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TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白基因E0敲入山羊乳腺上皮细胞β-乳球蛋白基因座
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作者 冀艳华 徐乔璐 +3 位作者 刘军 葛恒涛 张涌 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期1206-1211,共6页
验证整合于山羊β-乳球蛋白基因座的猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因是否能够利用内源性启动子调控该基因表达,为制备转CSFV E0基因山羊做好准备。利用脂质体转染的方法将实验室已构好的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体... 验证整合于山羊β-乳球蛋白基因座的猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因是否能够利用内源性启动子调控该基因表达,为制备转CSFV E0基因山羊做好准备。利用脂质体转染的方法将实验室已构好的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和包含CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊乳腺上皮细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并对获得的克隆进行5′端和3′端鉴定,鉴定都为阳性的克隆进行激素诱导24h后,收集培养液和细胞。通过RT-PCR和Western blot技术检测证明,转基因阳性细胞能够表达并分泌出CSFV E0蛋白。本试验为以转CSFV E0基因细胞为供核体进行核移植制作转基因动物奠定了基础。 展开更多
关键词 山羊乳腺上皮细胞 TALEN基因打靶技术 CSFV E0蛋白 乳腺生物反应器
miR-424-5p通过下调BCL-2的表达抑制人肺癌A549细胞增殖
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作者 严贝芬 吴海波 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期176-183,共8页
microRNAs(miRNAs)是一类在真核生物中广泛存在的长度约为20~22个核苷酸的单链非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合发挥转录后抑制作用,参与调节细胞生长增殖、细胞代谢、细胞凋亡以及肿瘤的发生发展等过程。... microRNAs(miRNAs)是一类在真核生物中广泛存在的长度约为20~22个核苷酸的单链非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合发挥转录后抑制作用,参与调节细胞生长增殖、细胞代谢、细胞凋亡以及肿瘤的发生发展等过程。为研究microRNA-424-5p(miR-424-5p)在肺癌细胞中的作用及机理,利用lipo2000转染试剂将miR-424-5p mimics转染入人的非小细胞型肺癌细胞(NSCLC)A549中,流式细胞术检测A549细胞的周期变化及凋亡情况,发现细胞生长阻滞于G1/G0期且凋亡率显著上升。利用克隆形成实验和CCK-8法分别检测,发现miR-424-5p导致A549细胞增殖能力及活力降低。用在线数据库预测出抗凋亡基因BCL-2可能是miR-424-5p的靶基因,随后扩增BCL-2 mRNA的3'UTR,采用双荧光素酶报告实验及Western印迹检测证明BCL-2确为miR-424-5p的靶基因。构建BCL-2的真核表达载体p CMV-HA-BCL-2,与空载分别转染A549细胞后发现过表达BCL-2可抵消miR-424-5p引起的细胞周期阻滞及细胞凋亡。以上结果提示,miR-424-5p可以通过下调BCL-2的表达来抑制肺癌细胞增殖。 展开更多
关键词 microRNA-424-5p 肺癌 A549细胞 微小RNA 细胞凋亡
腺病毒介导。型口蹄疫病毒VP1基因在关中奶山羊乳腺上皮细胞中的表达 被引量:1
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作者 贺晓丽 林小湲 +4 位作者 刘军 王勃 卓伟伟 张涌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1537-1543,共7页
构建O型口蹄疫病毒抗原表位VPl的重组腺病毒栽体,并在体外和体内培养试验中检测腺病毒介导VPl的表达。利用PCR技术,从原始质粒中扩增VP1基N片段,双酶切后连接载体构建重组穿梭质粒pHBAd—MCMV-VP1-GFP,并经磷酸钙沉淀法携带骨架质... 构建O型口蹄疫病毒抗原表位VPl的重组腺病毒栽体,并在体外和体内培养试验中检测腺病毒介导VPl的表达。利用PCR技术,从原始质粒中扩增VP1基N片段,双酶切后连接载体构建重组穿梭质粒pHBAd—MCMV-VP1-GFP,并经磷酸钙沉淀法携带骨架质粒按比例转染HEK293A细胞,获得P1代腺病毒颗粒,经多轮扩增后进行浓缩纯化,获得复制缺陷型腺病毒颗粒,测定病毒滴度。进行体外感染乳腺上皮细胞,通过GFP的荧光表达量确定最佳感染复数。然后用RT—PCR和Western blotting检测感染的乳腺上皮细胞中抗原表住VP1的表达。进一步用纯化的腺病毒通过乳头滴定法感染羊乳腺组织,检测其乳汁中VP-的表达。结果显示,PCR、双酶切和基因测序等结果表明基因扩增和腺病毒载体构建正确,以其感染关中奶山羊乳腺上皮细胞和乳腺组织时,均可检测到VPl蛋白表达。结果表明,成功构建了含VP1基因的重组腺病毒载体,且能够介导VP1基因在体外和体内培养试验中有效表达,为进一步研究纯化分离的VP1蛋白的抗原性并提高抗原优化技术提供基础研究。 展开更多
