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口蹄疫病毒衣壳蛋白氨基酸突变对病毒热稳定性的影响 预览
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作者 高雅 李平 +7 位作者 马雪青 寻广谨 白兴文 孙普 袁红 卢曾军 刘在新 李冬 《动物医学进展》 北大核心 2019年第7期1-8,共8页
口蹄疫是世界范围内广泛流行的一种偶蹄动物的烈性传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV),它对热比较敏感,当温度高于30℃时,病毒衣壳容易解离为五聚体亚单位而影响疫苗的免疫保护效果。因此,改善病毒的热稳定性,制备热稳定优良的口蹄疫疫苗... 口蹄疫是世界范围内广泛流行的一种偶蹄动物的烈性传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV),它对热比较敏感,当温度高于30℃时,病毒衣壳容易解离为五聚体亚单位而影响疫苗的免疫保护效果。因此,改善病毒的热稳定性,制备热稳定优良的口蹄疫疫苗具有重大的应用价值。在实验室建立的口蹄疫病毒型内嵌和全长感染性克隆的基础上,在结构蛋白引入1个或2个氨基酸突变,分别构建了2种基因修饰的口蹄疫病毒全长重组质粒。全长质粒经NotⅠ线化后分别转染表达T7RNA聚合酶的BSR/T7细胞以拯救重组病毒。间接免疫荧光和电镜分析表明,成功拯救到2株口蹄疫重组病毒。重组病毒经RT-PCR和序列测定证实只有1株重组病毒所含的耐热突变可以稳定遗传。热失活试验显示,拯救病毒与亲本病毒的耐热特性基本一致。结果表明在结构蛋白上引入V2090A-S2093F-H30568R的突变,并对口蹄疫病毒的热稳定性并没有明显的影响,为未来发展热稳定的口蹄疫疫苗提供了一定的参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 热稳定性 疫苗
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VP3 G-H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响
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作者 陈冬冬 白兴文 +12 位作者 宫晓华 包慧芳 李平 李冬 付元芳 白启峰 袁红 孙普 马雪青 曹轶梅 陈应理 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1285-1294,共10页
【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP3 G-H环 定点突变体 生物学特性 内吞作用
猪波形蛋白的原核表达及其对口蹄疫病毒浸染PK-15细胞的作用 预览
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作者 令瑛 马雪青 +7 位作者 李平 张婧 李坤 付元芳 冯若飞 马忠仁 卢曾军 刘在新 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期12-19,共8页
为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行... 为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪波形蛋白 原核表达 口蹄疫病毒 PK-15细胞
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两株PRRSV NSP2不同位置缺失基因工程病毒的生物学特性分析
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作者 谯雨 王治家 +9 位作者 张婧 孙普 白兴文 李坤 包慧芳 曹轶梅 李平 李冬 刘在新 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1073-1081,共9页
为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2高变区对病毒复制及相关细胞因子表达水平的影响,以PRRSV GSWW/2015强毒株感染性分子克隆为基础,在前期缺失NSP2第519~565位47个氨基酸的D5毒株的基础上,进一步缺失了NSP2第628~747位120个氨... 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2高变区对病毒复制及相关细胞因子表达水平的影响,以PRRSV GSWW/2015强毒株感染性分子克隆为基础,在前期缺失NSP2第519~565位47个氨基酸的D5毒株的基础上,进一步缺失了NSP2第628~747位120个氨基酸(D14),并比较分析了缺失毒株与亲本病毒GSWW的复制能力。结果显示,D14缺失病毒相对于D5缺失毒与亲本病毒GSWW/2015的复制水平有所降低,但三者之间无显著差异。将亲本病毒、D5与D14缺失毒株分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),于不同时间点检测了炎性细胞因子m RNA的表达水平。结果表明,在感染PAM后第24小时,相对于D14缺失病毒与亲本毒,D5缺失毒诱导IL-6、TNF-α、IL-8和IL-1βm RNA表达水平显著上升;D5与D14缺失毒在感染PAM细胞后第12小时,诱导IL-10、HMGB1水平显著降低,D14的降低幅度更显著。提示D5缺失区有促进早期炎性应答的作用,D5与D14缺失均可以明显降低IL-10抑制性细胞因子的表达水平。说明NSP2在调节炎性应答与免疫抑制方面具有重要的作用。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 感染性分子克隆 非结构蛋白2 生物学特性 细胞因子
口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定
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作者 王省 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 李冬 包慧芳 李平 孙普 白兴文 陈应理 付元芳 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期939-946,共8页
