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pRP[Exp]-AATF重组质粒构建及其在系膜细胞中的表达 预览
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作者 顾欣雨 陈俊宇 +2 位作者 鱼敏逸 张爱青 甘卫华 《海南医学》 CAS 2019年第8期953-956,共4页
目的构建抗凋亡转录因子(AATF)真核表达质粒,检测其在系膜细胞中的表达,为进一步研究奠定实验基础。方法采用PCR技术,从大鼠的肾小球系膜细胞总RNA中扩增AATF基因编码序列片段,并克隆到pRP[Exp]质粒载体中,之后对重组质粒进行酶切和测序... 目的构建抗凋亡转录因子(AATF)真核表达质粒,检测其在系膜细胞中的表达,为进一步研究奠定实验基础。方法采用PCR技术,从大鼠的肾小球系膜细胞总RNA中扩增AATF基因编码序列片段,并克隆到pRP[Exp]质粒载体中,之后对重组质粒进行酶切和测序,通过脂质转染法将细胞转染到大鼠系膜细胞中,以未转染的系膜细胞为空白对照组,转染后的为实验组,Westernblot检测AATF所编码蛋白的表达水平。结果PCR扩增产物AATF片段约1600bp,与理论相符;构建所得pRP[Exp]-AATF重组质粒,经双酶切琼脂糖凝胶电泳后得到约1600bp的条带,与预期结果相符;测序结果与GenBank中的大鼠AATF基因序列比对,同源性相符。经RT-qPCR证明,以未转染的系膜细胞中AATF表达水平为标准(1.00±0.00),转染后的实验组中AATF的相对表达量达(12.03±1.87),显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建pRP[Exp]-AATF重组质粒,并能在肾小球系膜细胞中正常表达,为后续研究AATF基因的生物学功能、疾病治疗和临床应用奠定了实验基础。 展开更多
关键词 大鼠 肾小球系膜细胞 抗凋亡转录因子 死亡相关蛋白样激酶 分子克隆技术 质粒载体 重组质粒
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重组RPLP0蛋白的表达、鉴定及评价 预览
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作者 卢小岚 王强 +6 位作者 杜琴 梁骑 罗文依 王舒琪 张国元 刘剑平 王东生 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第15期1857-1861,共5页
目的:构建重组RPLP0蛋白的原核表达载体并诱导表达,对表达产物进行纯化鉴定及评价。方法:设计重组RPLP0蛋白基因,经PCR扩增获得目的基因;在其5′和3′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建pET41a-GST-RPLP0-6*His融合基因表达载体;对该质... 目的:构建重组RPLP0蛋白的原核表达载体并诱导表达,对表达产物进行纯化鉴定及评价。方法:设计重组RPLP0蛋白基因,经PCR扩增获得目的基因;在其5′和3′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建pET41a-GST-RPLP0-6*His融合基因表达载体;对该质粒载体进行酶切鉴定和测序验证,将鉴定正确的重组质粒载体转化至大肠杆菌并以IPTG诱导表达;经过尿素溶液纯化及复性以后得到复性的重组RPLP0蛋白;采用Western blot分析重组RPLP0蛋白的免疫原性;采用ELISA法对其抗体结合性、特异性进行分析。结果:酶切及测序结果显示,本实验成功克隆出重组RPLP0蛋白基因,将获得的目的基因构建至原核表达载体pET41a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示重组RPLP0蛋白为包涵体表达蛋白,分子量约为61 kD。Western blot检测显示重组RPLP0蛋白具有完全的免疫原性;ELISA检测显示重组RPLP0蛋白具有良好的抗体结合性和特异性。结论:表达、鉴定并分析了重组RPLP0蛋白,为深入研究RPLP0蛋白的功能及应用奠定基础。 展开更多
关键词 RPLP0 重组质粒 重组蛋白 蛋白表达
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结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位
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作者 赵东岳 王德民 林丹枫 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期386-394,共9页
【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和... 【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Rv3194c蛋白 线粒体 重组痘苗病毒 重组质粒
表达PCV-2 Cap和PPV-1 VP2蛋白的重组PRV的构建及鉴定
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作者 谢永兴 夏德利 +5 位作者 黄立平 危艳武 吴洪丽 朱红振 冯力 刘长明 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期16-22,175共8页
