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VP3 G-H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响
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作者 冬冬 白兴文 +12 位作者 宫晓华 包慧芳 李平花 李冬 付元芳 白启峰 袁红 孙普 马雪青 曹轶梅 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1285-1294,共10页
【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP3 G-H环 定点突变体 生物学特性 内吞作用
口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定
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作者 王省 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 李冬 包慧芳 李平花 孙普 白兴文 付元芳 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期939-946,共8页
为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区... 为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单个B细胞抗体技术 单克隆工程抗体 衣壳蛋白VP2
猪C型凝集素受体8A骆驼单域抗体酵母展示文库的构建
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作者 魏国燕 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 孙普 白兴文 李冬 包慧芳 李平花 付元芳 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期177-182,共6页
为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+)... 为构建猪C型凝集素受体8A(C-type lectin domain family 8,member A,CLEC8A)的单域抗体酵母展示文库,本文首先克隆出了猪CLEC8A基因编码区序列。通过SMART软件分析,鉴定出该受体胞外区基因序列,并插入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了猪CLEC8A胞外区蛋白。表达的蛋白经201佐剂乳化后免疫双峰驼,间接ELISA监测抗体滴度,于六免后15d分离骆驼外周血淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA后经巢式PCR扩增获得骆驼WfH基因。纯化的VHH片段与线性化的pCTCON2载体混合后共转入酿酒酵母感受态细胞(EBY100),经细胞内同源重组,成功制备了针对猪CLEC8A受体的骆驼单域抗体酵母展示文库。经菌落计数及测序鉴定结果表明,文库大小约为1.6×10 7,文库重组率达90%,文库多样性丰富。流式细胞术初步鉴定酵母细胞表面成功展示出抗猪CLE8A的单域抗体,为后续文库筛选奠定基础。 展开更多
关键词 猪CLEC8A基因 骆驼单域抗体 酵母展示文库 流式细胞术
针对境外口蹄疫疫情的疫苗储备毒株的构建和生物学特性分析
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作者 寻广谨 李平花 +10 位作者 孙普 马雪青 白兴文 卢曾军 包慧芳 李冬 曹轶梅 付元芳 张婧 刘在新 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期988-992,共5页
针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子... 针对亚洲区域内O/PanasiaⅡ和A/Iran05口蹄疫流行毒给我国养殖业造成的严重威胁,以O/HN/93和A/GDMM/2013感染性克隆为骨架,替换了完整的结构蛋白编码基因P1,构建嵌合病毒作为疫苗储备毒株。分别用间接免疫荧光、RT-PCR、基因测序、电子显微镜、蚀斑表型及一步生长曲线鉴定和分析重组病毒。结果显示,成功拯救到含O/PanasiaⅡ和A/Iran05型毒株P1基因的嵌合口蹄疫病毒,且嵌合基因可以随病毒在细胞上稳定传代,但P1基因的替换在一定程度上影响了两嵌合病毒在BHK21细胞上的复制能力,使得嵌合病毒在BHK21上完全CPE时间长达19 h左右。2株嵌合病毒的成功拯救可为未来我国边境地区口蹄疫的有效防控提供坚实的技术储备。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 P1基因 构建 生物学特性分析
表达FMDVB7多表位基因的重组PRRSV的拯救与复制水平的测定
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作者 白伟杰 曹轶梅 +10 位作者 包慧芳 孙普 付元芳 李平花 白兴文 李坤 马雪青 刘在新 李冬 卢曾军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期449-453,共5页
利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP... 利用北美PRRSV Fl12毒株感染性c DNA克隆,在病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建了表达EGFP的重组PRRSV(v Fl12-EGFP)。拯救病毒v Fl12-EGFP感染Marc-145细胞后,可观察到明显的细胞病变和绿色荧光,表明EGFP基因正确表达。随后,采用相同的策略构建了表达口蹄疫病毒(FMDV)B7多表位基因的重组PRRSV(v Fl12-B7),拯救病毒v Fl12-B7感染Marc-145细胞后,可观察到典型的CPE;对拯救病毒进行RT-PCR扩增和序列测定,表明多表位基因正确插入;荧光定量PCR检测,第1代和第4代拯救病毒的拷贝数分别为3.76×10^5 copies/L与1.58×10^8 copies/L,说明重组病毒具有较好的复制能力,为以PRRSV为载体表达口蹄疫多表位基因活载体疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PRRSV 感染性克隆 FMDV B细胞表位 病毒载体疫苗
表达EGFP报告基因口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建
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作者 袁红 李平花 +12 位作者 袁子文 白兴文 孙普 马雪青 李坤 寻广谨 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 付元芳 张婧 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1746-1752,共7页
