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hCD47诱导人巨噬细胞对猪内皮细胞的免疫耐受 预览
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作者 胡文宝 登科 +2 位作者 DavidK.C.Cooper 蔡志明 牟丽莎 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期165-170,共6页
目的探讨人CD47(hCD47)在诱导人巨噬细胞对猪内皮细胞免疫耐受中的作用。方法将转染了pCDH-hCD47-FLAG质粒的猪髂总动脉内皮细胞(PIEC)设为pCDH-hCD47组;将转染了pCDH-FLAG空载体质粒的PIEC为pCDH组;将转染了hCD47-dN的PIEC设为pCDH-hCD... 目的探讨人CD47(hCD47)在诱导人巨噬细胞对猪内皮细胞免疫耐受中的作用。方法将转染了pCDH-hCD47-FLAG质粒的猪髂总动脉内皮细胞(PIEC)设为pCDH-hCD47组;将转染了pCDH-FLAG空载体质粒的PIEC为pCDH组;将转染了hCD47-dN的PIEC设为pCDH-hCD47-dN组;将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)设为阳性对照组。将细胞分别与人巨噬细胞共培养,检测信号调节蛋白α(SIRPα)的磷酸化情况以及人巨噬细胞对PIEC的杀伤作用。进一步从GT-/-及GT-/-/hCD47基因编辑猪中分离了猪主动脉血管内皮细胞(PAEC),并分析SIRPα的磷酸化情况及人巨噬细胞对PAEC的杀伤作用。结果 pCDH组细胞不能诱导SIRPα的磷酸化,而pCDH-hCD47组细胞与人巨噬细胞共培养10 min后便能够激活SIRPα的磷酸化,且随着共培养时间的延长,SIRPα的磷酸化程度也随之增强。pCDH-hCD47-dN组细胞不能激活SIRPα的磷酸化。人巨噬细胞对p CDH组细胞产生了明显的杀伤作用,p CDH-h CD47组细胞可明显抑制人巨噬细胞的杀伤作用(P<0.05),而pCDH-hCD47-dN组细胞则不能抑制人巨噬细胞的杀伤作用。GT-/--PAEC与人巨噬细胞共培养后,不能激活SIRPα的磷酸化;而GT-/-/hCD47-PAEC与人巨噬细胞共培养后则明显激活了SIRPα的磷酸化。人巨噬细胞对GT-/--PAEC产生了明显的杀伤作用,GT-/-/hCD47-PAEC可明显抑制人巨噬细胞的杀伤作用(P<0.05)。结论在猪内皮细胞中表达hCD47可以通过激活SIRPα的磷酸化抑制人巨噬细胞对内皮细胞的杀伤作用。 展开更多
关键词 异种移植 CD47 信号调节蛋白α 人巨噬细胞 内皮细胞 磷酸化 免疫排斥反应
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起落架缓冲器上支臂支座断裂分析 预览
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作者 侯卫国 袁春 +1 位作者 登科 王超 《失效分析与预防》 2019年第3期184-187,共4页
主起落缓冲器疲劳试验中,缓冲器上支臂支座断裂。通过对支座材料成分、硬度和金相组织检测分析,以及断口宏微观形貌观察、断口能谱分析等,研究断口的断裂特征和裂纹源产生、扩展、断裂过程。结果表明,该支座在摩擦产生的高温条件下,Cd2... 主起落缓冲器疲劳试验中,缓冲器上支臂支座断裂。通过对支座材料成分、硬度和金相组织检测分析,以及断口宏微观形貌观察、断口能谱分析等,研究断口的断裂特征和裂纹源产生、扩展、断裂过程。结果表明,该支座在摩擦产生的高温条件下,Cd2+渗入基体形成共晶体,从而产生疲劳源;在交变应力的作用下,疲劳源发生隔脆,形成裂纹源,裂纹扩展导致断裂。根据支座断裂原因及使用环境,建议调整该支臂的表面处理工艺,配合面可采用镀锌等工艺,或采用其他防腐蚀能力较强的超高强度钢。 展开更多
关键词 缓冲器 上支臂支座 镉脆 疲劳断裂 起落架
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FAH基因敲除克隆小型猪的制备及繁育 预览
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作者 王莎莎 朱辉斌 +1 位作者 卢晟盛 登科 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第5期29-37,共9页
目的供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditarytyrosinemiatypeⅠ,HTⅠ),致使患者肝... 目的供体的短缺是器官移植所面临的主要问题,制备人源化器官是解决此问题的有效途径之一。缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH)会引起遗传性酪氨酸血症Ⅰ型(hereditarytyrosinemiatypeⅠ,HTⅠ),致使患者肝细胞凋亡,呈现出肝损伤。对猪(Susscrofa)进行基因编辑,建立FAH基因敲除巴马小型猪,结合人干细胞将有利于人源化干细胞肝的制备。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1 )敲除巴马小型猪的基础上,通过CRISPR/Cas9技术制备FAH基因敲除(FAH^+/-、FAH^-/-)小型猪,并分析其健康与繁育状况。