具有的共同特征,1H-NMR技术提供了一种精确可靠的分析植物细胞凋亡的手段,同时由于它所具有的非侵害性的特点,可能在揭示细胞凋亡机制的研究中具有一定的意义。 展开更多
关键词 细胞凋亡 植物细胞 质子核磁共振(1H-NMR) 膜脂
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转录激活因子1(ATF1)内部核糖体进入位点的鉴定及活性分析 被引量:2
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作者 李琪 高文青 +1 位作者 朱瑞 金坚 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期937-943,共7页
蛋白质翻译起始通常有两种机制,一是依赖帽结构的翻译,另一种是依赖5'非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES).在后一种方式中,在某些IRES反式作用因子,如La蛋白、多聚嘧啶串结合蛋白1等的参与下,直接招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始... 蛋白质翻译起始通常有两种机制,一是依赖帽结构的翻译,另一种是依赖5'非翻译区的内部核糖体进入位点(IRES).在后一种方式中,在某些IRES反式作用因子,如La蛋白、多聚嘧啶串结合蛋白1等的参与下,直接招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点,启始翻译.研究发现,参与细胞生长、分化、细胞周期进程、凋亡和压力调控的相关蛋白中通常含有IRES元件.基于功能,我们提出假说:转录激活因子1(ATF1)的5'-UTR可能具有IRES活性.为验证假说,首先构建了含全长ATF1 5'-UTR的双荧光素酶报告质粒;质粒转染结合报告酶活性分析显示,ATF1 5'-UTR在Bel7402、HCT-8和HEK293细胞中表现出不同的IRES活性;而此IRES活性与5'-UTR中的隐藏启动子无关.同时还发现,ATF1 5'-UTR在NIH3T3细胞中却没有IRES活性.与此结果相一致,Western印迹检测ATF1在这几种细胞系中的表达.结果显示,Bel7402、HCT-8和HEK293中ATF1蛋白质表达水平较高,而在NIH3T3中却极低.ATF1 5'-UTR的系列5'-删除突变及报告酶分析证明,ATF1 5'-UTR的完整性对其IRES活性大小发挥重要作用;其中5'端的204 bp序列对其IRES活性贡献较大.RNA-蛋白免疫共沉淀实验揭示,ATF1 5'-UTR可与La和PTBP1蛋白结合;抑制La和PTBP1蛋白质的表达,并可减低HEK293细胞中ATF1蛋白质表达水平.这些结果提示,La和PTBP1蛋白(两种ITAFs)为ATF1 5'-UTR发挥IRES活性所必需.总之,上述结果证明,ATF1 5'-UTR具有IRES活性,其活性发挥依赖与La和PTBP1蛋白的结合.上述发现为进一步研究La和PTBP1表达及亚细胞定位对ATF1 IRES调控机制的影响奠定了基础. 展开更多
关键词 转录激活因子1(ATF1) 5'-非编码区(5'-UTR) 内部核糖体进入位点(IRES) IRES反式作用因子(ITAFs)
双缺陷型毕赤酵母X33突变株的诱变育种 预览 被引量:2
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作者 顾鹏飞 李萌 +1 位作者 朱瑞 金坚 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期129-135,共7页
为促进Pichia pastoris X33α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1p)与α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3p)双突变菌株(och1 alg3 m X33)作为蛋白质表达宿主菌的应用,为双突变菌株进一步糖基化的研究奠定基础。作者通过紫外诱变和常压室温等离子体(A... 为促进Pichia pastoris X33α-1,6-甘露糖转移酶(OCH1p)与α-1,3-甘露糖转移酶(ALG3p)双突变菌株(och1 alg3 m X33)作为蛋白质表达宿主菌的应用,为双突变菌株进一步糖基化的研究奠定基础。作者通过紫外诱变和常压室温等离子体(ARTP)诱变的方法来提高双突变菌株的生长速度以及适应能力。经过4轮筛选发现了生长速度提高15%、温度敏感性有所降低、细胞存活率有所提高的双突变菌株。 展开更多
关键词 糖基化 诱变 生长表型 甘露糖转移酶
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重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化 被引量:1
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作者 戴惠云 朱瑞 +3 位作者 雷楗勇 侯颖 陈蕴 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第7期966-968,973共4页
目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF... 目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子165b 毕赤酵母 表达 纯化
内部核糖体进入位点(IRES)调控多种癌细胞系中尾型同源盒转录因子2的翻译
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作者 高文青 李琪 +2 位作者 陈蕴 朱瑞 金坚 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期260-268,共9页
尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untran... 尾型同源盒转录因子2(caudal type homeobox transcription factor 2,CDX2)促进肠癌细胞增殖,并具有致瘤的潜能。然而,对于CDX2翻译水平的调控机制研究甚少。本研究基于转染及报告酶活性分析结果,首次证明CDX2 5'非翻译区(5'untranslated region,5'-UTR)存在内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),并通过IRES在HEK293细胞以及肝癌、肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞株中介导翻译起始。IRES介导的翻译机制与经典的帽依赖翻译途径(cap-dependent translation)不同,在一些IRES反式作用因子(IRES trans-acting factors,ITAFs)的作用下,不需要帽状结构,IRES可以直接招募核糖体小亚基,起始翻译。同时,肿瘤细胞内IRES介导的翻译方式可能是引起蛋白质异常表达的原因之一。通过Western印迹检测CDX2在4种肿瘤细胞系中的表达,发现CDX2的IRES活性与其在肿瘤细胞中蛋白质表达量正相关,其活性在耐药型卵巢肿瘤细胞株中最高。此外,CDX2 IRES元件的5'端截短及报告酶活性分析证明,CDX2 5'-UTR的活性中心位于68-147碱基之间,而位于5'末端的67个碱基形成一个远端茎环,抑制全长IRES的活性。定点突变68-147活性区域的实验结果揭示,3个茎环结构域(68GCCGGC73,88GCCAG92和114CUCUG118)是IRES元件中不可或缺的部分。上述结果证明,CDX2 5'-UTR具有IRES活性,其活性依赖于二级茎环结构。因此,可以针对特殊的茎环结构域进行研究,使之成为肿瘤药物作用靶点。 展开更多
关键词 尾型同源盒转录因子2 5'非编码区 内部核糖体进入位点
耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM钙稳态失调及其机制研究 预览 被引量:1
8
作者 蔡燕飞 陈蕴 +3 位作者 朱瑞 马鑫 姚晓强 金坚 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期863-867,共5页
目的探讨耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM钙稳态失调及其机制。方法转染指示钙离子质粒GEC01.2,检测野生型和耐药型细胞中的[Ca2+]含量;通过Westernblot检测瞬时受体电位离子通道(transientreceptorpotentialchannel)蛋白TRPCI、T... 目的探讨耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM钙稳态失调及其机制。方法转染指示钙离子质粒GEC01.2,检测野生型和耐药型细胞中的[Ca2+]含量;通过Westernblot检测瞬时受体电位离子通道(transientreceptorpotentialchannel)蛋白TRPCI、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC6在两种细胞中的表达情况;运用钙离子通道抑制剂2-APB(100μmol·L-1)抑制耐药细胞中高表达的TRPC5活性后,检测耐药细胞中的[Ca2+]含量。结果耐药细胞中的[Ca2+]含量明显上调,并检测到TRPC5蛋白在耐药细胞中发生高表达,其活性被抑制后,耐药细胞中的[Ca2+]浓度发生下调。结论与野生型细胞相比,耐药细胞中钙稳态失调,其原因可能是由于耐药细胞中TRPC5表达上调引起耐药细胞中[Ca2+]内流所致。提示钙稳态失调与肿瘤细胞的耐药发生有着密切关系。 展开更多
关键词 耐药 钙稳态 TRPC5 P-GP 肿瘤 乳腺癌
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生物制药专业课程中的药物化学教学的探讨 预览 被引量:2
9
作者 朱瑞 张家骊 金坚 《广州化工》 CAS 2009年第7期 213-214,共2页
结合作者的自身教学实践,阐述了作为生物制药专业的药物化学的教学应该有其专业个性化的特点。在教学重点上应强调基本应用型知识的掌握;教学的过程中应重视生物学知识的实践;在实验课程上着重培养学生的数据的记录和分析能力;在课... 结合作者的自身教学实践,阐述了作为生物制药专业的药物化学的教学应该有其专业个性化的特点。在教学重点上应强调基本应用型知识的掌握;教学的过程中应重视生物学知识的实践;在实验课程上着重培养学生的数据的记录和分析能力;在课程知识之外还应着重培养学生的信息搜集能力。另外跟据学生未来发展倾向对个性化的考试进行了初步探讨。 展开更多
关键词 药物化学 生物制药专业
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毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF 被引量:2
10
作者 张大成 许永利 +2 位作者 辛鑫 朱瑞 金坚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期622-629,共8页
【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖... 【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统。【方法】采用双交换同源重组敲除目的基因的方法,首先敲除毕赤酵母X-33的URA3基因,获得一个尿嘧啶营养缺陷型的X-33(ura3-)菌株;然后用URA3基因作为选择标记,敲除X-33(ura3-)的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得OCH1基因敲除的X-33(och1-)菌株。用X-33(och1-)菌表达糖蛋白GM-CSF,分析GM-CSF蛋白糖链的变化。【结果】首次成功敲除了X-33的URA3和OCH1基因,与野生型相比,X-33(och1-)菌表达的GM-CSF蛋白过度糖基化修饰程度明显降低。【结论】X-33(och1-)菌株的构建提供了一个对蛋白低N-糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,也为进一步的糖基化改造提供了良好的基础。 展开更多
