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聚季铵盐调理污泥深度脱水过程与中试效能 预览
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作者 王子文 曹蓉 +3 位作者 杨艳 朱引 王硕 李激 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第7期3458-3464,共7页
采用聚季铵盐[P(DM-AM)]取代传统化学调理剂聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAM),通过分析污泥脱水性能、胞外聚合物含量以及抽滤液水质指标,验证P(DM-AM)作为污泥调理剂的效果。结果表明,P(DM-AM)作为阳离子型高分子絮凝剂能够提高污泥的... 采用聚季铵盐[P(DM-AM)]取代传统化学调理剂聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAM),通过分析污泥脱水性能、胞外聚合物含量以及抽滤液水质指标,验证P(DM-AM)作为污泥调理剂的效果。结果表明,P(DM-AM)作为阳离子型高分子絮凝剂能够提高污泥的脱水性能,在最适投加量为0.4%~0.5%(按污泥干固量计算)时,毛细吸水时间(capillary absorption time,CST)和污泥比阻(specific resistance of sludge,SRF)分别下降48%和40%,污泥热值可达2686cal/g(1cal=4.18J)。当P(DM-AM)协同生石灰(CaO)和氯化铁(FeCl3)作为调理剂调理污泥时,处理后的污泥水分去除率可升高55%左右,与污泥紧密结合型胞外聚合物(tightly bound-EPS,TB-EPS)中的多糖含量降低了74%,且污泥中Cl^-1浓度约为92.3mg/gDS,较采用PAM调理的污泥下降约6%,可缓解污泥焚烧对焚烧炉腐蚀的影响。同时,P(DM-AM)调理污泥后,其抽滤液化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)由2120mg/L降低至1941.8mg/L,可有效减轻污水处理厂运行负担。 展开更多
关键词 聚季铵盐 聚合物 过滤 胞外聚合物 废物处理 中试效能
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血清叶酸化学发光免疫检测技术及试剂盒的研发 预览
2
作者 卢菲 王世杰 +2 位作者 陈祥 白仲虎 杨艳 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期98-102,共5页
研究建立了一种叶酸化学发光免疫检测技术,并开发成检测试剂盒,能快速、准确检测血清中叶酸的含量。首先用样本处理剂快速将血清中结合态叶酸完全释放,再用高亲和力的叶酸结合蛋白进行检测,建立一种竞争化学发光免疫分析方法。通过对试... 研究建立了一种叶酸化学发光免疫检测技术,并开发成检测试剂盒,能快速、准确检测血清中叶酸的含量。首先用样本处理剂快速将血清中结合态叶酸完全释放,再用高亲和力的叶酸结合蛋白进行检测,建立一种竞争化学发光免疫分析方法。通过对试剂盒中各组分的优化,试剂盒最低检测限为1ng/mL,线性测量范围为1.5~50ng/mL,批内及批间变异系数(CV%)均小于10%。稳定性好,37℃加速稳定性能维持10d,2℃~8℃能稳定维持为16个月。通过对200份临床血清样本进行检测,试剂盒检测结果与国外著名试剂盒厂家(贝克曼)的相关性系数(R)可达到0.9847。该叶酸检测技术创新地运用了生物素-亲和素反应体系,改变了传统抗原抗体反应存在不均一不稳定等弊端,提高了检测的准确度和灵敏度,并研制出新的样本处理试剂和方法,使血清中叶酸释放更加迅速和完全,提高了试剂盒的准确度并降低了成本。试剂盒的各项性能指标均居于国内领先水平且成本较低,检测量大,可替代国外同类型检测试剂盒。 展开更多
关键词 叶酸 化学发光免疫检测技术 生物素-亲和素体系 试剂盒
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血清铁蛋白化学发光免疫分析方法的建立及临床应用 预览
3
作者 孙姗姗 李昕 +2 位作者 宋翠翠 杨艳 白仲虎 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期118-123,共6页
利用链霉亲和素-生物素放大系统及双抗夹心法,建立检测血清铁蛋白的化学发光免疫分析方法。将生物素、辣根过氧化物酶分别标记铁蛋白的一对抗体,以链霉亲和素包被96孔发光板,铁蛋白标准品与国际标准品进行溯源,并对本法的各项性能指标... 利用链霉亲和素-生物素放大系统及双抗夹心法,建立检测血清铁蛋白的化学发光免疫分析方法。将生物素、辣根过氧化物酶分别标记铁蛋白的一对抗体,以链霉亲和素包被96孔发光板,铁蛋白标准品与国际标准品进行溯源,并对本法的各项性能指标进行评价。收集300份临床血清样本,使用本法与进口试剂盒同时检测,检测结果显示:相关系数r为0.97,本法的线性测量范围为10~800ng/mL,灵敏度为0.2ng/mL,批内、批间的变异系数(CV%)分别为3.4%~5.5%及5.0%~7.3%,与癌胚抗原、人白蛋白、人类心脏铁蛋白以及血红蛋白交叉反应率均小于1%。本法37℃、9d热稳定性良好。表明所建立的方法各项指标均满足临床检测要求,抗体及样本用量少,操作简便,反应迅速,便于临床应用,可替代国外同类试剂盒。 展开更多