关键词 VP1 腺病毒表达系统 蛋白表达 乳腺上皮细胞 奶山羊
BoLA-Ⅰ类基因在牛体细胞克隆胚早期发育中的表达 被引量:1
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作者 王勃 贺晓丽 +3 位作者 王勇胜 王雪娇 张涌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期103-108,共6页
体外培养成熟的卵母细胞,通过核移植(Nuclear transfer,NT)技术,构建体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎,以体外受精胚胎作为对照组。收集MⅡ期卵母细胞、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚... 体外培养成熟的卵母细胞,通过核移植(Nuclear transfer,NT)技术,构建体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎,以体外受精胚胎作为对照组。收集MⅡ期卵母细胞、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚,采用实时荧光定量PCR的方法检测经典BoLA-I基因和非经典BoLA-I基因在MⅡ期卵母细胞及各期胚胎中的相对表达量。结果显示,BoLA-I类基因在在牛MⅡ期卵母细胞中的相对表达量显著高于其在其他各时期胚胎的相对表达量(P<0.05);BoLA-I类基因在牛SCNT胚和IVF胚中相对表达量随胚胎发育的变化趋势类似,随着第1次及随后的卵裂,经典BoLA-I、NC1、NC2基因mRNA的表达下降到极微的水平;NC3、NC4在整个发育阶段均表达很低甚至难以检测到它们表达。结果表明,本试验通过在体外制备及培养SCNT胚胎,初步建立BoLA-I类基因在其的表达模式,为BoLA-I类基因参与母胎免疫机制的研究奠定基础,为进一步寻找评估胚胎质量的标志物提供依据。 展开更多
关键词 BoLA-I 胚胎 SCNT QRT-PCR
SAHA处理供体细胞对山羊克隆胚胎早期发育的影响 预览
5
作者 魏丽晓 刘军 +3 位作者 张一军 权富生 张涌 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第9期1-8,共8页
为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟肟酸(SAHA)对体细胞和山羊核移植胚胎早期发育的影响,采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其AcH3K9水平、细胞增殖能力、细胞周期及胚胎发育情况、... 为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟肟酸(SAHA)对体细胞和山羊核移植胚胎早期发育的影响,采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其AcH3K9水平、细胞增殖能力、细胞周期及胚胎发育情况、乙酰化水平、多能性基因的表达水平。结果显示,SAHA处理后GEFs的AcH3K9水平显著上升(P〈o.05),2.5μmol/LSAHA处理浓度即可显著提高GEFs组蛋白H3K9的乙酰化水平;浓度≤2.5μmol/L时,对细胞增殖能力无明显影响;浓度为5.0μmol/L和10.0μmol/L时,细胞活力显著下降(P〈0.05)。AcH3K9上调会引起G0/G1和S期的细胞比例下降(P〈0.05)。因此,选择经2.5μmol/LSAHA处理的供体细胞进行核移植。试验组的胚胎卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P〈0.05),其卵裂率接近于卵胞质单精子注射(ICSI)组。试验组的囊胚率乙酰化水平显著高于对照组,且低于ICSI组(P〈0.05)。与对照组相比,试验组囊胚的Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表达水平均上升(P〈0.05),且均接近于ICSI组。说明,选用2.5“mol/I。SAHA处理供体细胞可提高体细胞核移植效率和胚胎品质。 展开更多
关键词 羟肟酸 H3K9乙酰化 克隆胚胎 胎儿成纤维细胞 山羊
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牛胎儿神经干细胞的分离培养与鉴定
6
作者 殷松娜 +3 位作者 齐英培 贺晓丽 冀艳华 张涌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期1125-1129,1135共6页