关键词 N-糖基化 毕赤酵母X-33 基因敲除 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
毕赤酵母X-33糖基化突变菌株的生理特性 被引量:2
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作者 许永利 张大成 +2 位作者 朱瑞 陈蕴 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2011年第4期439-442,共4页
目的研究毕赤酵母X-33野生型菌株(wX-33)和X-33α-1,6甘露糖基转移酶(Och1p)突变株(och1 mX-33)的生理特性,为och1mX-33株进一步糖基化的研究奠定基础。方法绘制wX-33和och1 mX-33菌株的生长曲线,进行温度敏感性及刚果红敏感性试... 目的研究毕赤酵母X-33野生型菌株(wX-33)和X-33α-1,6甘露糖基转移酶(Och1p)突变株(och1 mX-33)的生理特性,为och1mX-33株进一步糖基化的研究奠定基础。方法绘制wX-33和och1 mX-33菌株的生长曲线,进行温度敏感性及刚果红敏感性试验,美蓝染色观察其形态变化,并检测细胞的存活率。结果与wX-33株比较,och1 mX-33株生长缓慢,生物量减少;对温度、刚果红敏感性增强;存在细胞壁分裂缺陷;在不适温度下,细胞存活率降低。结论糖基化突变可影响毕赤酵母X-33对温度、刚果红的敏感性,使其细胞壁层甘露糖含量降低,并可使och1 mX-33株的生理特性发生很大变化。 展开更多
关键词 毕赤酵母X-33 och1突变 糖基化 生长表型
人乳腺癌细胞及其耐药细胞转录因子表达的差异 预览 被引量:2
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作者 陈淑娴 朱瑞 +1 位作者 付强 金坚 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期1257-1262,共6页
目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧... 目的研究阿霉素在不同药敏性肿瘤细胞中转录因子水平的差异,为肿瘤细胞多药耐药机制的研究提供参考。方法通过细胞活力检测野生型乳腺癌细胞(MCF7/W)和对阿霉素耐药的乳腺癌细胞(MCF7/ADM)的药敏性差异;荧光显微镜镜检阿霉素荧光分布;有机溶剂萃取法进行全细胞阿霉素吸收分析;细胞膜和核膜分离检测阿霉素的亚细胞定位;通过转录因子膜分析MCF7/W和MCF7/ADM细胞中转录因子表达差异。结果两株细胞的耐药IC50相差近10000倍左右;利用镜检和定量分析,发现阿霉素在MCF7/W细胞中主要定位于胞核,而在MCFT/ADM细胞中则蓄积较少且主要定位于胞质;转录因子差异分析发现膜上总345个转录因子中,与野生型细胞相比,耐药细胞的106个转录因子表达上调,32个表达下调。结论阿霉素在耐药细胞与野生型细胞中转录因子表达的差异,可能是干扰阿霉素入核,阻止其功能发挥的基础。 展开更多
关键词 MCF-7/ADM 阿霉素 IC50 转录因子 耐药细胞 亚细胞定位
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浅谈大学生创新团队中综合素质培养 预览 被引量:2
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作者 邱丽颖 高越颖 +4 位作者 金坚 许正宏 朱瑞 李英 陈蕴 《广州化工》 CAS 2012年第11期 201-202,233,共3页
传统的高校教育造成大学生缺乏创新精神,现代高等教育要求知识型向素质型转化,着重培养学生的学习能力、动手能力和综合解决问题的能力。创新团队是实现这一目的较为有效的形式。通过创新团队,不仅提高学生创新素质,还提高了学生终... 传统的高校教育造成大学生缺乏创新精神,现代高等教育要求知识型向素质型转化,着重培养学生的学习能力、动手能力和综合解决问题的能力。创新团队是实现这一目的较为有效的形式。通过创新团队,不仅提高学生创新素质,还提高了学生终身学习素质、团结协作素质、吃苦耐劳素质和科研道德素质。 展开更多
关键词 大学生 创新团队 综合素质
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脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点活性的研究 被引量:2
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作者 蔡燕飞 朱瑞 +1 位作者 陈蕴 金坚 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期12-17,共6页
脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)已被广泛运用于蛋白的表达中,如应用于Clontech公司推出的pIRES2质粒对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。但是由于对... 脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site,IRES)已被广泛运用于蛋白的表达中,如应用于Clontech公司推出的pIRES2质粒对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。但是由于对EMCV的IRES了解还不够深入而在利用EMCV的IRES进行基因表达过程中经常会遇到问题,很有必要对其进行更深入的研究。以红绿色荧光蛋白基因作为报告基因,通过分子克隆、荧光显微镜、荧光分光光度计、Western blot等分子细胞生物学手段,对EMCV的IRES末端序列与其活性的关系进行了深入研究。研究发现EMCV的IRES末端序列对其IRES的活性影响极大,而人们常用的报告基因EGFP本身也可能存在IRES。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 内部核糖体进入位点 增强型绿色荧光蛋白
制药工程专业大学生创新教育的研究与实践 预览 被引量:2
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作者 陈蕴 金坚 +1 位作者 李英 朱瑞 《广州化工》 CAS 2009年第6期 207-208,共2页
在探索培养本科生创新能力的教学研究实践中,我们通过扩大教学内涵,鼓励学生参加在研科研项目,形成以科研项目为平台的个性化教育。在实验教学中,推进实验课程体系改革及实验内容的整合和优化,加大综合性、设计性、创新性实验比例... 在探索培养本科生创新能力的教学研究实践中,我们通过扩大教学内涵,鼓励学生参加在研科研项目,形成以科研项目为平台的个性化教育。在实验教学中,推进实验课程体系改革及实验内容的整合和优化,加大综合性、设计性、创新性实验比例。不断引入科研成果,更新教学内容,促进教学内容现代化。 展开更多
关键词 制药工程 大学生 创新教育
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内部核糖体进入位点(IRES)调控细胞血清饥饿应激条件下PRDM13的翻译
16
作者 马文囡 丁鹏鹏 +3 位作者 陶义芬 陈蕴 朱瑞 金坚 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期396-403,共8页
PRDM13是锌指蛋白转录抑制因子(positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM)家族中的一员,其在细胞分化、肿瘤的发生和恶性转化中起着重要的作用。而对于PRDM13基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosome... PRDM13是锌指蛋白转录抑制因子(positive regulatory domain zinc finger protein,PRDM)家族中的一员,其在细胞分化、肿瘤的发生和恶性转化中起着重要的作用。而对于PRDM13基因侧翼序列是否含有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)及其功能所知甚少。本研究对PRDM13 5'端的非翻译区(5'UTR)进行IRES结构与功能分析,探索其在细胞血清饥饿应激条件下对PRDM13翻译的影响。实验发现,在血清饥饿的条件下,肝癌细胞Bel7402/WT中PRDM13的蛋白质水平增加,但是其mRNA水平基本没有变化。将PRDM13 5'UTR的序列插入双顺反子的报告载体(pRL-FL)中,并且将构建的载体(pRL-PRDM13-FL)转染进细胞中,结果显示,PRDM13 5'UTR含有IRES,且发现PRDM13 5'UTR中的105 nt(53~157)对其IRES的功能至关重要。在帽依赖的翻译(cap-dependent translation)机制被抑制时,IRES这种机制可有效维持PRDM13蛋白合成。本研究提供了在细胞压力条件下调节PRDM13蛋白合成的一种新的解释。 展开更多
关键词 锌指蛋白转录抑制因子 内部核糖体进入位点 翻译 细胞压力
锌指蛋白转录抑制因子145′非翻译区内部核糖体进入位点的活性
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作者 丁鹏鹏 马文囡 +2 位作者 朱瑞 陈蕴 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第1期23-27,30共6页
目的 检测锌指蛋白转录抑制因子14(positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14)5忆非翻译区(5忆untranslated region,5忆UTR)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的活性。方法 PCR扩增PRDM14 ... 目的 检测锌指蛋白转录抑制因子14(positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14)5忆非翻译区(5忆untranslated region,5忆UTR)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的活性。方法 PCR扩增PRDM14 5忆UTR各截短序列的基因及全长基因,分别插入至双荧光素酶和红绿荧光报告基因中,构建重组质粒p RL-PRDM14 S1-FL、p RL-PRDM14 S2-FL、p RL-PRDM14 S3-FL及p G-PRDM 14-R。将各重组质粒分别转染HEK293细胞,检测PRDM14 5忆UTR IRES元件的活性、内部剪切位点和自身启动子的活性及影响IRES活性的序列。将重组质粒p RL-FL/5忆UTR分别转染HCT-8/WT、Hep-2、Bel7402/WT和NIH3T3细胞,检测各细胞中PRDM14 5忆UTR IRES元件的活性。结果 PRDM14 5忆UTR具有内部核糖体进入位点元件活性;不具有内部剪切位点和自身启动子活性;PRDM14 5忆UTR的活性激活中心位于25~60 nt,活性抑制中心位于60~95 nt;除NIH3T3细胞外,其他细胞均具有IRES活性。结论 PRDM14 5忆UTR具有典型的IRES活性,为今后深入研究PRDM14表达的调控机制奠定了基础。 展开更多