关键词 血清铁蛋白 化学发光免疫分析 生物素 亲和素 双抗夹心
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乙醇对谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达的影响 预览
4
作者 高雄 刘秀霞 +2 位作者 孙曼曼 杨艳 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期14-17,41共5页
谷氨酸棒杆菌是一种传统的工业微生物。为研究乙醇对谷氨酸棒杆菌表达外源蛋白的影响,将组成型表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的谷氨酸棒杆菌接入含有不同浓度乙醇的培养基中培养,发现低浓度(1%)乙醇... 谷氨酸棒杆菌是一种传统的工业微生物。为研究乙醇对谷氨酸棒杆菌表达外源蛋白的影响,将组成型表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的谷氨酸棒杆菌接入含有不同浓度乙醇的培养基中培养,发现低浓度(1%)乙醇在被利用的过程中可以显著提高菌体的单位荧光强度。将乙醇与常见的几种营养物质进行了对比,发现乙醇在促进菌体生长以及蛋白表达方面表现更好。此外,根据乙醇被利用时异柠檬酸裂合酶(Isocitrate lyase,ICL)被强烈诱导的特性构建了一个表达能力较强、诱导效果较好的自诱导表达载体。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 乙醇 蛋白表达 碳源
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朵渔诗歌简评
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作者 杨艳 《星星》 2019年第5Z期25-28,共4页
《物》这首小诗,看似写物,实则写的是人与物之间的关系。'人生如聚物之乐,收缩着自己的/空间,以便腾出地方给那些无用之物',这是朵渔式的冷静洞察与思考。人极尽毕生之力去占有空间,用大大小小的物填充它,然后再试图去占有更大... 《物》这首小诗,看似写物,实则写的是人与物之间的关系。'人生如聚物之乐,收缩着自己的/空间,以便腾出地方给那些无用之物',这是朵渔式的冷静洞察与思考。人极尽毕生之力去占有空间,用大大小小的物填充它,然后再试图去占有更大的空间、更多的物。表面上看,这是一个人占有物的必然过程,从出生到成年直至老去,我们从未停止占有。然而,诗人告诉我们,人占有物的过程,同时也是被物件占有和支配的过程。 展开更多
关键词 瓦尔泽
利用内源元件在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶
6
作者 张伟 刘秀霞 +1 位作者 杨艳 白仲虎 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期425-434,共10页
以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD)序列,构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达,选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽,分别为Tat型的CgR0949及Se... 以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD)序列,构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达,选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽,分别为Tat型的CgR0949及Sec型的CspB信号肽。在实现分泌表达之后,对其进行5 L发酵罐的扩大培养以提高分泌量。并对纯化的木聚糖酶进行了部分酶学性质的研究,包括最适催化pH及酸碱耐受性;最适催化温度及热稳定性。结果表明:在上述表达体系中,以CgR0949为信号肽木聚糖酶不能分泌到胞外;木聚糖酶能在CspB信号肽的引导下分泌到胞外,分泌表达量为486.2 U/mL。木聚糖酶的分泌量在5 L发酵罐水平上达到1 648.7 U/mL,是摇瓶培养的3.4倍。该木聚糖酶的最适反应pH为4.5,最适温度为45℃;在pH 4–11范围内4℃处理24 h酶活保持在80%以上;在50℃前处理15 min酶活保持在95%以上,超过60℃则酶活迅速下降至20%及其以下。上述结果表明,谷氨酸棒杆菌内源元件能有效用于木聚糖酶的分泌表达,扩大培养能进一步提升木聚糖酶的分泌量。该双顺反子表达体系能为外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达提供一种可用的工具。此外,通过酶学性质的研究可进一步提高木聚糖酶的催化效率。 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 木聚糖酶 双顺反子 分泌表达