分别采用机械分离法和酶消化分离法从胎龄为3个月的牛胎儿脑组织中分离培养牛神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),比较这2种方法对NSCs培养的影响。根据培养液中是否添加bFGF、EGF和FBS,选择不同的培养液培养NSCs,观察不同培养液对N... 分别采用机械分离法和酶消化分离法从胎龄为3个月的牛胎儿脑组织中分离培养牛神经干细胞(Neural stem cells,NSCs),比较这2种方法对NSCs培养的影响。根据培养液中是否添加bFGF、EGF和FBS,选择不同的培养液培养NSCs,观察不同培养液对NSCs培养的影响,进而筛选出最适培养液。对NSCs及经诱导分化成的神经细胞进行生物学特性分析,包括细胞形态学观察和细胞免疫荧光检测。结果显示:组成成分为Neurobasal Medium+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素的神经干细胞培养液能够很好地支持牛胎儿NSCs的存活和增殖;机械分离法获得的牛胎儿NSCs的神经球数量和细胞活性要比酶消化分离法效果好;NSCs特异性标志物Nestin表达呈强阳性,Sox2、Nanog、Oct4和SSEA4等干细胞表面标志表达均呈阳性;经体外诱导的NSCs可分化为星形胶质细胞(表达GFAP)和神经元(表达βⅢ-tubulin)。结果表明,可从牛胎儿脑组织中分离培养出NSCs,NSCs可长期传代培养,具有分化功能。牛NSCs为克隆牛的供体细胞和转基因牛的受体细胞提供了细胞新来源。 展开更多
关键词 神经干细胞 细胞培养 分化 鉴定
BIX-01294对山羊胎儿成纤维细胞生长状态和组蛋白H3K9二甲基化的影响 预览
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作者 张一军 刘军 +6 位作者 魏丽晓 茹坤 张曼 贺晓丽 权富生 张涌 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第10期1-7,共7页
为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294... 为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294浓度在1.0μmol/L以下不会影响细胞活力,2.0μmol/L时24h和48h处理组的细胞活力显著下降(P〈0.05),≥4.0μmol/L时所有处理组的细胞活力均极显著下降(P〈0.01)。细胞周期和凋亡检测结果显示,H3K9me2下调会引起细胞周期的停滞和正常细胞的减少,其中BIX-01294在大于2.0μmol/L时G0/G1期细胞的比例极显著升高(P〈0.01),4.0μmol/L时凋亡细胞极显著增加(P〈0.01)。处理后的细胞H3K9me2水平均极显著下降(P〈0.01),但大于1.0μmol/L的处理浓度能获得较好的下调效果。处理后细胞Oct4、Sox2和Nanog的mRNA水平均有不同程度的增加,其中Oct4和Nanog的mRNA水平增加极显著(P〈0.01)。说明:采用1.0μmol/L BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞,可以下调H3K9me2水平,增加G1/G0期细胞比例,上调细胞多能性基因表达量,而且不影响细胞活力。 展开更多
关键词 BIX-01294 山羊 胎儿成纤维细胞 H3K9二甲基化
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萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达 预览 被引量:1
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作者 茹坤 苏峰 +7 位作者 张一军 刘军 罗艳 徐乔璐 贺晓丽 林小湲 张涌 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第7期1-6,共6页
β-防御素3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因... β-防御素3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P〈0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P〈0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到萤喜作用.为耕嚎餐的术丌王里研窬辊供借签 展开更多
关键词 β-防御素-3 克隆 序列分析 差异表达
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波尔山羊供体和受体异地饲养鲜胚移植研究 预览
9
作者 权富生 赵晓娥 +3 位作者 刘军 华松 张涌 《中国草食动物科学》 CAS 2012年第S1期260-264,共5页