为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2opti)和含PRVgG蛋白信号肽序列的VP2opti基因分... 为了构建表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白和猪细小病毒1型(PPV-1)VP2蛋白的重组伪狂犬病病毒(PRV)及鉴定其免疫原性,试验采用经典同源重组技术构建重组病毒,利用密码子优化的VP2基因(VP2opti)和含PRVgG蛋白信号肽序列的VP2opti基因分别构建重组质粒pMD18TLR(TK)-VP2opti和PMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)。用已构建的重组病毒rPRV-TK7gE7gG73Cap+为骨架,以EGFP为标签经同源重组获得重组病毒。采用IPMA法鉴定Cap蛋白和VP2蛋白抗原在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达,采用IFA法鉴定VP2蛋白在重组病毒感染的PK-15细胞中的表达与定位。用这2株重组病毒免疫小鼠,通过检测血清中PRV、PCV-2和PPV-l抗体水平对构建的重组病毒在小鼠体内的免疫原性进行评价。结果表明:经同源重组获得重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+和rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+;在重组病毒感染的PK-15细胞中均能检测到阳性Cap蛋白和VP2蛋白抗原;重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆和细胞核,而重组病毒rPRV-TK^-/VP2^+(SP)/gE^-/gG^-/2Cap^+表达的VP2蛋白定位于细胞浆;用这2株重组病毒免疫小鼠能够检测到PRV中和抗体;用灭活的重组病毒免疫小鼠后可产生低水平的Cap和VP2抗体,而重组病毒活毒免疫的小鼠未检测到相应抗体。说明这2株重组病毒在体外能够表达Cap蛋白和VP2蛋白,PRVgG蛋白信号肽序列的加入促进了VP2蛋白从细胞核的释放。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 猪细小病毒1型 VP2蛋白 重组伪狂犬病病毒 重组质粒 免疫原性
肉制品中猪源性成分相对定量检测方法研究
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作者 李国华 高锦伟 +1 位作者 南丽娟 张建芳 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第7期2054-2058,共5页
目的建立一种肉制品中猪源性成分的相对定量检测方法。方法针对猪的ER-beta基因的mRNA序列设计了特异性引物与探针序列,并对引物和探针的特异性进行了验证。构建重组质粒,利用质粒拷贝数的log值和Ct值构建标准曲线。通过标准曲线计算各... 目的建立一种肉制品中猪源性成分的相对定量检测方法。方法针对猪的ER-beta基因的mRNA序列设计了特异性引物与探针序列,并对引物和探针的特异性进行了验证。构建重组质粒,利用质粒拷贝数的log值和Ct值构建标准曲线。通过标准曲线计算各个样本拷贝数,将待测样本和标准种源样本的拷贝数进行比较,确定检测样本的猪源性含量。结果实际掺加量分别为20%、40%、50%和60%的混合样品经该方法检测所得掺假量均值为猪体系24.8%、53.1%、53.1%、61%,检测结果与其实际含量基本一致。结论该方法基本能实现肉制品中猪源性成分的相对定量检测。 展开更多
关键词 肉制品 猪源性成分 重组质粒 相对定量
A型塞内卡病毒衣壳蛋白的原核表达及其五聚体的组装
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作者 莫亚霞 宋品 +5 位作者 穆素雨 董虎 曹随忠 郭慧琛 姚学萍 孙世琪 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期969-976,共8页
为实现A型塞内卡病毒(SVA)衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并组装为五聚体,本试验以带His标签和SUMO(小泛素样修饰系统)标签的pSMK及pSMA为载体,将塞内卡病毒衣壳蛋白基因VP0、VP1和VP3构建为重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMK-VP3,... 为实现A型塞内卡病毒(SVA)衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并组装为五聚体,本试验以带His标签和SUMO(小泛素样修饰系统)标签的pSMK及pSMA为载体,将塞内卡病毒衣壳蛋白基因VP0、VP1和VP3构建为重组质粒pSMA-VP0、pSMK-VP1、pSMK-VP3,在大肠杆菌原核表达系统中对其进行共表达并优化诱导表达条件,包括诱导温度、诱导剂IPTG浓度、诱导前细菌D600值以及诱导时间,纯化后获得SVA衣壳蛋白后进行免疫印迹分析,之后利用His-SUMO蛋白酶切除标签蛋白,在体外进行组装和鉴定。结果,A型塞内卡病毒衣壳蛋白VP0、VP1、VP3在20℃下、D600值为1.1、 IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导12 h后蛋白表达效果最好。经超声破碎、镍柱纯化后获得VP0、VP1、VP3蛋白,免疫印迹结果表明,目的蛋白能与SVA阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性。动态光散射和扫描电镜检测结果显示,去除His-MUMO后还原天然构象的目的蛋白可组装成五聚体。上述研究结果为制备SVA病毒样颗粒奠定了物质基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 重组质粒 原核表达 五聚体