Mxr1磷酸化水平受Ptp调控机理的初步研究 预览
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作者 侯成林 杨艳 +1 位作者 陈嘉荔 白仲虎 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期108-113,共6页
通过PULL-DOWN找到与巴斯德毕赤酵母转录激活因子Mxr1相互作用的小分子酪氨酸磷酸酶Ptp,并验证其去磷酸化功能,可以使磷酸化的Mxr1第215位丝氨酸的磷酸基团水解。用Mxr1第215位特定位点磷酸化抗体Western blot检测Mxr1S215在不同培养基... 通过PULL-DOWN找到与巴斯德毕赤酵母转录激活因子Mxr1相互作用的小分子酪氨酸磷酸酶Ptp,并验证其去磷酸化功能,可以使磷酸化的Mxr1第215位丝氨酸的磷酸基团水解。用Mxr1第215位特定位点磷酸化抗体Western blot检测Mxr1S215在不同培养基中磷酸化情况。发现野生菌株中Mxr1在甘油培养基没有磷酸化,在甲醇培养基发生磷酸化。在Ptp高表达菌株中,无论在甘油还是甲醇培养基Mxr1都没有发生磷酸化,而在Ptp敲除菌株中磷酸化明显高于野生型菌株,说明Ptp调控Mxr1磷酸化。在大肠杆菌中表达并纯化,测定了Ptp酶学性质。构建了巴斯德毕赤酵母Mxr1S215A突变株,发现多个与甲醇代谢相关的基因在转录水平发生变化,推测其可能受S215位点磷酸化Mxr1的调控。 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 转录激活因子Mxr1 磷酸酶 磷酸化
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物理强化复合试剂对污泥中重金属的浸提效果
8
作者 朱引 王硕 +2 位作者 杨倩倩 杨艳 李激 《中国给水排水》 CSCD 北大核心 2018年第17期74-78,共5页
重金属极大地限制了污泥无害化利用,处置不当将对人类健康及生态环境造成危害。为强化复合试剂对污泥中重金属的浸提率,分别采用超声波和微波两种物理方法进行预处理,并从处理时间、功率和功密度三个角度评价超声波和微波对复合试剂... 重金属极大地限制了污泥无害化利用,处置不当将对人类健康及生态环境造成危害。为强化复合试剂对污泥中重金属的浸提率,分别采用超声波和微波两种物理方法进行预处理,并从处理时间、功率和功密度三个角度评价超声波和微波对复合试剂浸提率的影响。结果表明,超声波和微波处理均能提升复合试剂对污泥中Cu、Zn、Mn、Cr和Ni的浸提率。微波预处理的最佳功密度为675kJ/g,此时复合试剂对Cu、Zn、Mn、Cr、Ni的浸提率分别为79%、97%、90%、58%、86%。超声波预处理的最佳功密度为135kJ/g,此时复合试剂对Cu、Zn、Mn、Cr、Ni的浸提率分别为69%、96%、89%、40%、65%。两种物理方法均存在最佳处理时间和功率,实际应用中可根据功密度曲线确定。 展开更多
关键词 复合试剂 污泥 重金属 超声波 微波 强化浸提
SUMO蛋白酶Ulp1的高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv 被引量:1
9
作者 李诗洁 杨艳 +2 位作者 刘萌 白仲虎 金坚 《中国生物工程杂志》 CSCD 北大核心 2018年第3期51-61,共11页
SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1(L... SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1(Leu403-Lys621),并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His_6),构建重组表达载体psv T7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trx B(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×10~4U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数K_m=0.359g/L,V_m=5.10μg/(ml·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。 展开更多