方法针对猪 FAH 基因设计单链导向 RNA (single guide RNA,sgRNA)构建 pX330表达载体转染巴马小型猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama minipigs, BMEF)并进行敲除效率验证,鉴定后选择阳性细胞作为核供体,通过体细胞核移植技术制备 FAH 基因敲除巴马小型猪。提取仔猪的基因组DNA,经PCR测序后得到突变类型;采集5月龄FAH+/-巴马小型猪血液,检测其血生化与血常规指标并观察肝组织学染色切片;当FAH^+/-巴马小型猪公猪性成熟后,与野生型(wild type, WT)母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况。结果得到了FAH^+/-巴马小型猪,Westernblot显示FAH+/-巴马小型猪的肝和肾中FAH的表达量均有所下降;FAH^+/-猪与野生型相比,FAH^+/-猪血液理化指标无显著差异;组织学切片染色发现FAH^+/-猪肝组织形态出现空泡样变化;与FAH^+/-公猪配种的野生母猪产仔数正常;FAH^+/-猪具有正常的健康状况和繁育能力。结论本研究制备出了 FAH 单基因敲除小型猪,健康状况及繁育能力正常,该单基因敲除猪为将来制备出双等位基因敲除猪与人源化肝的研究提供了良好基础。 展开更多
关键词 小型猪 基因敲除 延胡索酸乙酰乙酸水解酶(FAH) CRISPR/Cas9 繁育 器官移植 人源化肝
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流式细胞术检测供体猪α-1,3-Gal和人源CD46的表达 预览
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作者 杜敏杰 魏静 +1 位作者 臧荣鑫 登科 《实用器官移植电子杂志》 2018年第5期375-379,共5页
目的检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46(hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集500μl野生型(wild type,WT)、α—1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、hCD46和GTK... 目的检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46(hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集500μl野生型(wild type,WT)、α—1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、hCD46和GTKO/hCD46巴马小型猪血液,分离外周血单核细胞(peripheral blood inononuclear cell,PBMCo异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(FITC—GSIB4)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测α-Gal抗原敲除情况,异硫氰酸荧光素标记的hCD46膜辅蛋白抗体(anti—CD46-FITC)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测hCD46蛋白表达情况。结果GTKO和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面α—Gal检测呈阴性,WT和hCD46巴马猪检测呈阳性,与测序结果一致;hCD46和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面hCD46蛋白检测呈阳性,WT和GTKO巴马猪检测呈阴性,与PCR鉴定结果一致。结论建立了微量血液流式细胞术直观检测供体猪α-Gal抗原和人源CD46蛋白表达的方法。 展开更多
关键词 α-1 3-半乳糖基转移酶 人源蛋白CD46 外周血单核细胞 流式细胞术
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血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白转基因猪的研究
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作者 田兴华 王梦佳 登科 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期556-563,共8页
生理条件下,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)可与凝血酶结合成复合物,该复合物既可通过激活蛋白C达到抗凝和促纤溶作用;又可经内皮细胞胞吞,通过细胞内溶酶体降解、清除体内凝血酶。另外,TM可与凝血因子Xa特异性结合,抑制凝血酶原的... 生理条件下,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)可与凝血酶结合成复合物,该复合物既可通过激活蛋白C达到抗凝和促纤溶作用;又可经内皮细胞胞吞,通过细胞内溶酶体降解、清除体内凝血酶。另外,TM可与凝血因子Xa特异性结合,抑制凝血酶原的活化,进而使凝血酶的生成速率明显降低。移植后,猪(Sus scrofa)的血管暴露在人(Homo sapiens)血液中,猪TM无法与人的凝血酶发生结合从而使凝血功能紊乱,因此,在猪体内表达人TM是目前解决凝血功能异常的一个新的思路。本研究制备了血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的转基因克隆猪,研究了hTM在五指山小型猪血管内皮细胞表达情况。