为了进一步扩大良种波尔山羊的推广,提高胚胎移植效率,该文就饲养在不同牧场间的供体和受体实现鲜胚移植进行了系统研究,得到了以下结果:①供体运输1 h、2~3 h、】4 h、0 h(对照)收集胚胎,分别得到可用胚胎数为15.8枚±4.3枚、13.0... 为了进一步扩大良种波尔山羊的推广,提高胚胎移植效率,该文就饲养在不同牧场间的供体和受体实现鲜胚移植进行了系统研究,得到了以下结果:①供体运输1 h、2~3 h、】4 h、0 h(对照)收集胚胎,分别得到可用胚胎数为15.8枚±4.3枚、13.0枚±5.7枚、13.8枚±6.6枚和14.2枚±6.3枚,不同运输时间回收可用胚胎数之间无显著性差异(P】0.05)。回收可用胚胎移植后,受体妊娠率分别为71.6%、67.6%、76.7%和80.7%,胚胎成羔率分别为74.1%、67.2%、69.9%和71.5%,供体不同运输时间回收胚胎移植妊娠率和胚胎成羔率无显著差异(P】0.05)。②胚胎在20℃,36.5℃和38.5℃运输2 h后移植,受体妊娠率分别为42.0%、64.5%和66.7%,胚胎成羔率分别为41.7%、63.6%和66.7%。20℃运输胚胎受体妊娠率和胚胎成羔率显著低于36.5℃和38.5℃下运输胚胎(P【0.01);胚胎在36.5℃分别运输0.5h、1h、2h后移植,受体妊娠率分别为72.5%68.7%和64.9%,胚胎成羔率分别为69.1%、67.8%和63.0%,受体妊娠率和胚胎成羔率之间无显著性差异(P】0.05)。③受体在手术前2~4h通过卡车运输到另一畜牧场,运输时间分别为0.5 h、1 h、≥2h,胚胎移植后受体妊娠率分别为61.2%、49.6%和42.0%。随着受体运输时间的延长,受体妊娠率呈下降趋势,运输时间超过2 h的妊娠率显著低于运输0.5 h的妊娠率(P【0.05)。胚胎成羔率分别为60.9%、45.6%和32.0%,随着受体运输时间的延长,胚胎成羔率显著下降(P【0.05或P【0.01)。从以上研究得出以下结论:山羊供体和受体饲养在不同饲养场,欲进行鲜胚移植,选择供体运输是最好的方法,其次为胚胎运输后移植。受体运输对胚胎移植效果(即受体妊娠率及胚胎成羔率)均有不利影响,不宜在生产中采用。 展开更多
关键词 波尔山羊 鲜胚移植 供体运输 胚胎运输 受体运输
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牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因 预览 被引量:2
10
作者 宋永利 何小宁 +6 位作者 华松 兰杰 贺小英 李吉霞 权富生 张涌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期585-592,共8页
为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿... 为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染。克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体。用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4~10代牛胎儿成纤维细胞,24h后观察荧光表达,48h后加入600μg.mL-1 G418,筛选1周,300μg.mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养。对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析。结果,转染24h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEG-FP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1 500bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体。说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性。可以作为核移植进行转基因克隆牛研究。 展开更多
关键词 供体细胞 真核表达载体 Ipr1基因 牛胎儿成纤维细胞 电穿孔 绿色荧光蛋白
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妊娠中期猪胎儿神经干细胞分离培养及分化
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作者 刘军 李艳艳 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期399-401,共3页
从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志。结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分... 从妊娠中期猪胎儿(胎龄60 d)脑组织分离培养神经干细胞并诱导其贴壁分化,采用RT-PCR技术检测干细胞及其分化细胞的表面标志。结果显示,神经干细胞中DCX、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog、Sox2和Nestin表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2)。结果表明,从妊娠中期猪胎儿脑组织可以分离神经干细胞,神经干细胞具有自我更新和分化潜能。 展开更多
关键词 神经干细胞 细胞分化 妊娠中期猪胎儿
荷斯坦牛羊水来源干细胞分离培养及其表面标志检测
12
