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改良单细胞核固定和荧光原位杂交技术在卵裂期胚胎性别诊断中的应用
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作者 李红星 景原雪 +8 位作者 马晓玲 宋德潇 孙亮 岳丰 王乃辉 靳怡 刘瑞芳 薛石龙 《兰州大学学报:医学版》 CAS 2018年第1期34-37,共4页
目的 建立一种快速便捷的单细胞核固定和荧光原位杂交(FISH)检测技术用于性别筛选,探究其可行性,同时分析植入前胚胎中非整倍体和嵌合体的发生情况。方法 解冻12位患者32枚胚胎,同时选择同期常规冻融胚胎移植周期23位患者51枚胚胎为... 目的 建立一种快速便捷的单细胞核固定和荧光原位杂交(FISH)检测技术用于性别筛选,探究其可行性,同时分析植入前胚胎中非整倍体和嵌合体的发生情况。方法 解冻12位患者32枚胚胎,同时选择同期常规冻融胚胎移植周期23位患者51枚胚胎为囊胚培养对照组。激光打孔法活检卵裂期胚胎,每枚胚胎常规活检吸取2个卵裂球,活检后胚胎继续培养囊胚。改良吐温-20/HCl法游离和固定卵裂球细胞核,XY染色体计数探针和18号染色体计数探针同时孵育后荧光镜下观察结果。结果 32枚胚胎中,X、Y和18号染色体正常胚胎24枚,正常率75%;异常胚胎8枚,其中6例为嵌合体胚胎,嵌合体率18.8%。活检组与囊胚培养对照组的囊胚形成率和优质囊胚率比较,差异无统计学意义(P〉0.05)。结论 本实验所建立的改良单细胞核固定和FISH技术能够快速有效地对卵裂期胚胎进行性别选择,对解决性染色体异常和性连锁性疾病性别诊断的生育障碍有一定价值。 展开更多
关键词 荧光原位杂交技术 胚胎植入前遗传学诊断 单细胞固定 性别诊断
GGTA1基因敲除巴马小型猪的繁育及健康水平检测
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作者 高景波 唐雨婷 +5 位作者 龙川 石宁宁 冯冲 潘登科 刘霞 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第10期1706-1713,共8页
用于异种器官移植供体研究的α-1,3半乳糖苷转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪(Sus scrofa)的繁育性能和健康状态是异种器官移植之路能否成功的前提。为了观察本课题组制备的GGTA1基因敲除(GGTA1 knockout,GTK... 用于异种器官移植供体研究的α-1,3半乳糖苷转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪(Sus scrofa)的繁育性能和健康状态是异种器官移植之路能否成功的前提。为了观察本课题组制备的GGTA1基因敲除(GGTA1 knockout,GTKO)巴马小型猪(Bama minipig,BMP)的遗传基因型、窝产仔数及其血常规和血生化指标变化,评估其繁殖和健康状况,本研究对其进行定向培育,并繁育到F3代,通过PCR产物测序鉴定仔猪GGTA1基因敲除类型,异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(fluorescein isothiocyanate-griffonia simplicifolia isolectin B4,FITC-GSIB4)与仔猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)孵育后流式细胞术检测α-1,3半乳糖苷(α-1,3-galactosidase,α-1,3-Gal)的表达,以窝产仔数测定繁殖力,以血常规和血生化检测反映健康状况。结果显示,GGTA1基因的遗传符合孟德尔分离定律;GGTA1敲除纯合子(GGTA~(1-/-))仔猪的流式检测荧光强度低;GGTA~(1-/-)巴马猪母猪头胎窝产仔数为7.33±1.70头,经产母猪窝产仔数为9.43±1.68头,与已有报道的普通巴马小型猪繁殖力无明显差异;血常规和血生化检测的各项指标与普通巴马猪基本无差异。本研究建立了GTKO巴马小型猪家系,GTKO巴马小型猪遗传稳定,繁殖力正常,生理健康,GGTA~(1-/-)巴马小型猪有效解决了超急性排斥反应。研究结果为异种器官移植研究提供了良好供体。 展开更多
关键词 α-1 3半乳糖苷转移酶基因(GGTA1) 巴马小型猪(BMP) 繁殖力 生理健康
IVF-ET卵巢高反应患者行囊胚移植的临床结局分析 被引量:1
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作者 李红星 薛石龙 +8 位作者 景原雪 宋德潇 王乃辉 孙亮 岳丰 靳怡 刘瑞芳 张学红 《中国优生与遗传杂志》 2017年第11期119-121,128共4页
目的探讨体外受精-胚胎移植卵巢高反应患者行囊胚移植的妊娠结局和应用价值。方法回顾性分析2016年5月至2017年2月在我院生殖中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的不孕患者资料,卵巢过度刺激综合征(OHSS)高风险患者行双卵裂胚移... 目的探讨体外受精-胚胎移植卵巢高反应患者行囊胚移植的妊娠结局和应用价值。方法回顾性分析2016年5月至2017年2月在我院生殖中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的不孕患者资料,卵巢过度刺激综合征(OHSS)高风险患者行双卵裂胚移植84个周期(A组),行普通单囊胚移植58个周期(非优质囊胚),行单优质囊胚移植40个周期,比较三组患者常规临床特征、超促排卵情况、胚胎发育质量、临床妊娠率、种植率、多胎率、中重OHSS发生率。结果三组不孕患者体重指数、基础FSH、Gn使用量、Gn使用时间、HCG注射日E2/P水平、获卵数、受精率、卵裂率等相互比较均无统计学意义(P〉0.05)。单优质囊胚组的妊娠率显著高于双卵裂胚移植组和单囊胚移植组(P〈0.05)。双卵裂胚移植组的种植率显著低于单囊胚移植组和单优质囊胚组(P〈0.05),同时双卵裂胚移植组的多胎率显著高于其他两组(P〈0.01)。双卵裂胚移植组的中重度OHSS发生率为10.67%,高于其他两组,差异具有统计学意义(P〈0.05)。结论卵巢过度刺激综合征高风险患者行单囊胚移植可以减小0HSS及多胎妊娠的发生,且不影响临床妊娠率。 展开更多
关键词 体外受精-胚胎移植 卵巢过度刺激综合征 妊娠率 囊胚移植
‘合作猪’TDRP1基因的克隆及生物信息学分析 预览 被引量:1
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作者 滚双宝 +2 位作者 袁慧芳 曾国敏 高景波 《甘肃农业大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第4期1-6,共6页
【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特... 【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特性.【结果】获得了TDRP1基因完整的CDS序列(GenBank登录号:KU743254),共684bp,其编码186个氨基酸多肽.与参考序列相比,在编码区第33、348位点处发生了同义突变(C→G、C→T).TDRP1基因分子式为C897H1421N259O287S2,理论等电点(PI)为5.86,不稳定系数为62.66,疏水指数为64.03,平均亲水性为-0.939,属不稳定可溶性酸性蛋白质.二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,属混合类蛋白质.亚细胞定位结果显示,TDRP1编码的蛋白质在遗传物质复制和转录、翻译过程中发挥功能的可能性分别为26.3%、14.3%,明显高于发挥其它功能的可能性.mRNA表达分析表明,TDRP1基因在垂体和睾丸中高表达,肺、肾、小脑、卵巢中度表达,肝、脾、大脑、胃、小肠中低表达,心脏组织中不表达.【结论】成功克隆了‘合作猪’TDRP1基因的完整CDS区序列,并发现了2个SNP位点;多组织转录表达分析表明TDRP1在垂体和睾丸中表达较高,可为深入研究TDRP1基因的功能提供参考. 展开更多