重组人白介素35质粒的构建及鉴定 预览
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作者 顾香 陈吉泉 李兵 《中外医学研究》 2019年第17期171-173,共3页
目的:通过分子生物学技术构建重组人白介素35(IL-35)质粒,为进一步研究人IL-35的生物学功能奠定基础。方法:用KG-1细胞(人白血病细胞)扩增p35和EBI3的cDNA,将两者先后连接至pSectag2A质粒中,最后把Linker连接至pSectag2A-p35-EBI3中,构... 目的:通过分子生物学技术构建重组人白介素35(IL-35)质粒,为进一步研究人IL-35的生物学功能奠定基础。方法:用KG-1细胞(人白血病细胞)扩增p35和EBI3的cDNA,将两者先后连接至pSectag2A质粒中,最后把Linker连接至pSectag2A-p35-EBI3中,构建成pSectag2A-IL-35质粒。结果:经测序等方法鉴定重组质粒中p35和EBI3序列与Genbank中(p35NM-000882和EBI3NM-005725)公布的序列一致。结论:成功构建pSectag2A-IL-35真核表达载体。 展开更多
关键词 重组 PCR IL-35 质粒
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铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率
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作者 梁诚诚 李文桂 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第5期534-538,共5页
目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达... 目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-I并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定。重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物。结果基因拼接法获得1289 bp的OprF-I融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1λT中。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×10~3的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18%。Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白。结论成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-I融合蛋白,该蛋白具有反应原性。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 重组质粒PGEX-OprF-I 大肠埃希菌 表达效率
pLKO.1-shSIRT7重组质粒的构建及其对人肝癌PLC/PRF/5细胞系增殖的影响
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作者 施然 钱程 张献全 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期3815-3823,共9页
基于近年来研究发现sirtuin 7 (SIRT7)与肝癌密切相关,为此,本研究获取SIRT7基因敲除小鼠的肝细胞基因表达谱数据,在m RNA整体水平上分析SIRT7在肝细胞中的作用;另外,构建特异性下调人SIRT7基因的短发夹RNA (shRNA)表达质粒,并初步研究S... 基于近年来研究发现sirtuin 7 (SIRT7)与肝癌密切相关,为此,本研究获取SIRT7基因敲除小鼠的肝细胞基因表达谱数据,在m RNA整体水平上分析SIRT7在肝细胞中的作用;另外,构建特异性下调人SIRT7基因的短发夹RNA (shRNA)表达质粒,并初步研究SIRT7基因沉默对肝癌PLC/RPF/5细胞系的影响。应用DAVID、GSEA、Cytoscape等生物信息学相关工具分析基因表达谱数据。基于pLKO.1空载质粒构建p LKO.1-sh SIRT7重组质粒并通过酶切和测序鉴定。使用Lipofectamin 2000转染重组质粒进入PLC/RPF/5细胞,并通过PCR和Western blotting验证SIRT7基因的沉默效率。通过MTT实验检测细胞增殖能力的改变和流式细胞术检测细胞周期的变化,并使用PCR检测鉴定CDC4、TK1、CDC34、BCL2等基因表达水平的变化。基因表达谱分析结果显示,SIRT7基因敲除后,基因mRNA整体水平变化主要集中在与细胞周期、细胞凋亡等相关的通路中。重组质粒酶切与测序结果显示,成功构建了pLKO.1-shSIRT7重组质粒。转染后PLC/RPF/5细胞SIRT7基因的表达得到有效沉默,与对照组相比,沉默SIRT7基因的表达可导致细胞的增殖能力降低并引起G0/G1期的细胞比例增多,PCR实验显示CDC4与BCL2表达水平增高,TK1与CDC34表达水平降低。以上研究结果提示,在肝癌PLC/RPF/5细胞系中沉默SIRT7的表达可使更多的细胞阻滞在G0/G1期,从而降低其增殖能力,其机制可能与引起细胞周期相关基因的表达改变有关。 展开更多