作者 贺小英 张涌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期264-266,共3页
利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄285 d荷斯坦奶牛胎儿羊水中分离培养干细胞;采用RT-PCR技术检测干细胞表面标志或相关基因。成功分离培养出奶牛羊水来源干细胞,干细胞中CD-90、Nanog、Oct4、TERT、Sox2、Desmin和HES1表达阳性。... 利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄285 d荷斯坦奶牛胎儿羊水中分离培养干细胞;采用RT-PCR技术检测干细胞表面标志或相关基因。成功分离培养出奶牛羊水来源干细胞,干细胞中CD-90、Nanog、Oct4、TERT、Sox2、Desmin和HES1表达阳性。从奶牛胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,为进行转基因研究提供靶细胞奠定了基础。 展开更多
关键词 羊水来源干细胞 细胞标记 奶牛
巨噬细胞RAW264.7的培养及电转染条件的优化 预览 被引量:8
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作者 宋永利 陆昕 +7 位作者 邱爽 祁英培 华松 兰杰 何小宁 贺小英 张涌 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第9期 21-24,共4页
为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化巨... 为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化巨噬细胞电穿孔的条件。通过控制电压(250~420 V)、脉冲时间、电击次数、温度、电击缓冲液等转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒pEGFP-C1转染于培养的RAW 264.7细胞。通过荧光显微镜分析转染效率,可见:用胰酶和细胞刮刀消化RAW264.7细胞,细胞损伤小,形态好。利用优化的电转染条件得出最佳转染条件是:电压350 V、脉冲时间30 ms、电击1次、电击缓冲液成分为cell盐和options且V(cell盐)∶V(options)=3∶1、最佳温度4℃。 展开更多
关键词 巨噬细胞 体外培养 基因转染
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牛胎儿成纤维细胞β-防御素(hBD3)基因转染及转基因克隆胚制备 预览 被引量:10
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作者 马晶晶 王勇胜 +2 位作者 何小宁 张涌 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期 707-712,共6页
用脂质体法将含有人β防御素3(hBD3)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的乳腺特异性表达载体pEBB导入牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选和PCR鉴定获得阳性细胞,将这些转hBD3基因的阳性细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞,进行PCR鉴定,获得转基因... 用脂质体法将含有人β防御素3(hBD3)和绿色荧光蛋白(EGFP)基因的乳腺特异性表达载体pEBB导入牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选和PCR鉴定获得阳性细胞,将这些转hBD3基因的阳性细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞,进行PCR鉴定,获得转基因克隆胚,再将这些转基因克隆胚移入64头受体牛子宫,现有21头转基因克隆胚胎的受体牛妊娠3个月。本研究为获得转人β防御素3(hBD3)基因牛克隆胚、制作转基因克隆牛,及预防奶牛乳房炎的发生提供了可行的技术。 展开更多
关键词 人β-防御素(hBD-3)基因 牛胎儿成纤维细胞 转基因克隆胚 胚胎移植 受体
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妊娠中期猪羊水来源干细胞EGFP基因转化及体外分化 被引量:1
15
作者 党永辉 贺小英 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期540-543,共4页