【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制... 【目的】构建含有EGFP报告基因的口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子系统。【方法】利用融合PCR方法,将EGFP报告基因替换O型FMDV全长c DNA克隆中的前导蛋白Lb和结构蛋白P1基因,构建含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDV-EGFP。复制子质粒连续转化、测序检验复制子载体的稳定性。Not I线性化的复制子FMDV-EGFP用脂质体介导法转染表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞后,不同时间段观察EGFP荧光表达情况。转染的细胞用流式、间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测该复制子载体的自主复制能力和口蹄疫病毒蛋白的表达情况。【结果】复制子质粒的连续转化及测序表明报告基因可以稳定存在。FMDV-EGFP复制子转染BSR/T7细胞3 h后在荧光显微镜下能够看到绿色荧光,EGFP荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续6 d以上。转染24 h后的细胞流式分析显示转染的细胞中有6.0%发出荧光,说明构建的复制子载体能够有效表达EGFP蛋白。另外,间接免疫荧光、RT-PCR和Western blot方法也检测到该复制子RNA在BSR/T7细胞中能够进行自主复制,并且能够表达病毒的非结构蛋白。【结论】含有EGFP报告基因的FMDV亚基因组复制子的成功构建为进一步研究病毒复制、翻译机制及筛选抗病毒药物等奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 EGFP 口蹄疫病毒 复制子
O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定 预览 被引量:2
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作者 袁红 李平花 +11 位作者 马雪青 方先珍 白兴文 孙普 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 李冬 付元芳 张婧 刘在新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期96-100,共5页
为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/9... 为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A91-105中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A91-105-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 型间嵌合 标记病毒
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嵌合O/GSLX/CHN/2010株S片段的基因工程口蹄疫病毒的生物学特性
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作者 姜韶东 李平花 +9 位作者 孙普 马雪青 白兴文 包慧芳 卢曾军 曹轶梅 付元芳 李冬 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期2396-2406,共11页
【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯... 【目的】研究嵌合口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV) O/GSLX/CHN/2010株s片段的基因工程病毒的生物学特性。【方法】运用反向遗传操作技术,将FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段嵌合进2株同谱系FMDV的感染性克隆骨架,拯救得到两株基因3-程嵌合病毒rGDexc、rGZexc;进而从病毒复制和病毒对乳鼠的致病力方面,对嵌合病毒、亲本基因工程病毒以及FMDVO/GSLX/CHN/2010株进行了评价。【结果】FMDVO/GsLx/cHN/2010株复制较慢,对乳鼠致病力较差。嵌合病毒和亲本基因工程病毒的复制能力、对乳鼠的致病力明显高于FMDVO/GsLX/cHN/2010株。【结论】研究表明FMDVO/GSLX/CHN/2010的s片段不能独自决定该病毒较差的复制能力和较弱的乳鼠致病力。这一发现为进一步研究O/GSLX/CHN/2010的致弱机制以及S片段对病毒生物学特性的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 感染性克隆 S片段 病毒生物学特性
口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/33-P株前导蛋白对病毒感染性的影响 被引量:1
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作者 张萌 白兴文 +7 位作者 李平花 范朋举 包慧芳 孙普 卢曾军 曹轶梅 刘在新 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期2052-2060,共9页
【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya9... 【目的】研究口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)前导蛋白对于病毒感染性的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,以O/CHN/93现用疫苗株的感染性克隆为骨架,分别构建了含口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P和O/CHN/Mya98/HN1前导蛋白的两株嵌合全长cDNA感染性克隆,采用实时荧光定量PCR检测两株不同的嵌合病毒感染猪肾原代细胞后细胞内IFNβ和OAS mRNA的转录情况。【结果】嵌合病毒rOHN1Lab增殖能力较弱,其对应诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较高,而嵌合毒rO33Lab相对于rOHN1Lab增殖能力较强,他们诱导产生的IFNβ和OAS mRNA含量较低。【结论】研究表明口蹄疫病毒中国分离株O/CHN/Mya98/33-P前导蛋白具有更强的抗IFNβmRNA转录的能力,该研究能够为进一步鉴定FMDV前导蛋白抗宿主先天性免疫的关键性位点奠定基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 嵌合病毒 前导蛋白 IFNβ 转录 影响
猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立 被引量:1
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作者 范朋举 曹轶梅 +9 位作者 卢曾军 张萌 孙普 付元芳 李平花 白兴文 包慧芳 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期902-908,共7页
利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0... 利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白主要抗原表位区 原核表达 间接ELISA 血清检测
口蹄疫病毒Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型比较分析 被引量:2
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作者 周强 包慧芳 +5 位作者 白兴文 孙普 谢宝霞 卢曾军 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期 331-338,共8页