关键词 肝癌 SIRT7 基因表达谱 重组质粒 PLC/RPF/5细胞 细胞周期
重组SSB蛋白表达、鉴定及评价 预览
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作者 杜琴 卢小岚 +7 位作者 王强 汪光蓉 罗文依 王舒琪 姚丽华 张国元 刘剑平 王东生 《重庆医学》 CAS 2019年第14期2438-2442,共5页
目的构建SSB蛋白原核表达质粒,在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化。方法以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSB-6*Hi... 目的构建SSB蛋白原核表达质粒,在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化。方法以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSB-6*His-pet41a重组表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌OverExpress C41(DE3)中,经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用C端的His标签(Histag)进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,蛋白印迹法(WB)鉴定重组蛋白的免疫原性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其免疫反应性和特异性。结果 PCR扩增获得目的基因,菌落PCR示重组表达质粒构建成功,转化感受态OverExpress C41(DE3)后经诱导有高效表达,SDS-PAGE显示GST-SSB-6*His重组蛋白为上清可溶性表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与外周血中的抗SSB抗体发生特异性反应,特异性达100%。结论成功构建了GST-SSB-6*His-PET41a重组表达质粒,经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步建立应用于国产仪器的全自动定量检测抗SSB自身抗体的磁微粒化学发光试剂,奠定了基础。 展开更多
关键词 SSB 重组质粒 蛋白表达 蛋白鉴定
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ST8Sia1基因过表达载体构建与鉴定及对人黑色素瘤细胞增殖的影响 预览
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作者 刘金宜 富炜琦 +2 位作者 杜冠华 王金华 杨淬 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期733-739,共7页
目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1 载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分... 目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1 载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分别将目的基因片段和不同载体连接,得到ST8Sia1-pEGFP-C1重组载体和重组慢病毒载体。采用PCR方法和DNA序列进行鉴定。分别用不同载体转染黑色素瘤细胞WM451,筛选建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,Real-time PCR检测稳转细胞ST8Sia1 mRNA水平;Western blot法检测稳转细胞中ST8Sia1蛋白表达水平;CCK-8法检测稳转细胞的生长增殖活性;软琼脂克隆形成实验分析稳转细胞的克隆形成能力。结果成功构建ST8Sia1-pEGFP-C1重组质粒及ST8Sia1过表达慢病毒载体。发现ST8Sia1过表达慢病毒载体转染效率较高,建立稳定过表达ST8Sia1的WM451细胞株,发现ST8Sia1过表达促进肿瘤细胞增殖和克隆形成。结论成功构建了ST8Sia1过表达载体,并发现ST8Sia1过表达能够促进黑色素瘤细胞WM451的增殖、克隆形成能力。 展开更多
关键词 ST8Sia1 黑色素瘤 重组质粒 过表达载体 稳转细胞株 细胞增殖
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HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响 预览