利用Red重组系统从细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)上抓捕获得猪的内源TM启动子。PCR扩增获得hTM的c DNA及牛生长素Poly A(b GHp A)序列,依次酶切连入p Blue ScriptⅨSK(-),构建血管内皮特异性表达hTM的载体。获得的载体p BS-hTM-puro经XhoⅨ线性化,电转染五指山小型猪胎儿成纤维细胞,经1.0μg/m L嘌呤霉素筛选10~15 d得到339个转hTM基因的阳性克隆,取两个生长较好的克隆用于核移植,随后获得重构胚972枚。胚胎移植后产仔猪5头;其中4头经基因组DNA、组织RT-PCR检验为阳性,Western blot结果显示hTM为血管内皮细胞特异性表达。成功获得可特异性表达hTM转基因细胞系及转基因克隆猪,为解决异种器官移植后出现的凝血紊乱问题提供了资料基础。 展开更多
关键词 异种移植 血栓调节蛋白 特异性表达 五指山小型猪
用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制 预览
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作者 王丹丹 唐雨婷 +3 位作者 马月辉 王立刚 登科 蒋琳 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第7期1390-1400,共11页
【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘... 【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Sus_scrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪(P&lt;0.05),与ZBED6-WT猪相比,ZBED6-KO猪肌纤维的宽度较宽,结缔组织较少,ZBED6基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组(x1、x3、x6)的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组(x2、x4、x5)的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和Rho A信号等相关的通路;q RT-PCR检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了R 展开更多
关键词 ZBED6 基因敲除 RNA-SEQ 心肌发育 差异表达基因
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锌指蛋白6(ZBED6)研究进展 预览
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作者 解文雅 张传海 +1 位作者 登科 贺晓云 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2018年第11期50-55,共6页
锌指蛋白6(ZBED6)基因是新发现的一个转录调控因子,与肌肉的生长发育密切相关,可调控胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)在内的多种基因的表达:为哺乳动物特有,序列高度保守。IGF2作为重要的生长调节因子,内含子3区... 锌指蛋白6(ZBED6)基因是新发现的一个转录调控因子,与肌肉的生长发育密切相关,可调控胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)在内的多种基因的表达:为哺乳动物特有,序列高度保守。IGF2作为重要的生长调节因子,内含子3区域可与ZBED6结合,ZBED6的结合可抑制IGF2表达,进而调控细胞的增殖分化和肌肉的生长发育。总结了目前对ZBED6基因的生理功能研究进展,已有研究表明ZBED6可抑制IGF2的表达,促进骨骼肌、心脏、肝脏、肾脏等器官的生长发育,降低脂肪沉积,体内蛋白质、脂质等生物大分子的代谢过程也随之发生变化,ZBED6在糖尿病、癌症的发展过程中均发挥着重要的调控作用。此外,还总结了影响ZBED6表达的多种因素,包括碱基突变、DNA甲基化、组蛋白修饰以及回文序列等。最后,展望了ZBED6的实际应用潜力,其作为一个与肌肉生长发育密切相关的转录因子,可通过敲除ZBED6促进肌肉生长,为瘦肉型动物的遗传育种提供了新的思路。 展开更多
关键词 锌指蛋白6 胰岛素样生长因子2 生长发育
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异种肝移植手术前后移植肝差异表达基因的筛选及验证 预览
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作者 李霄 纪洪辰 +3 位作者 登科 周亮 窦科峰 陶开山 《实用器官移植电子杂志》 2018年第5期349-354,共6页