为了明确口蹄疫病毒(FMDV)Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型差异,对采自不同宿主的4株FMDV进行了分子特征分析和蚀斑形态的比较。结果显示,来自不同宿主动物的分子特征差异主要表现为猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2... 为了明确口蹄疫病毒(FMDV)Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型差异,对采自不同宿主的4株FMDV进行了分子特征分析和蚀斑形态的比较。结果显示,来自不同宿主动物的分子特征差异主要表现为猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2与2个牛源毒株之间具有21个特异性的氨基酸置换位点,分散在ORF范围内。猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S1具有与牛源毒株大量相似的氨基酸位点,并且与2株牛源毒株一样,都显示为小斑的蚀斑显型,而猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2在蚀斑试验中显示为大小斑混合存在。结果表明,猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2的变异位点对病毒蚀斑显型的改变具有重要意义。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 Mya98谱系 不同宿主 分子特征 蚀斑显型
猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析 预览 被引量:2
12
作者 李平花 白兴文 +9 位作者 孙普 李冬 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 付元芳 谢宝霞 殷宏 刘在新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期 1562-1569,共8页
近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染... 近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16)。O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株。 展开更多
关键词 猪口蹄疫 基因工程病毒 构建 免疫原性分析
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国内现有猪口蹄疫O型灭活疫苗对2010年流行毒株的抵抗力 预览
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作者 李冬 谢宝霞 +8 位作者 孙普 白兴文 付元芳 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 李平花 刘在新 《中国动物保健》 2010年第12期 12-14,共3页
在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发... 在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3~5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2~3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。 展开更多
关键词 猪口蹄疫 O型 国内商品疫苗 流行毒株 抵抗力
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细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒 预览 被引量:3
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作者 李平花 白兴文 +8 位作者 卢曾军 孙普 郭建宏 李冬 曹伟军 刘湘涛 殷宏 刘在新 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期688-693,共6页
【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶... 【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 感染性分子克隆 病毒拯救 T7RNA聚合酶
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同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒 预览
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作者 卢曾军 曹轶梅 +5 位作者 包惠芳 刘在新 赵启祖 常惠芸 谢庆阁 《畜牧市场》 2009年第9期 14-16,共3页
通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有0型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P12A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质柱用Pinel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体... 通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有0型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P12A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质柱用Pinel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—P12×5c和pAdcmv—p12×3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经Pacl线性化后转染HEK295细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24~48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 重组腺病毒 同源重组
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口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长基因组感染性克隆的构建 被引量:3
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作者 刘光清 刘在新 +3 位作者 包慧芳 刘湘涛 谢庆阁 《科学通报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期858-862,共5页
以构建的口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA.用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应.对收获的病毒分别用RT-PCR,乳鼠毒力试验以及免... 以构建的口蹄疫病毒OH/CHA/99株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA.用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应.对收获的病毒分别用RT-PCR,乳鼠毒力试验以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒.同时用空斑实验法观察了拯救病毒及其亲本毒株的生长特性,结果表明二者在致病性上没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 全长CDNA 转录物RNA OH/CHA/99株 克隆