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作者 王敏敏 魏建宏 任来峰 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第7期683-687,共5页
目的构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)真核表达载体,并研究其对人宫颈癌HeLa细胞自噬功能的影响。方法以HCV复制子质粒pJFH1为模板,PCR法扩增HCVCore基因片段,经纯化回收后与PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建PLVX-IRES-Z... 目的构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(Core)真核表达载体,并研究其对人宫颈癌HeLa细胞自噬功能的影响。方法以HCV复制子质粒pJFH1为模板,PCR法扩增HCVCore基因片段,经纯化回收后与PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌HeLa细胞,并设PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证HCVCore蛋白在HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光(IF)和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达水平。结果获得PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCVCore重组蛋白可在HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCVCore过表达细胞LC3焦点和LC3Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞LC3Ⅱ水平(1.069±0.049)高于PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组(0.776±0.047),差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,HCVCore蛋白过表达可诱导HeLa细胞自噬。 展开更多
关键词 丙型肝炎 肝炎病毒属 病毒核心蛋白质类 自噬 重组质粒
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Functional Metagenomics to Mine Soil Microbiome for Novel Cadmium Resistance Genetic Determinants
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作者 ZHENG Xin CHEN Liang +2 位作者 CHEN Miaomiao CHEN Jinghao LI Xiaofang 《土壤圈:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第3期298-310,共13页
Metal resistance genes are valuable resources for genetic engineering of bioremediation tools. In this study, novel genetic determinants involved in cadmium(Cd) resistance were identified using a small-insert metageno... Metal resistance genes are valuable resources for genetic engineering of bioremediation tools. In this study, novel genetic determinants involved in cadmium(Cd) resistance were identified using a small-insert metagenomic DNA library constructed from an arable soil microbiome. A total of 16 recombinant plasmids harboring 49 putative open reading frames(ORFs) were found to be associated with enhanced Cd tolerance. In addition to several ORFs for ion transport/chelation and stress response, most ORFs were assumed to be associated with non-direct metal resistance mechanisms such as energy metabolism, protein/amino acid metabolism,carbohydrate/fatty acid metabolism, and signal transduction. Furthermore, 13 ORFs from five clones selected at random were cloned and subject to Cd resistance assay. Eight of these ORFs were positive