目的探讨异种移植手术前后移植肝内差异表达基因的变化,并且进行筛选及验证。方法以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、藏酋猴为受体,完成4咧异种睥窝辅助性肝移植手术。于供肝修整时切取适量术前标本,于移植肝... 目的探讨异种移植手术前后移植肝内差异表达基因的变化,并且进行筛选及验证。方法以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、藏酋猴为受体,完成4咧异种睥窝辅助性肝移植手术。于供肝修整时切取适量术前标本,于移植肝开放血流后48小时以肝穿刺活检获得术后标本。对手术前后的移植肝标本进行miRNAs和mRNAs的高通量芯片分析,筛选出关键的差异表达miRNAs和mRNAs,并进行实时定量PCR及WesternBlot实验验证。结果与术前相比,有165个miRNAs在术后出现差异表达,其中上调分子112个,下调分子53个。筛选并验证mi-23b等12个出现显著差异表达的miRNAs,除miR-150和miR-126—3p外,其他miRNAs的表达变化情况与miRNAs芯片结果基本相符。与术前相比,有2035个mRNAs在术后出现显著差异表达,其中922个表达上调、1113个表达下调,筛选IGFBP6、CDK2AP1、TNFAIP6、FVII、NKG2D等5个生物学功能与肝脏移植密切相关的差异表达基因进行mRNA和蛋白水平验证。除NKG2D外,其他4个基因的蛋白水平表达变化与mRNA水平变化基本一致(均P〈0.05),但CDK2AP1的蛋白变化幅度较小,差异无统计学差异(P=O.073)。结论异种肝移植术后移植肝的miRNAs和mRNAs表达出现较大变化,这些差异表达基因可能与免疫损伤及凝血功能障碍有关。 展开更多
关键词 异种移植 肝脏移植 小型猪 藏酋猴 微小核糖核酸 信使RNA
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CRISPR/Cas9介导CMAH基因敲除猪创制及繁育分析 被引量:2
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作者 黄林华 李西睿 +6 位作者 龙川 石宁宁 冯冲 杜敏杰 朱辉斌 登科 孙秀柱 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1064-1073,共10页
N-羟乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Gc)是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖抗原,由单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成。本研究以α-1,3-... N-羟乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Gc)是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖抗原,由单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成。本研究以α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪为基础,利用CRISPR/Cas9制备CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴马小型猪(Sus scrofa),并评估其健康及繁育状况。针对猪CMAH基因设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)并进行效率验证,敲除效率较高的CMAH-g1电转染巴马猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama mini pigs,BMEF),鉴定为阳性的细胞作为核供体,利用体细胞核移植技术制备CMAH~(-/-)猪。提取仔猪基因组DNA,PCR测序确定突变类型;用Anti-Neu5Gc抗体进行免疫荧光检测确定仔猪器官Neu5Gc表达情况。采集4月龄CMAH~(-/-)巴马猪血液检测其生理指标;CMAH~(-/-)巴马公猪6月龄性成熟后配种,以母猪的产仔数评价CMAH~(-/-)公猪的繁育能力。结果成功获得CMAH~(-/-)巴马猪,有-2 bp/-2 bp和-1 bp/-1 bp共2种纯合敲除类型。免疫荧光检测结果显示在CMAH~(-/-)猪器官表面未检到Neu5Gc表达,表明CMAH基因被敲除。与野生型(wild type,WT)相比,CMAH~(-/-)猪血常规和血生化无显著差异,与CMAH~(-/-)公猪配种的母猪产仔数正常。本研究利用CRISPR/Cas9技术制备了GGTA1/CMAH基因敲除猪,健康状况和繁育能力正常,该猪可为进一步降低异种器官移植急性排斥反应提供低免疫原性供体。 展开更多
关键词 单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH) N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc) CRISPR/Cas9 产仔数 异种移植
猪Rosa26位点敲入Loxp修饰的hCD55成纤维细胞系的建立
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作者 张超 石宁宁 +6 位作者 高景波 杜敏杰 张译夫 王煜 朱辉斌 登科 刘霞 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1074-1083,共10页