关键词 锌指蛋白转录抑制因子14 内部核糖体进入位点 萤火虫荧光素酶 海肾荧光素酶
双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达
18
作者 高明珠 朱瑞 +1 位作者 陈蕴 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第9期1130-1134,共5页
目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点... 目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。 展开更多
关键词 启动子 基因 报告 真核细胞 基因表达
循环包装回收技术在筛选肝癌细胞相关耐药基因中的应用
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作者 戴文燕 朱瑞 金坚 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期204-211,共8页
肝癌先天性多表达多药耐药基因,严重影响肝癌的化疗效果,筛选肝癌细胞中的耐药基因,研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果,提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库,感染成纤维细胞,使得逆转录病毒基因整合进细胞,加... 肝癌先天性多表达多药耐药基因,严重影响肝癌的化疗效果,筛选肝癌细胞中的耐药基因,研究其耐药机制有助于提高肝癌化疗效果,提高肝癌的治愈率。首先构建肝癌细胞逆转录病毒的cDNA文库,感染成纤维细胞,使得逆转录病毒基因整合进细胞,加药筛选,存活细胞中的基因再次包装成病毒,用于下一轮筛选。采用循环包装回收(Cyclical packaging rescue,CPR)技术进行肝癌细胞耐药基因的筛选即是通过病毒包装将基因从细胞中钓取出来,相比于常规筛选方法,仅通过一轮筛选可能会出现很多假阳性基因,采用CPR技术则是通过多轮筛选,很大程度减少了假阳性细胞的出现。通过该方法经过四轮筛选获得核糖体蛋白S11(RPS11)、核糖体蛋白L6(RPL6)、核糖体蛋白L11(RPL11)、核糖体蛋白L24(RPL24)等几种基因,经初步检测,增加了细胞的耐药性。 展开更多
关键词 循环包装回收技术 肝癌 CDNA文库 耐药基因
Induction of Apoptosis in Purified Nuclei from Tobacco-Suspension Cells by Cytochrome b6/f Complex
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作者 张贵友 李萍 +2 位作者 朱瑞 田瑞华 戴尧仁 《清华大学学报:自然科学英文版》 EI CAS 2004年第4期391-396,共6页
An apoptotic cell-free system containing cytosol and nuclei from normally cultured tobacco suspension cells was used to show that a spinach chloroplast preparation can induce apoptosis in nuclei, evidenced by DNA elec... An apoptotic cell-free system containing cytosol and nuclei from normally cultured tobacco suspension cells was used to show that a spinach chloroplast preparation can induce apoptosis in nuclei, evidenced by DNA electrophoresis and fluorescence microscopy observations, Further study showed that the chloroplast preparation or its pellet (thylakoid membrane) after hypoosmotic or supersonic treatment still exhibited the apoptosis-inducing activity, but the supernatant had no effect, which indicates that the apoptosisinducing effector in the chloroplast preparation is water-insoluble. The induction of apoptosis by chloroplast preparation could be attenuated by Ac-DEVD-CHO, the specific inhibitor of Caspase-3, implying involvement of a Caspase-3-1ike protease during the process. Furthermore, extensive apoptosis in nuclei was induced by cytochrome b6/f on the thylakoid membrane, indicating that this important cytochrome complex may have an important role in the chloroplast-related apoptotic pathway. 展开更多
关键词 细胞凋亡 叶绿体 细胞溶质 类囊体膜 细胞色素 b6/f复合物 烟草悬浮细胞
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