关键词 Ulp1 Ni-NTA SUMO SCFV 高效表达纯化
不同表达模式组合对谷氨酸棒状杆菌中脑钠肽蛋白表达的影响 预览
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作者 彭枫 刘秀霞 +2 位作者 陈静 杨艳 白仲虎 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2018年第8期1-7,共7页
外源蛋白表达系统按照启动子作用方式可分为诱导型和组成型,按照蛋白表达后的定位可分为胞内表达和分泌表达。为了研究外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中最适的表达模式组合,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为模式蛋白构建用... 外源蛋白表达系统按照启动子作用方式可分为诱导型和组成型,按照蛋白表达后的定位可分为胞内表达和分泌表达。为了研究外源蛋白在谷氨酸棒状杆菌中最适的表达模式组合,以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)为模式蛋白构建用于研究谷氨酸棒状杆菌不同表达模式的快速表达体系,并利用这一体系研究脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)的最适表达模式。结果表明,相比于诱导型胞内表达、诱导型分泌表达、组成型分泌表达模式,BNP通过组成型胞内表达可达到最高的表达量。表达产物经过NI-NTA亲和层析,可得到纯化的BNP产量为235.5 mg/L,纯度可达90%。该研究构建了一套谷氨酸棒状杆菌中外源蛋白不同表达模式组合的快速检测方法,并成功实现了BNP的表达,这对以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达外源蛋白具有重要的指导意义。 展开更多
关键词 谷氨酸棒状杆菌 脑钠肽 蛋白表达 表达模式
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“他们的小说里有中国人心灵的真实”——弋舟、张楚、石一枫作品研讨会实录
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作者 张莉 杨艳 李嘉桐 《青年文学》 2018年第4期119-127,共9页
当弋舟、张楚、石一枫三位作家的名字放在一起,我们会马上意识到他们都是七〇后,而且在他们的作品里,能清晰感受到一代人文学趣味的纯正,一代人写作态度的诚恳,不得不承认,这是非常难得的一代写作者。我相信,在未来,我们会更强烈地意识... 当弋舟、张楚、石一枫三位作家的名字放在一起,我们会马上意识到他们都是七〇后,而且在他们的作品里,能清晰感受到一代人文学趣味的纯正,一代人写作态度的诚恳,不得不承认,这是非常难得的一代写作者。我相信,在未来,我们会更强烈地意识到这一点。当然用代际来框一个作家是有问题的,我在《众声独语:七〇后一代人的文学图谱》一书中也讨论过这一说法的局限性。 展开更多
关键词 作品研讨会 张楚 人的文学 文学趣味 独语 写作态度 清晰感 八十年代 实录 小说家
O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断CLIA检测方法的建立 预览
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作者 王世杰 王春新 +4 位作者 卢菲 杨艳 刘学荣 安芳兰 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期102-106,共5页
为了能更高效和准确地对口蹄疫疫情进行诊断监测,建立了O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断化学发光免疫定性检测方法(Liquid-phase blocking CLIA,LPB-CLIA)。通过以单一稀释倍数稀释样本进行检测,计算抑制率作为检测结果,将检测通量提高... 为了能更高效和准确地对口蹄疫疫情进行诊断监测,建立了O型口蹄疫病毒抗体高通量液相阻断化学发光免疫定性检测方法(Liquid-phase blocking CLIA,LPB-CLIA)。通过以单一稀释倍数稀释样本进行检测,计算抑制率作为检测结果,将检测通量提高了5倍左右。应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)确定试验最佳临界值为62.5%。重复性实验结果显示方法批内CV小于10%,批间CV小于15%。通过对326份田间血清样本检测结果与LPB-ELISA检测结果对比,敏感性为94.6%,特异性为95.6%,检测准确度为95.1%。建立的LPB-CLIA方法敏感性和特异性良好,缩减了时间和经济成本,为国内口蹄疫的检疫提供了新的方法。 展开更多