关键词 合作猪 TDRP1基因 精子 生物信息学分析
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CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备 被引量:1
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作者 李西睿 冯冲 +7 位作者 龙川 纪慧丽 魏静 石宁宁 曾国敏 潘登科 田兴华 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1243-1250,共8页
猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的... 猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1(single guide RNA1,sg RNA1),将sg RNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73%。选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达。对sg RNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象。总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料。 展开更多
关键词 规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9) 去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1) 异种肝移植 体细胞核移植 基因敲除猪
GGTA1-/-五指山小型猪SLAI类基因分子特征及与HLA相似性分析 预览
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作者 曾国敏 +4 位作者 石宁宁 李西睿 纪慧丽 潘登科 滚双宝 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期375-380,共6页
目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类... 目的明晰α-1,3半乳糖基转移酶基因敲除(GGTA1-/-)的五指山小型猪SLA经典I类基因分子结构特征及其与人HLA的相似性,对研究异种器官移植细胞性排斥反应具有重要意义。方法采集6头祖代GGTA1-/-五指山小型猪耳组织,利用RT-PCR对SLA I类基因(SLA-1、SLA-3、SLA-2)扩增、克隆及测序,对序列进行BLAST分析,并采用生物信息学方法对SLA I类基因分子结构特征及其与人HLA的同源性进行分析。结果测序分析表明,共获得6条等位基因序列,其中4条为已公布的等位基因(SLA-1*0703、SLA-2*1102、SLA-3*0401、SLA-3*0403),另2条为新等位基因(SLA-1*0401wz01、SLA-2*11wz01)。五指山小型猪与人HLA同源性为70.5%~72.1%。SLA-1*0401wz01、SLA-1*0703、SLA-2*11wz01、SLA-2*1102和SLA-3*0401的CD8+分子识别的关键结合域与人HLA氨基酸序列比对,均仅在位点225、228处发生了突变(T→S、T→M),其他位点高度保守。SLA-2*11wz01和SLA-2*1102与人HLA I类基因NK细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor,KIR)结合区氨基酸同源性较高,在NKTA-1亚型结合域内仅有1个氨基酸差异,而在NKTA-2和NKTA-3亚型结合域内有2个氨基酸差异。结论从免疫细胞介导的异种排斥反应角度出发,GGTA1-/-五指山小型猪SLA I类基因氨基酸序列与人HLA高度相似,可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。 展开更多
关键词 GGTA1-/- 五指山小型猪 SLA 异种移植 免疫排斥
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表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析 被引量:2
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作者 曾国敏 +7 位作者 冯冲 石宁宁 龙川 李西睿 魏静 纪慧丽 潘登科 刘霞 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1251-1258,共8页
异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体。然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory... 异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体。然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除。本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入h CD47基因,制备表达h CD47基因的GTKO/h CD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬。首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chickenβ-actin promoter,CAG)调控的h CD47基因表达载体p CAGGS-h CD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪。利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过q RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法分析h CD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达。抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况。通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为h CD47基因阳性猪。q RT-PCR结果显示,h CD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏。Western blot及免疫组化结果进一步证实h CD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与q RT-PCR结果一致。血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好。本研究成功制备了表达h CD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了h CD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究h CD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应。 展开更多
关键词 整合素相关蛋白(CD47) 异种移植 巨噬细胞 表达特征 巴马小型猪
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