人补体调节蛋白(human complement regulatory protein,h CRP)基因,如人类簇分化抗原55(human cluster of differentiation 55,hCD55),在异种器官移植中尤为重要。本研究在α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA... 人补体调节蛋白(human complement regulatory protein,h CRP)基因,如人类簇分化抗原55(human cluster of differentiation 55,hCD55),在异种器官移植中尤为重要。本研究在α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)巴马小型猪(Sus scrofa)耳成纤维细胞的基础上,利用CRISPR/Cas9技术在猪Rosa26(reverse orientation splice acceptorβ-geo26)基因座敲入hCD55基因,以制备hCD55基因高效表达的细胞系。分别构建靶向切割pRosa26位点intron 1(内含子1)的Cas9表达载体,及pRosa26位点同源重组hCD55的表达载体,后者包含异源Loxp位点间的EF1α(polypeptide chain elongation factor 1α)启动子调控的hCD55基因、潮霉素B磷酸转移酶基因(hygromycin B phosphotransferase,HPH)、胸腺激酶基因(thymidine kinase,TK)为正负筛选基因。将Cas9-Rosa26表达载体和p EF1α-hCD55表达载体共电转染猪耳成纤维细胞系,培养液中加入丙氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)和潮霉素(hygromycin,Hyg)进行筛选,培养至单细胞克隆。通过跨5'端和3'端同源臂的两对引物PCR检测目的基因整合情况,反转录(reverse transcription PCR,RT-PCR)和Western blot检测hCD55在细胞中的表达情况。药物筛选后得到94个克隆点,经PCR鉴定,定点整合hCD55的阳性克隆点2个,定点整合效率为2.1%。RT-PCR结果显示,阳性克隆点细胞表达hCD55基因,Western blot结果进一步证实hCD55在细胞有表达。本研究在GTKO巴马小型猪耳成纤维细胞系基础上成功构建了表达目的基因hCD55的细胞系,为异种移植供体猪的制备提供了基础资料。 展开更多
关键词 pRosa26 hCD55 CRISPR/Cas9 异种移植 LOXP
胰岛特异表达LEA29Y转基因猪继代遗传分析
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作者 邢向阳 于淑珍 +2 位作者 朱辉斌 登科 杨纯 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1084-1092,共9页
LEA29Y是一种能够高效抑制T细胞活性的新型人工融合蛋白,胰岛表达LEA29Y的转基因猪(Sus scrofa)用于胰岛移植可以阻断T细胞激活的共刺激通路,降低胰岛移植术后人体内T细胞介导的免疫排斥反应,课题组已制备胰岛特异表达LEA29Y的转基因... LEA29Y是一种能够高效抑制T细胞活性的新型人工融合蛋白,胰岛表达LEA29Y的转基因猪(Sus scrofa)用于胰岛移植可以阻断T细胞激活的共刺激通路,降低胰岛移植术后人体内T细胞介导的免疫排斥反应,课题组已制备胰岛特异表达LEA29Y的转基因猪。LEA29Y在转基因猪中能否稳定遗传及表达是建立该转基因猪品系的重要鉴定内容,目前尚待明确。本研究连续跟踪2代LEA29Y转基因猪的遗传与表达情况,旨在培育异种胰岛移植的胰岛特异表达LEA29Y转基因猪品系。通过1公(编号81)2母(编号77、83)共3头LEA29Y原代猪(F0代)相互配种或与野生型猪配种进行繁育,得到F1代猪群;F1代阳性个体与野生型猪进行繁育,获得F2代猪群。用PCR对仔猪进行转基因鉴定,反转录PCR(reverse transcriptionPCR,RT-PCR)、免疫组化及免疫荧光染色分析LEA29Y在转基因猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉等组织的表达,特别是分析LEA29Y在胰岛的特异性表达。通过繁育建立77、81、83 3个LEA29Y转基因猪支系,繁育正常,共获得95头子代猪,PCR检测53头为阳性。77和83支系中RT-PCR显示F0代77、83LEA29Y表达渗漏;81支系中F0代个体81、F1代个体271 RT-PCR、免疫组化及免疫荧光结果均显示为胰岛特异表达LEA29Y,继代遗传稳定。本研究成功筛选出了遗传稳定的LEA29Y转基因猪品系,可作为异种胰岛移植研究的可靠供体。 展开更多
关键词 异种胰岛移植 LEA29Y 胰岛特异表达 遗传分析
克隆猴在中国率先突破,到底靠的是什么? 被引量:1
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作者 登科 《科技导报》 CSCD 北大核心 2018年第5期23-27,共5页
中国科学家孙强研究团队利用类似克隆羊多莉的体细胞克隆技术,在国际上率先获得了克隆猴的成功,这一成果于2018年1月25日发表在《Cell》上。本文回顾了克隆猴的技术流程和难点、体细胞克隆动物简史及国内外克隆猴不成功的历史,点评了克... 中国科学家孙强研究团队利用类似克隆羊多莉的体细胞克隆技术,在国际上率先获得了克隆猴的成功,这一成果于2018年1月25日发表在《Cell》上。本文回顾了克隆猴的技术流程和难点、体细胞克隆动物简史及国内外克隆猴不成功的历史,点评了克隆猴成功的关键和意义,指出需要更多的实验室来推动该技术的优化。 展开更多
关键词 克隆动物 克隆猴 体细胞核移植
CRISPR/Cas9介导的β4GalNT2基因敲除猪制备 被引量:5
13
作者 唐雨婷 高景波 +4 位作者 龙川 杜敏杰 黄林华 登科 杜晓华 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第10期1697-1705,共9页