关键词 口蹄疫 液相阻断 化学发光 高通量 抗体检测
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竹粉骨架构建体对污泥脱水性能的影响
13
作者 杨艳 李激 +2 位作者 陈晓光 王燕 王硕 《中国给水排水》 CSCD 北大核心 2017年第19期63-67,72共6页
污泥焚烧处置的难点在于如何降低污泥含水率和提高泥饼热值。为此,采用竹粉作为骨架构建体替代石灰,以阳离子型聚丙烯酰胺和FeCl3为协同化学药剂调理污泥。通过测定污泥比阻、毛细吸水时间及滤饼的有机物含量和含水率等,探讨竹粉及... 污泥焚烧处置的难点在于如何降低污泥含水率和提高泥饼热值。为此,采用竹粉作为骨架构建体替代石灰,以阳离子型聚丙烯酰胺和FeCl3为协同化学药剂调理污泥。通过测定污泥比阻、毛细吸水时间及滤饼的有机物含量和含水率等,探讨竹粉及协同化学药剂对污泥脱水性能的影响。结果表明,竹粉主要发挥骨架构建体作用,在30%的最佳投加量条件下,可使污泥的压缩系数降低24.6%;相比石灰调理,泥饼的有机物含量从44.9%提高到65.6%,适宜污泥焚烧处置;竹粉协同化学药剂调理污泥时,污泥比阻、毛细吸水时间和泥饼含水率均明显降低。基于中试结果和运行成本分析,认为竹粉作为骨架构建体调理污泥的可行性较高。 展开更多
关键词 污泥调理 竹粉 骨架构建体 污泥比阻 毛细吸水时间
稻壳粉调理对污泥脱水性能及脱水液水质的影响 被引量:2
14
作者 杨艳 李激 +2 位作者 陈晓光 王燕 王硕 《中国给水排水》 CSCD 北大核心 2017年第13期113-118,共6页
采用稻壳粉作为骨架构建体替代无机调理剂(生石灰),通过测定污泥比阻、毛细吸水时间、Zeta电位及滤饼有机物含量和含水率、滤液水质指标,探讨稻壳粉及其协同聚丙烯酰胺和FeCl,对污泥脱水性能及脱水液水质的影响。结果表明,稻壳粉... 采用稻壳粉作为骨架构建体替代无机调理剂(生石灰),通过测定污泥比阻、毛细吸水时间、Zeta电位及滤饼有机物含量和含水率、滤液水质指标,探讨稻壳粉及其协同聚丙烯酰胺和FeCl,对污泥脱水性能及脱水液水质的影响。结果表明,稻壳粉作为骨架构建体能够降低污泥的可压缩性,提高污泥的脱水性能,降低污泥泥饼含水率,并且投加量为30%时效果最好。当稻壳粉协同聚丙烯酰胺和FeCl,的投加量分别为0.07%和7%时,可以明显降低污泥毛细吸水时间、污泥比阻和污泥泥饼含水率。同时,稻壳粉调理污泥能显著改善脱水液水质、降低COD和氨氮值,从而减轻污水厂的运行负担。对比运行效果和经济成本发现,稻壳粉可以取代生石灰作为污泥调理剂。 展开更多
关键词 稻壳粉 骨架构建体 污泥比阻 毛细吸水时间 含水率
CAR-T细胞疗法的自动化设备及展望 预览 被引量:1
15
作者 聂简琪 孙杨 +4 位作者 杨艳 戴晓峰 刘秀霞 詹锦玲 白仲虎 《生物产业技术》 2017年第5期33-37,共5页
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过从患者或者捐献者外周血分离获得T细胞,并进一步激活、基因修饰、扩增从而获得CAR-T细胞,洗涤浓缩后回输患者体内进行治疗。... 嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞疗法是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过从患者或者捐献者外周血分离获得T细胞,并进一步激活、基因修饰、扩增从而获得CAR-T细胞,洗涤浓缩后回输患者体内进行治疗。修饰后的T细胞肿瘤靶向性、杀伤活性更强,在血液肿瘤疾病临床试验中疗效明显,在实体瘤的临床试验中也崭露头角。CAR-T细胞疗法整个过程的安全性、无菌性、纯度等质量控制极其重要。确保CAR-T细胞疗法生产过程的标准化、封闭化与自动化,做到药效和风险可控是首要任务。对CAR-T细胞疗法工艺与自动化设备以及面临的工程化问题进行综述,以期为CAR-T细胞疗法工程化提供参考。 展开更多
关键词 CAR-T细胞 细胞治疗 自动化设备 工程化
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Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达 被引量:3
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作者 张震阳 杨艳 +3 位作者 战春君 李翔 刘秀霞 白仲虎 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期38-45,共8页
巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代... 巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系。目的:构建了甘油转运体GT2(PASchr31076)缺失菌株P.pastoris X-33ΔGT2,研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平。方法:构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP,经酶线性化后电转野生型菌株P.pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP;通过同源重组的方法敲除GT2基因,获得ΔGT2-EGFP敲除菌株;以ΔGT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株,在甘油、甲醇,以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况,并检测在以甘油为唯一碳源时,胞外的甘油含量。结果:在以甘油甲醇混合碳源培养时,突变体ΔGT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35%,单位荧光强度要高出近70%;在以甘油为唯一碳源时,X-EGFP最终收获时的生物量比ΔGT2-EGFP多,且发酵液中甘油含量相对较少;以混合碳源培养时ΔGT2总外源蛋白表达水平最高。结论:实验表明,GT2参与甘油的吸收与代谢,ΔGT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制,暗示甘油转运体与PAOX1相关,且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统。 展开更多
关键词 巴斯德毕赤酵母 甘油转运体 GT2 甘油阻遏 基因敲除
大肠杆菌中dAb一级结构与可溶性表达关联 预览
17
作者 郭雯雯 刘萌 +2 位作者 白仲虎 杨艳 戴晓峰 《食品与生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第9期951-958,共8页
抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用“试错法”优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的... 抗体类药物研发是药物发展的一个重要研究方向,目前已有许多抗体在原核表达体系中成功表达。人们通常采用“试错法”优化表达系统,提高蛋白质产量,但该方法费时费力且成功率低,因此迫切需要探索氨基酸组成与蛋白质可溶性表达水平之间的关联,以指导表达系统的选择或蛋白质分子的定向改造。在单域抗体dAb分子的C端末尾添加一个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。通过层次聚类、Cluster Omega对dAb氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。通过对65个CDR随机突变的dAb分子进行线性建模分析其可溶性表达量,发现对dAb胞外质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为S(丝氨酸),R(精氨酸),N(天冬酰胺),D(天冬氨酸),Q(谷氨酰胺),Y(酪氨酸),F(苯丙氨酸),G(甘氨酸),对dAb胞内质量分数有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C(半胱氨酸),N,S,Y,K(赖氨酸),A(丙氨酸),对dAb蛋白质总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T(苏氨酸)。其中R、S和G的含量显著影响dAb的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。 展开更多
关键词 DAB 氨基酸组成 可溶性表达 聚类分析 线性建模
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过表达人工设计的sRNA(anti-micA)提高大肠杆菌存活力和普鲁兰酶产量 预览
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作者 安展飞 栗亚美 +1 位作者 杨艳 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期16-22,共7页