同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒 预览 被引量:3
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作者 卢曾军 曹轶梅 +5 位作者 包惠芳 刘在新 赵启祖 常惠芸 谢庆阁 《中国病毒学》 CSCD 2004年第2期 125-128,共4页
通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAde... 通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P1-2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12x3c和pAdcmv-p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中.重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变.取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24~48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达.取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在.本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础. 展开更多
关键词 同源重组 口蹄疫病毒 腺病毒 疫苗免疫 重组腺病毒质粒
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口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响 预览 被引量:2
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作者 郭慧琛 孙世琪 +7 位作者 云涛 张腾国 包慧芳 马军武 刘湘涛 刘在新 谢庆阁 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2004年第3期 12-17,共6页
将携带O型FMDV China 99株P1-2A、部分2B及3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDV China 99株3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠.以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖活性,以间接ELISA方法... 将携带O型FMDV China 99株P1-2A、部分2B及3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDV China 99株3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠.以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖活性,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化,并以微量中和试验检测中和抗体水平.结果表明,FMD DNA疫苗与3D蛋白共同免疫豚鼠后,抗体水平没有明显提高,攻毒后的保护率为25%. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D蛋白 DNA疫苗 免疫效果
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口蹄疫病毒非结构蛋白P3区的基因序列及分析 预览 被引量:5
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作者 刘在新 赵启祖 +6 位作者 张显升 江鹏斐 常惠芸 李冬 魏怀录 谢庆阁 《中国病毒学》 CSCD 2002年第2期 153-157,共5页
以口蹄疫Akesu/58分离株的53代牛舌皮病料为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了两个约1.5kb的DNA片段.核酸序列测得结果对接后,涵盖了全部P3区的基因序列.口蹄疫Akesu/58分离株基因组P3区的核酸序列共计2,724nt,包括一个终止密码子TAA,共编... 以口蹄疫Akesu/58分离株的53代牛舌皮病料为材料,采用RT-PCR法,扩增和克隆了两个约1.5kb的DNA片段.核酸序列测得结果对接后,涵盖了全部P3区的基因序列.口蹄疫Akesu/58分离株基因组P3区的核酸序列共计2,724nt,包括一个终止密码子TAA,共编码907个氨基酸;其中非结构蛋白3A的基因是459nt,编码153个氨基酸;3个3B(VPg)基因分别是69、72和72nt,氨基酸分别为23、24和24;3C是639nt,213个氨基酸;3D是1,413nt,471个氨基酸.各蛋白间由Glu/Gly(Ser)连接.序列比较显示:3A的C端易变,其它区的变易呈零星散在. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白P3区 基因序列
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口蹄疫病毒株China/99L区段核苷酸序列测定及比较分析 预览
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作者 张显升 赵启祖 +7 位作者 刘在新 刘相涛 常惠芸 江鹏斐 李冬 魏怀录 谢庆阁 《中国病毒学》 CSCD 2002年第2期 158-162,共5页
以口蹄疫病毒株China/99 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用电泳、PCR ampos和EcoR1酶切法鉴定.该毒株与A10、O\-1K、O1C ampos和TW45毒株的核苷酸序列差异率分别为15.27%、15... 以口蹄疫病毒株China/99 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用电泳、PCR ampos和EcoR1酶切法鉴定.该毒株与A10、O\-1K、O1C ampos和TW45毒株的核苷酸序列差异率分别为15.27%、15.56%、15.56%和15.49%;氨基酸序列差异率分别为8.29%、8.76%、9.22%和10.14%.五个毒株的L/P1连接处均为苷氨酸(Gly)/异亮氨酸(Ile).序列比较表明,T-C、A-G和A-C转换率较高,是点突变的热点核苷酸,是影响氨基酸稳定的因素之一.第43-53、95-105、108-111、146-153、161-173、183-188和182-187区域极有可能是L蛋白酶的活性中心,第48位的H、51的C、65位的E、95位的H、109位的H、138位的H、148位的H和165位的E可能是L蛋白酶的活性位点,它们在维持蛋白质的空间构像和功能方面具有重要作用. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒株 China/99L区段 核苷酸序列测定 比较分析
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