猪(Sus scrofa)β1,4 N-乙酰半乳糖胺转移酶(β1,4 N-acetylgalactosaminyl transferase,β4GalNT2)及其产物是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖(Gal)抗原之一。为了进一步降低异种移植排斥反应,本研究在α-1,3-半乳糖基转移... 猪(Sus scrofa)β1,4 N-乙酰半乳糖胺转移酶(β1,4 N-acetylgalactosaminyl transferase,β4GalNT2)及其产物是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖(Gal)抗原之一。为了进一步降低异种移植排斥反应,本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的巴马小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)技术制备β4GalNT2基因敲除猪。首先设计靶向猪β4GalNT2基因的单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA),构建sgRNA表达载体,将其电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,进行单细胞培养,采用PCR、TA克隆及测序的方法鉴定单细胞克隆的突变类型。选择β4GalNT2基因突变的单细胞克隆为核供体,通过体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术制备β4GalNT2基因敲除猪,利用上述鉴定单细胞克隆突变类型的方法对仔猪β4GalNT2基因突变类型进行鉴定。分离仔猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),与异硫氰酸荧光素标记的双花扁豆凝集素(fluorescein isothiocyanate conjugated Dolichos biflorus agglutinin,FITC-DBA)共孵育,检测仔猪β4GalNT2的表达。使用软件Optimized CRISPR Design预测sgRNA的潜在脱靶位点,PCR产物测序进行脱靶检测。结果显示,单细胞培养获得的25个β4GalNT2单细胞克隆中有14个发生基因突变。克隆胚胎移植2头受体母猪,其中1头妊娠至终期并产仔猪1头,仔猪β4GalNT2基因突变类型为-6 bp/-13 bp/WT。仔猪PBMC与FITC-DBA共孵育无绿色荧光,表明仔猪β4GalNT2基因已失活。脱靶分析结果显示,β4GalNT2基因敲除仔猪的sgRNA潜在脱靶位点均未发生突变。总之,本研究利用CRISPR/Cas9技术在国内首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2基因敲除猪,有望减轻异种移植抗体介导排斥反应,为临床器官移植的应用研究提供了良好的研究材料。 展开更多
关键词 β1 4 N-乙酰半乳糖胺转移酶(β4GalNT2) 基因敲除猪 规律成簇间隔短回文重复/Cas9(CRISPR/Cas) 非半乳糖(Gal)抗原 异种移植排斥反应
人血清中非Gal异种抗体检测方法的探讨 预览 被引量:2
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作者 叶学军 卢希彬 +3 位作者 登科 蔡志明 牟丽莎 赵成江 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期132-137,共6页
目的 探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的最佳检测条件。方法选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8%、16.7%、100%)和孵育时间... 目的 探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的最佳检测条件。方法选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8%、16.7%、100%)和孵育时间(0.5、1.0、2.0、3.0、6.0 h)条件下,利用流式细胞仪检测GTKO猪的PBMC上结合IgM和IgG的水平。结果 在16.7%血清浓度下,孵育时间从0.5 h延长至3.0 h,能显著提高非Gal IgM结合PBMC的水平(P〈0.01),而IgG水平的提高则差异无统计学意义(P〉0.05)。提高血清浓度也可提高非Gal IgM的结合水平,采用100%的血清浓度孵育3 h,IgM结合PBMC水平最高且有统计学意义(P〈0.01)。采用100%的血清孵育6 h,IgG结合水平升高有统计学意义(P〈0.05)。延长孵育时间和提高血清浓度不会影响PBMC的活力。结论检测人血清中抗非Gal异种抗原抗体的最佳条件为每1×105个猪PBMC,采用100%人血清浓度孵育3 h检测IgM水平,或加100%人血清浓度孵育6 h检测IgG水平。这一条件的优化有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。 展开更多
关键词 异种移植 外周血单核细胞 非Gal抗原 流式细胞术 IgM/IgG α-1 3-半乳糖基转移酶 基因敲除 五指山小型猪
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GGTA1基因敲除巴马小型猪的繁育及健康水平检测
