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膜蛋白KCNN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化 预览
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作者 黄秀娜 邝振展 +3 位作者 肖斌 张志英 孙朝晖 李林海 《生物技术通讯》 CAS 2019年第1期53-57,共5页
目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-I... 目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。 展开更多
关键词 小电导钙激活钾离子通道蛋白1 杆状病毒/昆虫细胞表达系统 表达 纯化
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蓝舌病I型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析 预览
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作者 陈玉梅 党伟华 +5 位作者 刘燕凯 周景明 刘红亮 郭亚楠 张改平 王爱萍 《中国动物检疫》 CAS 2019年第3期69-74,83共7页
为分析蓝舌病I型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现... 为分析蓝舌病I型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2mmol/L、温度为25℃、诱导6h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 蓝舌病1型病毒 VP5蛋白 蛋白表达 蛋白纯化 条件优化 免疫分析
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H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定 预览
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作者 余晓颖 田园 +4 位作者 张国利 吴广谋 刘雨玲 李泽鸿 岳玉环 《中国兽药杂志》 2019年第1期1-8,共8页
为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯... 为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。 展开更多
关键词 H3N2犬流感病毒 M1蛋白 原核表达 蛋白纯化
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树鼩干细胞生长因子的原核表达、纯化及免疫原性
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作者 龙琼 郝嘉茂 +8 位作者 徐盟 毕研伟 肖红剑 李智华 闫玲梅 丁晨 李育中 姚月婷 寸韡 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期20-24,28共6页
目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL2... 目的原核表达、纯化树鼩干细胞生长因子(stem cell factor,SCF),并检测其免疫原性。方法根据GenBank预测的树鼩SCF基因序列设计引物,PCR扩增SCF基因,克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a(+)-SCF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni柱纯化后,免疫家兔,Western blot和ELISA法检测其免疫原性,并检测SCF在树鼩不同组织中的分布情况。结果重组表达质粒pET-30a(+)-SCF经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为34 500,表达量约占菌体总蛋白的35.6%,以包涵体形式存在;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,可与兔抗人SCF多克隆抗体特异性结合,且免疫原性良好,抗血清效价为1∶256 000。在鼻、气管、肺、脾、肾、食管中能检测到SCF的分布。结论在大肠埃希菌中高效表达了重组SCF蛋白,纯化复性后具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 树鼩 干细胞生长因子 原核表达 纯化 免疫原性
HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化 预览
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作者 邵继平 符健(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期579-583,共5页
目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点... 目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化。利用基因工程技术构建野生型pcDNA3.1-gp41和突变型pcDNA3.1-Mgp41表达载体。取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析。结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺(Asn)的编码基因(AAU)突变为谷氨酰胺(Gln)的编码基因(GAA),成功构建了野生型和突变型gp41表达载体。琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 kD处出现目的条带,与预期一致。结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 HIV-1 病毒 包膜糖蛋白gp41 去糖基化突变体 表达和纯化
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嗜水气单胞菌气溶素的表达纯化和活性实验 预览
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作者 董靖 刘永涛 +3 位作者 胥宁 杨秋红 杨移斌 艾晓辉 《中国渔业质量与标准》 2019年第1期27-33,共7页
气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建ae... 气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建aerA-pGEX-6p-1原核表达载体,经测序验证后将其转化至BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导、亲和层析、离子交换层析纯化,然后进行溶血试验测定其生物学活性。结果表明,当表达温度为16℃,经0.2mmol/LIPTG诱导表达16h后可得到可溶性蛋白,纯化后其纯度大于95%,该蛋白对绵羊红细胞的溶血单位为54.17HU/μg。本实验通过原核表达、纯化得到的可溶性重组气溶素蛋白,具有良好的溶血活性,为进一步探究气溶素功能及其应用铺垫基础。[中国渔业质量与标准,2019,9(1):27-33]. 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 气溶素 原核表达 纯化 溶血活性 PCR扩增 分子克隆
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朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化 预览
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作者 李博 洪鹏 +2 位作者 沈宏亮 杨金 卜春亚 《北京农学院学报》 2019年第1期8-13,共6页
【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难.而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标.本研究对朱砂叶螨几丁质酶... 【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难.而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标.本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化.【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测.【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h.对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白.【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白. 展开更多
关键词 朱砂叶螨 几丁质酶 pColdⅡ 原核表达 纯化
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黄瓜Cu/Zn-SOD基因克隆及可溶性表达和纯化
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作者 陈梦瑶 冯超越 +3 位作者 南天豪 陈星辉 冯雨彤 朱振洪 《生物技术》 CAS 2019年第2期111-115,共5页
[目的]克隆黄瓜Cu/Zn-SOD基因,并利用大肠杆菌进行可溶性表达、纯化及活性测定。[方法]采用Trizol法提取黄瓜表皮的总RNA,然后设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆获得黄瓜Cu/Zn-SOD基因。该基因与p GEX2T载体相连后,转化大肠杆菌BL21(DE... [目的]克隆黄瓜Cu/Zn-SOD基因,并利用大肠杆菌进行可溶性表达、纯化及活性测定。[方法]采用Trizol法提取黄瓜表皮的总RNA,然后设计特异性引物,通过RT-PCR技术克隆获得黄瓜Cu/Zn-SOD基因。该基因与p GEX2T载体相连后,转化大肠杆菌BL21(DE3),摸索可溶性表达方法。利用GST亲和层析方法纯化目标蛋白,SOD酶活性测定采用邻苯三酚法。[结果]成功地克隆了全长为459 bp的黄瓜Cu/Zn-SOD基因,编码152个氨基酸。Protein Blast分析表明其结构域中分别包含Cu2+、Zn2+结合位点,为典型的Cu/Zn-SOD酶。目标蛋白可溶性表达条件是16℃、0. 1 mmol/L IPTG诱导20 h。SDS-PAGE分析表明GST亲和层析成功地获得重组黄瓜Cu/Zn-SOD。活性测定表明两次纯化的蛋白样品SOD酶活力分别为2 328. 9 U/m L、2 144. 7 U/m L。[结论]从黄瓜表皮中克隆获得Cu/Zn-SOD基因,该基因在大肠杆菌系统中获得可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有较高的SOD酶活力。 展开更多