为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区... 为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单个B细胞抗体技术 单克隆工程抗体 衣壳蛋白VP2
3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建
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作者 李平 马雪青 +5 位作者 袁红 袁子文 孙普 白兴文 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期907-915,共9页
【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构... 【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。 展开更多
关键词 3A蛋白 104-115位氨基酸缺失 口蹄疫A型 标记病毒 构建
口蹄疫O型重组病毒的构建及其生物学特性分析 预览
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作者 龚婷 李平 +6 位作者 孙普 马雪青 白兴文 杨孝朴 卢曾军 曾巧英 刘在新 《动物医学进展》 北大核心 2019年第11期18-23,共6页
传统灭活疫苗的免疫接种是预防和控制口蹄疫的重要手段,但口蹄疫病毒极易发生变异而常导致新突变株的产生,从而使现有疫苗不能有效防控当前流行的口蹄疫,经常需要筛选与当前流行毒株抗原匹配性好、免疫原性和复制特性优良的疫苗候选毒... 传统灭活疫苗的免疫接种是预防和控制口蹄疫的重要手段,但口蹄疫病毒极易发生变异而常导致新突变株的产生,从而使现有疫苗不能有效防控当前流行的口蹄疫,经常需要筛选与当前流行毒株抗原匹配性好、免疫原性和复制特性优良的疫苗候选毒株。在比对分析Cathay和Pan-Asia谱系不同时间经典疫苗毒株和我国当前主要流行毒株(SEA-Mya98谱系)VP1结构蛋白的基础上,借助反向遗传操作技术,在已构建含当前流行毒株VP1基因全长感染性克隆的骨架上,引入2个氨基酸的替换(VP1 H28Q+S47Q),构建重组全长质粒,并通过转染表达T7RNA聚合酶的BSR/T7细胞成功拯救到活的重组病毒。重组病毒具有和亲本病毒相似的噬斑表型和一步生长曲线,却降低热稳定性,增强了对乳鼠的致病力。研究结果为进一步开发与当前流行毒株抗原匹配性好、免疫原性和复制特性优良的FMD疫苗候选毒株奠定了基础。 展开更多
关键词 O型口蹄疫 突变 重组病毒 生物学特性
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房地产土地增值税清算执行中的问题及对策解析
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作者 李平 《时代金融》 2019年第8期133-134,共2页
房地产行业的繁荣发展,拉动了我国经济的增长,已经成为第三产业中不可或缺的重要组成部分。土地与资金是房地产发展中始终无法回避的两个关键问题,尤其是对于土地增值税的清算执行,不仅关系到企业的长远发展,也是保障房地产企业依法纳... 房地产行业的繁荣发展,拉动了我国经济的增长,已经成为第三产业中不可或缺的重要组成部分。土地与资金是房地产发展中始终无法回避的两个关键问题,尤其是对于土地增值税的清算执行,不仅关系到企业的长远发展,也是保障房地产企业依法纳税的重要工作。但是,由于多种因素的限制,导致房地产土地增值税清算执行中依旧存在诸多问题,不利于国家对房地产行业进行规范和约束。本文将针对当前房地产土地增值税清算执行中的问题进行深入分析,探索土地增值税清算执行中问题的解决对策。 展开更多
关键词 房地产 土地增值税 清算执行 问题 对策
会计核算在房地产企业存在的问题与应对措施 被引量:1
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作者 李平 《时代金融》 2019年第6期195-196,共2页
房地产行业会计核算与其他行业的会计核算相比较,有其特殊性,房地产项目开发周期长,开发流程复杂,投资成本较高,涉及税金种类多,并且税负率非常高,就此,本文就房地产业会计核算存在的问题及应对措施进行探讨,以较少的成本消耗获取最大... 房地产行业会计核算与其他行业的会计核算相比较,有其特殊性,房地产项目开发周期长,开发流程复杂,投资成本较高,涉及税金种类多,并且税负率非常高,就此,本文就房地产业会计核算存在的问题及应对措施进行探讨,以较少的成本消耗获取最大化利润,全面提高房地产企业的经济效益。 展开更多
关键词 房地产 会计核算 最大化利润 经济效益
LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响 被引量:1
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作者 甘利鹏 张婧 +10 位作者 孙普 白伟杰 王治家 曹轶梅 李坤 白兴文 包慧芳 李平 李冬 刘在新 卢曾军 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期537-544,共8页
应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_0017904... 应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。 展开更多
关键词 PRRSV LncRNA TCONS00179042 MARC-145细胞 过表达 复制
口蹄疫病毒反向遗传操作技术体系建立及应用
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作者 刘在新 李平 +3 位作者 白兴文 孙普 卢曾军 包慧芳 《中国科技成果》 2018年第21期40-42,共3页