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作者 高景波 唐雨婷 +5 位作者 龙川 蒋应弟 石宁宁 冯冲 登科 刘霞 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第10期1706-1713,共8页
用于异种器官移植供体研究的α-1,3半乳糖苷转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪(Sus scrofa)的繁育性能和健康状态是异种器官移植之路能否成功的前提。为了观察本课题组制备的GGTA1基因敲除(GGTA1 knockout,GTK... 用于异种器官移植供体研究的α-1,3半乳糖苷转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪(Sus scrofa)的繁育性能和健康状态是异种器官移植之路能否成功的前提。为了观察本课题组制备的GGTA1基因敲除(GGTA1 knockout,GTKO)巴马小型猪(Bama minipig,BMP)的遗传基因型、窝产仔数及其血常规和血生化指标变化,评估其繁殖和健康状况,本研究对其进行定向培育,并繁育到F3代,通过PCR产物测序鉴定仔猪GGTA1基因敲除类型,异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(fluorescein isothiocyanate-griffonia simplicifolia isolectin B4,FITC-GSIB4)与仔猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)孵育后流式细胞术检测α-1,3半乳糖苷(α-1,3-galactosidase,α-1,3-Gal)的表达,以窝产仔数测定繁殖力,以血常规和血生化检测反映健康状况。结果显示,GGTA1基因的遗传符合孟德尔分离定律;GGTA1敲除纯合子(GGTA~(1-/-))仔猪的流式检测荧光强度低;GGTA~(1-/-)巴马猪母猪头胎窝产仔数为7.33±1.70头,经产母猪窝产仔数为9.43±1.68头,与已有报道的普通巴马小型猪繁殖力无明显差异;血常规和血生化检测的各项指标与普通巴马猪基本无差异。本研究建立了GTKO巴马小型猪家系,GTKO巴马小型猪遗传稳定,繁殖力正常,生理健康,GGTA~(1-/-)巴马小型猪有效解决了超急性排斥反应。研究结果为异种器官移植研究提供了良好供体。 展开更多
关键词 α-1 3半乳糖苷转移酶基因(GGTA1) 巴马小型猪(BMP) 繁殖力 生理健康
SCARB1介导异种肝移植术后受体凝血功能调节障碍的研究 预览
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作者 李霄 纪洪辰 +5 位作者 窦科峰 登科 陈辉 周亮 陶开山 刘正才 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期115-120,共6页
目的探讨清道夫受体B组1型分子(SCARB1)在异种肝移植手术前、后移植肝组织内的表达变化及其与受体凝血功能调节障碍的关系。方法以α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪为供体,藏酋猴为受体,建立异种异位辅助性肝移植模... 目的探讨清道夫受体B组1型分子(SCARB1)在异种肝移植手术前、后移植肝组织内的表达变化及其与受体凝血功能调节障碍的关系。方法以α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪为供体,藏酋猴为受体,建立异种异位辅助性肝移植模型,并收集移植手术前、后移植肝脏组织标本。以胶原酶消化法提取原代猪肝细胞,免疫磁珠分离人外周血单核细胞,将两者混合培养并加入人血浆,建立异种肝移植术后凝血功能调节障碍的细胞模型。以实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测并对比组织及细胞标本中SCARB1的信使核糖核酸(mR NA)及蛋白质表达情况。最后在细胞水平以慢病毒载体干预SCARB1的表达,并检测凝血时间以验证其对凝血功能的影响。结果与术前组织标本比较,术后移植肝组织内SCARB1的mR NA和蛋白表达均显著下调(均为P〈0.05)。在细胞模型中,与未干预猪肝细胞比较,经人单核细胞共培养后的猪肝细胞内SCARB1的mR NA和蛋白表达也出现显著下调(均为P〈0.05)。与干预组比较,应用慢病毒过表达猪肝细胞内SCARB1的表达后,凝血时间显著延长(均为P〈0.05)。结论移植肝组织内SCARB1的下调是介导受体凝血功能调节障碍的重要原因之一,对其干预有助于纠正异种肝移植术后受体凝血功能调节障碍。 展开更多
关键词 清道夫受体B组1型分子 异种移植 肝移植 凝血功能 五指山小型猪 藏酋猴
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敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因五指山小型猪的繁育和鉴定 预览 被引量:2
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作者 龙川 高景波 +5 位作者 唐雨婷 杜敏杰 石宁宁 冯冲 鲁琳 登科 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期121-126,共6页
