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滑液支原体WVU1853株pdhA、pdhB的原核共表达及表达产物酶活性分析
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作者 包世俊 +4 位作者 薛慧文 椿 温峰琴 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1673-1680,共8页
滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是禽类重要的致病性支原体,MS感染可引起鸡(Gallus gallus)和火鸡(Meleagris gallopavo)的呼吸道病症以及关节炎和关节滑膜炎,导致蛋鸡产蛋量及鸡蛋品质下降、种蛋孵化率降低、肉鸡生长发育迟缓、... 滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是禽类重要的致病性支原体,MS感染可引起鸡(Gallus gallus)和火鸡(Meleagris gallopavo)的呼吸道病症以及关节炎和关节滑膜炎,导致蛋鸡产蛋量及鸡蛋品质下降、种蛋孵化率降低、肉鸡生长发育迟缓、饲料转化率低、胴体废弃率高等,给养鸡业造成重大经济损失。对滑液支原体的快速检测方法及良好免疫制剂的研究,可为其感染的快速诊断和有效预防提供支持。基于此,本研究参照GenBank中MS WVU1853株(GenBank No. CP011096.1)丙酮酸脱氢酶E1α亚基基因(pyruvate dehydrogenase E1αsubunit gene, pdhA)和β亚基基因(pdhB)序列及结构设计引物,应用PCR技术分别扩增获得二者及其以单碱基重叠方式连接的自然序列AB,采用overlap-PCR技术完成基因优化,将pdhA与pdhB以及AB分别克隆入原核表达载体pETduet-1和pET-28a(+),成功构建原核共表达质粒pETDuet-AB和pET-AB;并在分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达,表达产物纯化后应用SDS-PAGE分析,进而检测其酶促活性。SDS-PAGE结果表明,MS WVU1853株pdhA和pdhB基因在两种质粒转化的大肠杆菌中均获表达,且表达产物相对分子量分别为43和36 kD,但pET-AB转化菌中两种蛋白均高效表达,而pETDuet-AB转化菌中α亚基表达效率明显较低;酶活性检测结果表明,两种转化菌诱导表达产物均具有酶促活性。本研究基于单核苷酸重叠构建了MSpdhA和pdhB基因的共表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达,为pdhA和pdhB生物学功能的研究提供了良好的材料,为MS诊断方法的建立提供了可能的标识物,也为MS感染相关免疫制剂的研发提供了可能的疫苗候选,为两个基因的共表达提供了新的思路。 展开更多
关键词 滑液支原体(MS) 丙酮酸脱氢酶 共表达
滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位 预览
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作者 胡荣斌 +4 位作者 椿 张阳阳 贺健 张生英 包世俊 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第8期2228-2235,共8页
为了解滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD)的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测... 为了解滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD)的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a(+)质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb 2+具有较强的抑制作用,而Ca 2+对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶160 000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。 展开更多
关键词 滑液支原体(MS) 甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD) 原核表达 酶活性测定 亚细胞定位
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抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2单克隆抗体的制备 预览
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作者 马延森 李晓 +4 位作者 陈志 兰向丽 椿 靳亚平 刘伟 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2013年第3期33-38,共6页
【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21... 【目的】制备抗果蝇组蛋白乙酰转移酶Atac2的单克隆抗体,为进一步研究Atac2基因的功能提供重要的试验工具。【方法】PCR扩增果蝇Atac2蛋白N端前26个氨基酸的编码基因,构建GST-Atac2融合蛋白表达载体pGEX-Atac2。转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,通过GST亲和层析法纯化GST-Atac2融合蛋白。以GST-Atac2为抗原免疫8周龄的Balb/c小鼠,取脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法检测阳性孔,经有限稀释法亚克隆,筛选单克隆杂交瘤细胞株,检测抗体的特异性、效价和亚型,并检测其亲和常数。【结果】PCR扩增获得了目的片段。成功构建了GST-Atac2融合蛋白表达载体,于37℃下220r/min振摇5h,当IPTG终浓度为0.1mmol/L时,GST-Atac2在E.coli BL21(DE3)中高效表达,GST-Atac2融合蛋白大小约为30ku,与预期结果一致。获得1株稳定分泌抗Atac2抗体的杂交瘤细胞株,命名为1C7。单抗1C7能够特异地识别GST-Atac2蛋白,效价为1∶2×105;亚型鉴定表明其重链为IgG1,所得单克隆抗体的亲和常数为2×105。【结论】获得了1株特异性好、能够稳定分泌抗果蝇Atac2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。 展开更多
关键词 果蝇 Atac2 原核表达 单克隆抗体
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猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选 预览