for Cd resistance when expressed in Escherichia coli, among which four ORFs significantly reduced Cd accumulation and one increased Cd enrichment of the host cells. Notably, C1-ORF1, potentially encoding a histidine kinase-like adenosine triphosphatase, was the most effective Cd resistance determinant and reduced host Cd accumulation by 33.9%. These findings highlight the vast capacity of soil microbiome as a source of gene pool for bioengineering.The novel genetic determinants for Cd resistance identified in this study merit further systematic explorations into their molecular mechanisms. 展开更多
关键词 BIOREMEDIATION GENETIC engineering HISTIDINE kinase metal resistance gene open reading frame recombinant PLASMID
IQ结构域的GTP酶激活蛋白1基因短发卡RNA重组质粒的构建及表达
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作者 邓青 杨成园 +5 位作者 王安彦 牛仕诗 郝跃鹏 寇俊婷 孙雪娇 王晓霞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第8期858-861,共4页
目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mRNA序列为靶向设计合成含有... 目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mRNA序列为靶向设计合成含有shRNA序列的寡核苷酸,克隆至真核表达载体GV102中,构建重组质粒IQGAP1-shRNA,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆测序鉴定。用脂质体2000介导IQGAP1-shRNA转染KYSE150细胞作为IQGAP1-shRNA干扰组,同时设转染载体GV102为对照组,RT-PCR及Western blot法检测IQGAP1基因的干扰效果。结果经测序鉴定,重组质粒IQGAP1-shRNA构建正确。IQGAP1-shRNA干扰组及对照组转染KYSE150细胞均可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),两组转染效率分别为(76±5. 780)%和(83±3. 851)%。IQGAP1-shRNA干扰组IQGAP1 mRNA转录水平和蛋白表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(P <0. 001),表达抑制率分别为(82±2. 424)%及(77±2. 791)%。结论成功构建了IQGAP1-shRNA真核表达质粒,能特异性降低食管癌KYSE150细胞中IQGAP1基因的表达,为进一步研究IQGAP1基因在食管癌中的功能及靶向治疗作用奠定了基础。 展开更多
关键词 IQ结构域的GTP酶激活蛋白1 短发卡RNA RNA干扰 重组质粒 食管癌
整合PD-L1单链抗体的融合蛋白制备及其抗肿瘤活性的验证 预览
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作者 谈燚 秦中强 +5 位作者 周万飞 李红俊 刘明珠 许文青 李正红 李永海 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期202-206,共5页
目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(scFv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(scFv)。根据单链抗体基因序列,合成scFv抗体基因序列。选用scFv-mFc融合蛋白的方式,并采用pFuse真核表达载体来表达此scFv-... 目的:利用酵母表面递呈技术,分泌表达抗PD-L1单链抗体(scFv),纯化后得到能特异性结合PD-L1抗原的小分子抗体片段(scFv)。根据单链抗体基因序列,合成scFv抗体基因序列。选用scFv-mFc融合蛋白的方式,并采用pFuse真核表达载体来表达此scFv-mFc融合蛋白,研究其对肺腺癌细胞(A549)的亲和力和体内外抑制作用。