目的 总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流... 目的 总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流式细胞术对人、野生型五指山小型猪、GTKO五指山小型猪外周血单核细胞(PBMC)的α-1,3-半乳糖(αGal)表型进行检测;比较GTKO五指山小型猪与野生型五指山小型猪血常规指标的差异。结果 GGTA1基因型的遗传符合孟德尔定律;GGTA1-/-猪的PBMC流式检测无荧光表达,与基因型鉴定结果一致;GTKO五指山小型猪雌性猪初产窝产仔数为(6.8±1.8)只,经产窝产仔数为(8.3±2.2)只;血常规检测的各项指标与野生型五指山小型猪差异均无统计学意义(均为P〉0.05)。结论 连续2代GTKO五指山小型猪遗传稳定,繁殖力正常。GTKO五指山小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。 展开更多
关键词 α-1 3-半乳糖基转移酶 基因敲除 五指山小型猪 繁殖性能 α-1 3-半乳糖表型 外周血单核细胞
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一种应用于4G通信的小型多频手机天线 预览
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作者 宋盼 谢亚楠 +2 位作者 登科 刘志昆 耿莉 《上海大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2017年第4期535-542,共8页
提出了一种新型的应用于4G通信的小型多频手机天线.利用折叠单极子、多枝节谐振等技术使天线谐振在多个频段.天线结构紧凑(32 mm×15 mm×0.8 mm),由两个折叠单极子组成,长度均约为1/4谐振波长,其中倒C形枝节谐振在2 GHz附近,... 提出了一种新型的应用于4G通信的小型多频手机天线.利用折叠单极子、多枝节谐振等技术使天线谐振在多个频段.天线结构紧凑(32 mm×15 mm×0.8 mm),由两个折叠单极子组成,长度均约为1/4谐振波长,其中倒C形枝节谐振在2 GHz附近,倒F形枝节谐振在900 MHz附近.天线通过50?匹配传输线直接馈电,两个枝节共同叠加耦合辐射,实现带宽810-971 MHz和1 495-2 786 MHz,覆盖了GSM 850/900/DCS/PCS/UMTS/LTE 2300/2500频段,符合4G通信手机天线的标准.对天线进行了加工和测试,测试结果与仿真结果基本吻合. 展开更多
关键词 手机天线 单极子天线 小型多频天线 4G
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计算机网络技术在图书馆网站方面的应用研究 预览 被引量:4
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作者 登科 《科技传播》 2017年第18期73-74,共2页
随着时代的发展,人类社会也快速发展起来,互联网技术也取得了显著的成果。互联网技术在各个领域的应用更加广泛,其中就有文化知识的应用,在文化知识这个要素来说,图书馆是它的必不可少的载体。当前,计算机网络技术在图书馆网站方面的研... 随着时代的发展,人类社会也快速发展起来,互联网技术也取得了显著的成果。互联网技术在各个领域的应用更加广泛,其中就有文化知识的应用,在文化知识这个要素来说,图书馆是它的必不可少的载体。当前,计算机网络技术在图书馆网站方面的研究深入人心,它一方面提高着图书馆工作的效率,又不断改变着传统的图书馆运作模式,对于图书馆网站的服务水平的提高起着重要的作用。本文主要是探讨计算机网络技术在图书馆网站方面的应用研究。 展开更多
关键词 图书馆 网站 计算机网络技术 应用
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GGTA1-/-五指山小型猪SLAI类基因分子特征及与HLA相似性分析 预览
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作者 蒋应弟 曾国敏 +4 位作者 石宁宁 李西睿 纪慧丽 登科 滚双宝 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期375-380,共6页
目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类... 目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLA I类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。结果测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中4条为已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403),另2条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变(T→S、T→M),其他位点高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102与人HLA I类基因NK细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。结论从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。 展开更多
关键词 GGTA1-/- 五指山小型猪 SLA 异种移植 免疫排斥
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