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作者 郜原 薄联锋 +5 位作者 椿 孙柏 温俊歌 孙岩 徐志坤 张德礼 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2012年第3期 21-24,共4页
本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,... 本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) microRNA(miRNA) 初步筛选
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野猪源与家猪源PRRSV陕西分离株全基因测序与遗传进化分析 预览 被引量:1
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作者 张冲 椿 +2 位作者 王波 韩青松 杨增岐 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2011年第2期9-16,22共9页
【目的】研究野猪源与家猪源猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)陕西分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。【方法】根据VR-2332和HB-1(sh)/2002毒株序列设计引物,对2株PRRSV... 【目的】研究野猪源与家猪源猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)陕西分离株的遗传变异情况及分子生物学特征。【方法】根据VR-2332和HB-1(sh)/2002毒株序列设计引物,对2株PRRSV陕西分离毒株Shaanxi-1(家猪源)、Shaanxi-2(野猪源)全基因分段进行扩增并测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。【结果】PRRSV Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株高度同源且均属于美洲型毒株,它们与2006年以前分离的毒株相比存在明显差异(与BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%),而与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)保持较高的同源性(相似率为99%左右)。Shaanxi-1、Shaanxi-2分别呈现不同的变异特点,Shaanxi-1 ORF3、ORF5基因变异较大,ORF6、ORF7较为保守;Shaanxi-2 ORF7基因变异最大,ORF3~ORF6较为保守。分析发现,Shaanxi-1、Shaanxi-2具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。【结论】不同来源的Shaanxi-1、Shaanxi-2毒株均属于HP-PRRSV演化中的一个分支,但其发生了部分变异,使其具备了新的特点。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 野猪与家猪 全基因测序 遗传进化分析
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野猪源与家猪源PRRSV陕西流行毒株对仔猪的致病性试验 预览 被引量:2
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作者 椿 王波 +7 位作者 刘阳坤 杨增岐 张淑霞 党如意 张鹏 赵伟 张冲 韩青松 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2011年第5期32-38,共7页
【目的】研究野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株对易感仔猪的致病性及发病规律,进一步弄清PRRSV变异株的病原特征及其与"猪高热病"发生的关系。【方法】选取PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原... 【目的】研究野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株对易感仔猪的致病性及发病规律,进一步弄清PRRSV变异株的病原特征及其与"猪高热病"发生的关系。【方法】选取PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、抗体检测均为阴性的健康仔猪(40日龄)9头,随机分为3组,用家猪源Shaanxi-1及野猪源Shaanxi-2 PRRSV变异株分别感染其中一组仔猪,每头肌注6 mL,滴鼻2 mL;另一组作为阴性对照,按相同剂量和方法接种正常Marc-145细胞处理液。攻毒后各组分圈饲养,每天定时测量体温,绘制体温变化曲线,观察临床症状,记录发病情况。攻毒后采血及咽喉、眼、鼻分泌物和粪便,采用RT-PCR方法检测PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、PCV2、猪伪狂犬病毒(PRV)核酸,用ELISA试验及血清中和试验检测血清抗体。【结果】Shaanxi-1与Shaanxi-2攻毒组均出现体温升高及典型临床症状,但未见死亡病例;攻毒组CSFV、PCV2、PRV核酸检测均为阴性,咽喉、眼、鼻分泌物和粪便在一定时间段可检测到PRRSV核酸;PRRSV特异性抗体检测均为阳性,仅Shaanxi-2攻毒组在第35天检测到中和抗体;Shaanxi-2与Shaanxi-1相比,感染猪的体温较高,临床症状明显,病毒血症的维持时间较长,抗体水平较高。【结论】野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1 PRRSV变异株对易感仔猪具有一定的致病性,能使感染动物发病但不能致死,Shaanxi-2毒株的致病性相对较强。攻毒后第7天出现病毒血症,持续14~21 d后逐渐消退,仔猪感染PRRSV变异株后,病毒可通过鼻、眼、咽喉分泌物及粪便等排出,其中鼻分泌物排毒最早、排毒时间最长,眼、咽喉分泌物与鼻分泌物、粪便相比排毒较晚、持续时间较短。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 家猪 野猪 致病性
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鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析 预览 被引量:1
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作者 韩青松 代鹏 +7 位作者 杨增岐 张鹏 张淑霞 党如意 樊荣 王波 张冲 椿 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2010年第6期7-12,共6页
【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P... 【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。 展开更多
关键词 新城疫病毒 P基因 序列分析
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