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种烈性传染病。该病是OIE法定必报的动物传染病之一,我国也将其列为一类动物疫病。长期以来,口蹄疫在世界范围内广泛流行,危害巨大。有效防控该病需要厘... 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种烈性传染病。该病是OIE法定必报的动物传染病之一,我国也将其列为一类动物疫病。长期以来,口蹄疫在世界范围内广泛流行,危害巨大。有效防控该病需要厘清病原的特性,研发适合对路的疫苗。本研究历经16年,在国内率先建立了口蹄疫病毒反向遗传操作技术体系,通过对我国历史代表株和当前流行株的致病性、基因功能、遗传表型变异的分子基础等研究,创制了国际首例口蹄疫标记疫苗,契合国家推进口蹄疫免疫无疫区建设之急需,将为我国口蹄疫的净化提供不可或缺的技术支撑。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 反向遗传学 病原特性 标记疲苗
猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建
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作者 魏国燕 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 孙普 白兴文 李冬 陈应理 包慧芳 李平 付元芳 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期177-182,共6页
为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+)... 为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×10 7,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。 展开更多
关键词 猪CLEC8A基因 骆驼单域抗体 酵母展示文库 流式细胞术
口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力
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作者 李平 马雪青 +5 位作者 寻广谨 白兴文 孙普 袁红 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期659-666,共8页
【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3F... 【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 结构蛋白 外源标签
针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析
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作者 寻广谨 李平 +10 位作者 孙普 马雪青 白兴文 卢曾军 陈应理 包慧芳 李冬 曹轶梅 付元芳 张婧 刘在新 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期988-992,共5页
针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子... 针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 P1基因 构建 生物学特性分析
一株A型口蹄疫流行毒株全序列的测定及其全长感染性克隆的构建 被引量:3
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作者 袁子文 李平 +6 位作者 孙普 白兴文 袁红 马雪青 卢曾军 刘在新 魏彦明 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期2019-2027,共9页
【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与... 【目的】测定一株A型口蹄疫流行毒株的全基因组序列,并构建其全长感染性克隆。【方法】参照已公布的A型口蹄疫病毒序列设计引物,将分离的口蹄疫病毒株A/Sea-97/CHA/2014全基因组分为4个重叠的片段进行RT-PCR扩增,并对其进行序列测定与分析。利用酶切连接法将4个基因片段依次克隆至p Blue Script SKhdv载体中,构建该流行毒株的全长c DNA克隆p QAHN。pQAHN经NotⅠ线性化后转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞,拯救病毒。【结果】口蹄疫病毒全基因组序列测定结果表明该毒株基因组全长8 171 bp[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],开放阅读框为6 996 bp,编码2 332个氨基酸,5′和3′非编码区分别为1 091 bp和95 bp。VP1系统发生树分析表明该毒株与A/GDMM/CHA/2013毒株亲缘关系最近,相似性为99.1%。线化全长质粒转染BSR/T7细胞68 h后可观察到典型的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明成功拯救出了具有感染性的FMDV。拯救病毒与亲本病毒的噬斑表型及生长曲线试验表明二者具有相似的生长表型和增殖能力。【结论】该研究为我国口蹄疫病原生态分布、分子流行病学调查以及A型FMD新型疫苗的研究提供了有益的材料。 展开更多
关键词 A型口蹄疫病毒 全序列测定 全长感染性克隆
表达FMDVB7多表位基因的重组PRRSV的拯救与复制水平的测定
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作者 白伟杰 曹轶梅 +10 位作者 包慧芳 孙普 付元芳 李平 白兴文 陈应理 李坤 马雪青 刘在新 李冬 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期449-453,共5页