本研究旨在获得妊娠中期猪羊水来源干细胞,并通过用EGFP对干细胞进行标记,为以EGFP作为示踪标记对干细胞进行体内移植研究奠定基础。利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄60 d猪胎儿羊水中分离获得干细胞,通过脂质体介导转染将EGFP基... 本研究旨在获得妊娠中期猪羊水来源干细胞,并通过用EGFP对干细胞进行标记,为以EGFP作为示踪标记对干细胞进行体内移植研究奠定基础。利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄60 d猪胎儿羊水中分离获得干细胞,通过脂质体介导转染将EGFP基因导入干细胞,诱导转基因干细胞向肌细胞和神经细胞分化,观察其分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果成功分离培养出妊娠中期猪羊水来源干细胞,并获得转EGFP基因干细胞,干细胞在表达EGFP的同时仍具有分化潜能。干细胞中Oct4、CD-90和Sox2表达阳性;体外诱导的干细胞能分化为肌细胞(表达myf-6和myoD)、星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2)。研究表明,从妊娠中期猪胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP对羊水来源干细胞进行标记、追踪,为EGFP作为示踪标记对干细胞用于体内移植研究奠定了基础。 展开更多
关键词 羊水来源干细胞 EGFP基因 细胞分化 妊娠中期猪
波尔山羊重复超排FSH用量的调整方法与效果 预览 被引量:6
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作者 权富生 白学尧 +4 位作者 赵晓娥 王勇胜 华松 张涌 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2010年第7期 116-119,共4页
根据218只2~5岁经产波尔山羊的第1次超排反应及回收胚胎数将第2次超排母羊分为5个组(1组只有卵泡未排卵;2组母羊处理后未发情;3组黄体数≤4个;4组黄体数5~14个;5组黄体数≥15个),2次连续超排时间间隔60 d以上,采用递减法用FSH(Foll... 根据218只2~5岁经产波尔山羊的第1次超排反应及回收胚胎数将第2次超排母羊分为5个组(1组只有卵泡未排卵;2组母羊处理后未发情;3组黄体数≤4个;4组黄体数5~14个;5组黄体数≥15个),2次连续超排时间间隔60 d以上,采用递减法用FSH(Folltropin V)进行超排处理,第2次FSH给量根据第一次的超排效果进行调整。结果表明,1~5组的有效供体利用率分别为100%、75%、71.88%、93.10%和93.65%,5组有效供体比例差异不显著(P〉0.05);1~5组的总胚胎数分别为14.00±5.73、12.10±6.78、11.77±7.26、13.84±7.04、18.03±9.06枚,5组的总胚胎数极显著高于其他4组(P〈0.01);1~5组的回收可用胚胎数分别为12.81±6.04、10.33±8.12、10.08±7.14、11.34±6.58和15.37±7.64枚,5组超排后可用胚胎数显著高于2、3、4组(P〈0.05),与1组间差异不显著(P〉0.05)。根据供体首次超排效果调整波尔山羊重复超排FSH给量方案可行,首次超排无反应或超排反应差的个体,重复超排时增加FSH给量,可以使70%以上的个体成为有效供体。 展开更多
关键词 重复超排 FSH剂量调整 波尔山羊 胚胎移植
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猪乳腺干细胞的分离培养及EGFP基因转化 被引量:1
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作者 贺小英 +3 位作者 党永辉 何小宁 李艳艳 刘军 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期958-961,共4页
利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干... 利用乳腺干细胞培养技术体系,从成年猪乳腺组织中分离培养乳腺干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入乳腺干细胞,诱导转基因乳腺干细胞向乳腺上皮细胞分化,观察其分化特点。结果成功分离培养出乳腺干细胞,获得转EGFP基因乳腺干细胞,它们在表达EGFP的同时仍具有分化潜能,能分化成梭形和扁平状细胞。结果表明,从成年猪乳腺组织中分离乳腺干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因乳腺干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP基因对乳腺干细胞进行标记、追踪,为EGFP基因作为示踪标记对乳腺干细胞用于体内移植研究奠定了基础。 展开更多
关键词 乳腺干细胞 EGFP基因
猪乳腺细胞分离培养及EGFP基因转化 预览 被引量:2
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作者 贺小英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期 1823-1825,共3页
本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞。利用乳腺细胞培养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞。结果,从成年猪乳腺组织... 本研究旨在从猪乳腺组织中分离得到上皮细胞和成纤维细胞,并将EGFP基因导入这些细胞。利用乳腺细胞培养体系从成年猪乳腺组织中分离培养上皮细胞和成纤维细胞,并利用脂质体介导转染技术将EGFP基因导入这些细胞。结果,从成年猪乳腺组织中成功分离培养出上皮细胞和成纤维细胞,获得转EGFP基因上皮细胞和成纤维细胞。上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2~4枚,比较明显。成纤维细胞呈长梭形。结果表明,可以从猪乳腺组织中分离上皮细胞和成纤维细胞,EGFP可以在这些细胞中表达。 展开更多