方法:采用基因工程的方法构建重组质粒pFuse-scFv,通过真核转染至293F(人胚肾细胞),使用无血清Pro 293a-CDM培养72 h,收集培养液中分泌的融合蛋白,运用免疫组化检测scFv-mFc融合蛋白与肿瘤细胞的结合;流式细胞术分析融合蛋白和肿瘤细胞的亲和力;ADCC(抗体介导的细胞毒实验)测定融合蛋白对肿瘤细胞体外杀伤作用;利用接种肺腺癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果:通过重组质粒转染至293F细胞的方法,scFv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中;免疫组化和流式结果显示,融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞有较强的结合能力;ADCC实验结果示融合蛋白在体外对肿瘤细胞的杀伤作用;荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用,在5 mg/kg的药物剂量下,荷瘤小鼠瘤体体积平均增长率从14.90%降低至3.72%,两独立样本t检验P<0.05,差异具有统计学意义。结论:成功制备了含单链抗体的融合蛋白,其对A549细胞具有良好的结合能力,在体内外均对肿瘤细胞的增殖产生抑制作用,为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。 展开更多
关键词 重组质粒 PD-L1 单链抗体 融合蛋白 免疫抑制
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欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估 预览
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作者 贾云慧 许程志 +6 位作者 隋金钰 吴运谱 许榜丰 陈艳 杨焕良 乔传玲 陈化兰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期930-938,共9页
【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获... 【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN 展开更多
关键词 欧亚类禽型H1N1猪流感病毒 HA蛋白 重组质粒 免疫原性 DNA疫苗
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溃疡性结肠炎相关肠道菌群荧光定量PCR检测方法的建立 预览
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作者 段晓梅 李超男 +3 位作者 耿福能 刘彬 赵昱 李玥 《大理大学学报》 CAS 2019年第2期33-37,共5页
目的:为了进一步探索菌群失调对溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)的影响,建立与UC相关的肠道菌群荧光定量qRT-PCR检测方法。方法:通过筛选确定7种与UC发病及病程进展有较强相关性的肠道微生物种类,设计PCR引物,扩增出标志性片段重... 目的:为了进一步探索菌群失调对溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)的影响,建立与UC相关的肠道菌群荧光定量qRT-PCR检测方法。方法:通过筛选确定7种与UC发病及病程进展有较强相关性的肠道微生物种类,设计PCR引物,扩增出标志性片段重组到质粒中作为标准品,利用实时荧光定量PCR技术建立相关肠道菌的定量检测方法。结果:成功建立了检测双歧杆菌属等优势菌群、大肠埃希菌等条件致病菌及肠道总菌群的qRT-PCR方法,各相关菌种重组质粒建立的标准曲线相关系数≥0.998。结论:通过实验验证筛选了7种与UC相关的肠道菌群,并建立其绝对定量的qRT-PCR检定方法,具有特异性及准确度高等特点。 展开更多
关键词 荧光定量PCR 肠道菌群 溃疡性结肠炎 重组质粒
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锦鲤疱疹病毒-CJ株ORF56基因的真核表达及生物信息学分析
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作者 黄东东 王好 +5 位作者 李改娟 杜晓燕 夏克力 祖岫杰 周井祥 刘艳辉 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第5期23-25,30,176共5页
为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF56基因的结构和序列特征,试验采用锦鲤尾鳍原代细胞增殖培养KHV-CJ,提取DNA,以其为模板经PCR扩增获得ORF56基因,将该基因克隆到PVAX表达载体上,构建重组质粒PVAX-ORF56,并体外表达重组质粒,对K... 为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株(KHV-CJ) ORF56基因的结构和序列特征,试验采用锦鲤尾鳍原代细胞增殖培养KHV-CJ,提取DNA,以其为模板经PCR扩增获得ORF56基因,将该基因克隆到PVAX表达载体上,构建重组质粒PVAX-ORF56,并体外表达重组质粒,对KHV-CJ ORF56基因序列与GenBank上已知的对应基因序列进行比对,应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF56基因的结构和功能。结果表明:成功克隆出KHV-CJ ORF56基因;双酶切鉴定显示,目的基因与PVAX表达载体连接;体外表达重组质粒可见绿色荧光;与GenBank上已知序列比对显示,同源性达到99. 9%;该基因序列信号肽切割部位最可能位于第26位的组氨酸和谷氨酸之间,没有跨膜区,最大疏水指数为2. 174,最小疏水指数为-0. 334,其抗原表位主要集中在第1~27,54~143,156~223,254~295位氨基酸。说明KHV-CJ ORF56基因是较好的抗原候选基因。 展开更多