大肠杆菌表达外源蛋白的过程中会受到各种外源和内源的胁迫并且形成了多种感受和响应特定刺激的胁迫信号传导系统。细菌胁迫应激时,许多小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)参与mRNA转录后调节,改变其翻译效率和稳定性,调节基... 大肠杆菌表达外源蛋白的过程中会受到各种外源和内源的胁迫并且形成了多种感受和响应特定刺激的胁迫信号传导系统。细菌胁迫应激时,许多小的非编码RNA(small non-coding RNA,sRNA)参与mRNA转录后调节,改变其翻译效率和稳定性,调节基因表达。通过过表达人工设计的micA反义sRNA anti-micA(bprO和omU)阻断micA对ompA的沉默,进而阻断sigma E介导的细胞自溶信号转导途径,提高大肠杆菌存活力和表达普鲁兰酶能力,并初步讨论了影响人工设计反式编码sRNA功能的影响因素。研究发现,在bprO和omU过表达菌株中,菌落形成单位分别提高了0.5和1个数量级,ompA mRNA相对水平分别提高了7.2和6.9倍,OmpA蛋白含量均显著提高,普鲁兰酶产量分别提高了1.4和1.8倍,并且omU的过表达比bprO的过表达对菌体特性的影响更大。为菌种改良提供了一种新的方法,并为反式编码sRNA的设计提供参考性指导。 展开更多
关键词 胁迫应激 人工设计sRNA 存活力 细胞自溶 普鲁兰酶
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酸性普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中分泌表达研究 预览
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作者 栗亚美 陈阿娜 +1 位作者 杨艳 白仲虎 《生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期23-29,共7页
来自于酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶,由于分子量较大,在大肠杆菌中难以实现高效分泌表达。为研究其在E.coli中高效分泌表达策略,构建了带信号肽的p ET-28a(+)-pel B-pul13A质粒,通过发酵过程控制及向发酵培养基中添加促分泌物质,系... 来自于酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶,由于分子量较大,在大肠杆菌中难以实现高效分泌表达。为研究其在E.coli中高效分泌表达策略,构建了带信号肽的p ET-28a(+)-pel B-pul13A质粒,通过发酵过程控制及向发酵培养基中添加促分泌物质,系统地优化了分泌表达策略。通过分子改造,带信号肽的表达系统实现了低水平的分泌性表达;进一步通过优化培养基、诱导温度、IPTG浓度、诱导时机及11种培养基添加物,促进普鲁兰酶最大限度的分泌到周质空间。实验结果显示,连上pel B信号肽的pull3A在TB/SB培养基中,通过优化的诱导条件(IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导温度20℃,诱导时机为接种后5 h),在诱导20 h时加入0.03%SDS,周质空间酶活达到最大值102.5 U/m L。在此基础上,探究了化学添加剂对大肠杆菌细胞膜及膜通透性的影响,并应用优化后的系统实现了乙酰胆碱酯酶和单域抗体的分泌表达。为大分子蛋白在大肠杆菌中分泌表达提供参考。 展开更多
关键词 普鲁兰酶 分泌表达 信号肽 发酵优化 培养基添加物 十二烷基磺酸钠
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外源蛋白表达过程中谷氨酸棒状杆菌转录组及代谢物的多变元分析 预览
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作者 孙杨 刘秀霞 +2 位作者 董贵斌 杨艳 白仲虎 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2017年第8期8-14,共7页
以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用... 以谷氨酸棒状杆菌为研究对象,在发酵罐水平30%溶解氧条件下对野生菌及表达EGFP的工程菌进行平行培养,对培养20 h的菌体进行转录组分析,并对不同时间点所取样品进行代谢物检测。利用多变元分析方法分析转录组和代谢物数据,其中主要利用主成分分析法进行关键因素分析,利用正交偏最小二乘法判别分析进行转录组数据分析,继而通过S-plot得到不同溶解氧下的生物标记物(biomarkers),最终找到了8个关键基因。代谢数据分析结果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞内谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表达的关键代谢物;通过不同时间点代谢物含量变化分析发现外源蛋白表达的代谢变化类似于低氧环境下的代谢变化现象,即糖酵解增强,TCA溢流,回补途径增加,乙酸、乳酸生成增加。通过对比外源蛋白表达工程菌与野生菌的转录组数据及代谢物含量数据,为今后在代谢工程中菌株改造、优化代谢获得高效表达外源蛋白的谷氨酸棒状杆菌表达宿主奠定基础。 展开更多
关键词 谷氨酸棒状杆菌 多变元分析 正交偏最小二乘法判别分析 关键基因 转录组测序
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