关键词 乳腺上皮细胞 成纤维细胞 分离 EGFP基因
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转增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)猪羊水干细胞的体外分化 预览 被引量:2
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作者 贺小英 何小宁 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期 792-796,共5页
利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿羊水中分离培养羊水干(AFS)细胞;通过脂质体介导转染技术,将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点;采用RT-PCR技术检测... 利用羊水干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿羊水中分离培养羊水干(AFS)细胞;通过脂质体介导转染技术,将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)导入羊水干细胞,诱导转基因羊水干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点;采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。结果表明,成功地分离培养出羊水干细胞,获得转EGFP基因羊水干细胞,羊水干细胞在表达EGFP的同时仍具有分化潜能。羊水干细胞中Oct4(octamer transcription factor4)、CD-90和Sox2表达阳性;体外诱导的羊水干细胞可以分化为成骨细胞,表达骨连接蛋白(osteonectin)和骨钙素(osteocalcin);可以分化为肌细胞,检测到生肌决定因子6(myogenic factor 6,myf-6)和生肌决定基因(myogenic determination gene,MyoD)。从猪胎儿羊水分离羊水干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因羊水干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP对羊水干细胞进行标记、追踪。 展开更多
关键词 羊水干细胞 EGFP基因 细胞标记 细胞分化
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转EGFP基因猪胎儿神经干细胞的体外分化 预览 被引量:2
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作者 赵雪 +3 位作者 贺小英 权富生 刘军 张涌 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期3305-3313,共9页
【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪... 【目的】获得转EGFP基因神经干细胞并监测其自我更新、增殖和多向分化潜能;通过用EGFP对神经干细胞进行标记和体外追踪实验,为EGFP作为示踪标记对神经干细胞进行体内移植研究奠定基础。【方法】利用神经干细胞培养技术体系,从胎龄30d猪胎儿脑组织中分离培养神经干细胞,通过脂质体介导转染技术,将EGFP基因导入神经干细胞,诱导转基因神经干细胞贴壁分化,观察其体外增殖、分化特点。采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因。【结果】成功分离培养出神经干细胞,获得转EGFP基因神经干细胞,神经干细胞在表达EGFP的同时仍具有多向分化潜能。神经干细胞中Nestin表达强阳性,NogoA、DCX、CyclinD2、CD133、Hes1、Oct4、CD-90、Nanog和Sox2表达阳性;体外诱导的神经干细胞可以分化为星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2);能分化为脂肪细胞(表达LPL和PPARγ-D)、成骨细胞(表达Osteonectin和Osteocalcin)、肌细胞(表达myf-5、myf-6和myoD)、内皮细胞(表达CD31、CD34、CDl44和eNOS)和软骨细胞(表达COL2A1)。【结论】从猪胎儿大脑组织分离神经干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因神经干细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能,可以用脚对神经干细胞进行标记、追踪,作为示踪标记进行神经干细胞体内移植研究。 展开更多
关键词 神经干细胞 EGFP基因 细胞标记 细胞分化 猪胎儿
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