利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP... 利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP基因正确表达。随后,采用相同的策略构建了表达口蹄疫病毒(FMDV)B7多表位基因的重组PRRSV(v Fl12-B7),拯救病毒v Fl12-B7感染Marc-145细胞后,可观察到典型的CPE;对拯救病毒进行RT-PCR扩增和序列测定,表明多表位基因正确插入;荧光定量PCR检测,第1代和第4代拯救病毒的拷贝数分别为3.76×10^5 copies/L与1.58×10^8 copies/L,说明重组病毒具有较好的复制能力,为以PRRSV为载体表达口蹄疫多表位基因活载体疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PRRSV 感染性克隆 FMDV B细胞表位 病毒载体疫苗
表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建
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作者 袁红 李平 +12 位作者 袁子文 白兴文 孙普 马雪青 李坤 寻广谨 卢曾军 包慧芳 陈应理 曹轶梅 付元芳 张婧 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1746-1752,共7页
【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制... 【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 EGFP 口蹄疫病毒 复制子
O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定 预览 被引量:2
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作者 袁红 李平 +11 位作者 马雪青 方先珍 白兴文 孙普 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 李冬 付元芳 陈应理 张婧 刘在新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期96-100,共5页
为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/9... 为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A91-105中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A91-105-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 型间嵌合 标记病毒
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嵌合O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性
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作者 姜韶东 李平 +9 位作者 孙普 马雪青 白兴文 包慧芳 卢曾军 曹轶梅 付元芳 李冬 陈应理 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2396-2406,共11页
【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯... 【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯救得到两株基因3-程嵌合病毒rGDexc、rGZexc;进而从病毒复制和病毒对乳鼠的致病力方面,对嵌合病毒、亲本基因工程病毒以及FMDVO/GSLX/CHN/2010株进行了评价。【结果】FMDVO/GsLx/cHN/2010株复制较慢,对乳鼠致病力较差。嵌合病毒和亲本基因工程病毒的复制能力、对乳鼠的致病力明显高于FMDVO/GsLX/cHN/2010株。【结论】研究表明FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段不能独自决定该病毒较差的复制能力和较弱的乳鼠致病力。这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制以及S片段对病毒生物学特性的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 感染性克隆 S片段 病毒生物学特性
口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白对病毒感染性的影响 被引量:1
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作者 张萌 白兴文 +7 位作者 李平 范朋举 包慧芳 孙普 卢曾军 曹轶梅 陈应理 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期2052-2060,共9页
【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya9... 【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya98/HN1前导蛋白的两株嵌合全长cDNA感染性克隆,采用实时荧光定量PCR检测两株不同的嵌合病毒感染猪肾原代细胞后细胞内IFNβ和OAS mRNA的转录情况。【结果】嵌合病毒rOHN1Lab增殖能力较弱,其对应诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较高,而嵌合毒rO33Lab相对于rOHN1Lab增殖能力较强,他们诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较低。【结论】研究表明口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P前导蛋白具有更强的抗IFNβmRNA转录的能力,该研究能够为进一步鉴定FMDV前导蛋白抗宿主先天性免疫的关键性位点奠定基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 嵌合病毒 前导蛋白 IFNβ 转录 影响
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