关键词 锦鲤疱疹病毒 ORF56基因 真核表达载体 重组质粒 克隆序列 基因疫苗
不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的生物信息学分析
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作者 马玉帅 张彦霞 +3 位作者 孙皖如 常月立 王文栋 张玉妥 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期275-281,共7页
目的克隆不可分型流感嗜血杆菌ATCC49247外膜蛋白P6基因,并对其编码蛋白进行分析。方法以标准菌株ATCC49247NTHI DNA为模板,PCR扩增P6目的基因,构建重组质粒pGEX-6P2/P6并测序,利用生物信息软件和GenBank数据库对编码外膜蛋白P6进行同... 目的克隆不可分型流感嗜血杆菌ATCC49247外膜蛋白P6基因,并对其编码蛋白进行分析。方法以标准菌株ATCC49247NTHI DNA为模板,PCR扩增P6目的基因,构建重组质粒pGEX-6P2/P6并测序,利用生物信息软件和GenBank数据库对编码外膜蛋白P6进行同源性分析,预测其主要理化性质、结构功能、B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。结果 ATCC49247 P6基因核苷酸序列长度为462 bp,与不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因核苷酸同源性为99.17%~100%,编码蛋白氨基酸同源性为96.18%~100%。编码蛋白含有153个氨基酸,相对分子质量为16.137 94×10~3,等电点6.09,为亲水性蛋白;该蛋白含有信号肽和3个结构域,无跨膜结构域;综合蛋白质的二级结构、亲疏水性、柔性、表面可及性和抗原指数预测该蛋白含有6个优势B细胞抗原表位,有7个CTL细胞抗原表位及16个Th细胞抗原表位。结论成功克隆外膜蛋白P6基因,生物信息学方法预测分析ATCC49247外膜蛋白P6高度保守,免疫原性强,可作为流感嗜血杆菌候选疫苗和疫苗载体。 展开更多
关键词 流感嗜血杆菌 外膜蛋白P6 重组质粒 生物信息学分析 同源性
壮药汗衣台有效成分古伦宾、非洲防己碱对HBV启动子的影响
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作者 林才志 谢海源 +6 位作者 黄振青 周艳平 甘尧 戴明明 程伟玲 王春鹏 廖丹 《中药药理与临床》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期72-77,共6页
目的:通过汗衣台抗HBV有效成分古伦宾、非洲防己碱对4种HBV启动子的影响研究,进一步探讨汗衣台抑制HBV病毒复制的可能机制。方法:采用CCK8法检测古伦宾、非洲防己碱对Hep G2细胞的增殖毒性,以确定它们的安全浓度;人工合成法、基因扩增... 目的:通过汗衣台抗HBV有效成分古伦宾、非洲防己碱对4种HBV启动子的影响研究,进一步探讨汗衣台抑制HBV病毒复制的可能机制。方法:采用CCK8法检测古伦宾、非洲防己碱对Hep G2细胞的增殖毒性,以确定它们的安全浓度;人工合成法、基因扩增法分别构建经典型和突变型的4种HBV启动子(S1p,S2p,Cp,Xp)调控的含荧光素酶报告基因的表达重组质粒(p Cp-Luc,p S1p-Luc,p S2p-Luc,p Xp-Luc),脂质体转染Hep G2细胞8h后,分别加入不同安全浓度的古伦宾、非洲防己碱进行干预处理,于24h、48h结束干预后进行双荧光素酶检测。结果:古伦宾对经典型S1p、S2p、Cp、Xp分别为中度(16.4%)、轻度(10.0%)、重度(20.2%,p=0.298)、明显抑制(8.9%,p=0.047);非洲防己碱对经典型S1p、S2p、Cp、Xp分别为中度(16.8%)、中度(17.7%)、重度(25.2%,p=0.199)、明显抑制(8.6%,p=0.05);阳性对照干扰素组对经典型S1p、S2p、Cp、Xp分别为中度(15.1%)、重度(22.3%)、重度(24.0%)和中度抑制(6.2%);拉米夫定对经典型S1p、S2p、Cp、Xp分别为重度(20.7%)、中度(13.4%)、中度(12.1%)和明显抑制(9.9%,p=0.046)。基因扩增法构建的4个HBV启动子S1p,S2p,Cp,Xp分别有1,1,4,4个突变点,突变后的启动子转录效率提高1.3倍~2.2倍(48 h组),但是,药物的抑制效率没有按相应比例提高,从这一角度来看,古伦宾、非洲防己碱、干扰素和拉米夫定对突变启动子的抑制作用除对Xp有明显提高外(2.3倍~3.5倍),对其余突变启动子均无明显变化甚至抑制作用下调(1/10~2/5)。结论:汗衣台抗HBV有效成分古伦宾、非洲防己碱对经典型和突变型的4种HBV启动子Cp,S1p,S2p,Xp均有不同程度的抑制作用,与干扰素和拉米夫定类似。四种药物对Xp尤其是突变型Xp有明显抑制作用,其中以干扰素最显著,提示汗衣台除了通过抑制启动子活性抗HBV以外,可能还通过抑制Xp启动子活性,继而下调X蛋白的表达,从而对HBV相关性肝癌的发 展开更多
关键词 汗衣台 有效成分 HBV启动子 荧光素酶报告基因 重组质粒
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