关键词 铜/锌-超氧化物歧化酶 基因克隆 可溶性表达 纯化
猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析 预览
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作者 王晶晶 王婷 +5 位作者 张新笑 卞欢 耿志明 李鹏鹏 王道营 徐为民 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第8期41-47,共7页
研究脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域(12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd)的编码基因,采用大肠杆... 研究脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX)在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域(12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd)的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和SuperdexG200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2826.7U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30℃。亚油酸Km为0.40mmol/L,亚麻酸Km为0.55mmol/L,花生四烯酸Km为4.15mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数(9%)时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。 展开更多
关键词 猪肉 脂肪氧合酶 表达 纯化 酶学性质
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绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定 预览
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作者 胡业辉 李益鹏 +3 位作者 王紫英 陈勖 任真 丁澦 《复旦学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期183-190,共8页
绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原... 绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和MonoQ阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequoreavictoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和ZoanthusGFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低. 展开更多
关键词 荧光蛋白 绿色荧光蛋白结合蛋白 纳米抗体 蛋白表达 蛋白纯化 微量热泳动
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拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用 预览
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作者 樊瑛 梁爽 +2 位作者 刘思宇 郑璐 齐亚飞 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第4期129-137,共9页
【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯... 【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体)。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。 展开更多
关键词 拟南芥 PRL1蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体制备
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Cry1Ia蛋白的表达与纯化 预览
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作者 郭小琴 钱红梅 +4 位作者 郭星 高佳丽 张义茹 高建华 王兴春 《山西农业科学》 2019年第5期748-750,769共4页
苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌... 苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为便于后期评价不同的Cry1Ia蛋白,建立了Cry1Ia蛋白的表达与纯化体系。将一个cry1Ia基因的编码基因接入pET28aDel表达载体,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)star菌株。在大肠杆菌中诱导Cry1Ia蛋白的表达,并与Bt中的表达产物进行比较。最后,利用Cry1Ia蛋白C端包含的组氨酸标签,对大肠杆菌表达的Cry1Ia蛋白进行纯化。结果显示,大肠杆菌中Cry1Ia蛋白随着表达时间的延长,产物积累显著,并且其表达量高于Bt菌株,因此,其更适宜生产完整的Cry1Ia蛋白。对大肠杆菌表达的Cry1Ia进行纯化,获得了理想的结果。研究构建了Cry1Ia蛋白的大肠杆菌表达体系,并成功对其进行纯化,可为进一步研究此类蛋白的杀虫活性和机制奠定基础。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 大肠杆菌 cry1Ia 蛋白表达 蛋白纯化
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鸡HNF4α蛋白的原核表达、纯化及特异性抗体制备
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作者 王中亮 胡悦 +5 位作者 郁建锋 陈珏 马丽晨 陈迟迟 姚文 顾志良 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期927-935,共9页
肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达。为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli... 肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是核受体超家族成员之一,广泛地调控葡萄糖、胆固醇及脂肪酸代谢途径中多种基因的表达。为了获得鸡(Gallus gallus) HNF4α特异性抗体,本研究首先根据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性,优化并合成鸡HNF4α基因,构建原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α。其次,将该重组表达载体转化至E.coli BL21 (DE3)进行诱导表达,并对诱导温度和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)浓度进行优化,表达产物利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl dulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)进行鉴定。最后,将HNF4α重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备抗鸡HNF4α的特异性抗体。利用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测抗体效价,并用所得抗体进一步分析HNF4α在鸡各组织的表达情况。结果表明,经密码子优化后构建的原核重组表达载体pET-30a(+)-HNF4α可在E.coli BL21 (DE3)中高效表达,在37 ℃、0.5 mmol/L IPTG、诱导4 h的条件下,在上清液中有较多可溶性蛋白表达。利用SDS-PAGE检测发现,通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化获得了大小约为51.6 kD的融合蛋白且纯度达90%以上;ELISA检测抗体效价可达1∶512 000。利用该抗体分析鸡各组织蛋白表达谱发现,HNF4α在肝脏和肾脏中高表达,在小肠、睾丸中少量表达,而在其他组织几乎不表达。综上所述,本研究成功制备了效价高、特异性强的鸡HNF4α抗体,为进一步研究鸡HNF4α基因功能提供了基础资料。 展开更多
关键词 HNF4α 基因 原核表达 纯化 抗体制备
赤羽病病毒Gc405aa—480aa肽段的高效可溶性表达及抗原性鉴定 预览
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作者 王建华 张俊哲 +2 位作者 赵丹 王玉玲 肖妍 《中国动物检疫》 CAS 2019年第3期79-83,共5页
为表达和鉴定赤羽病病毒Gc蛋白强抗原性肽段,对Gc蛋白的1个75氨基酸肽段(405aa—480aa)编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体pET-Gc405aa—480aa,转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1mmol/LIPTG诱导重组肽段表达。将重... 为表达和鉴定赤羽病病毒Gc蛋白强抗原性肽段,对Gc蛋白的1个75氨基酸肽段(405aa—480aa)编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体pET-Gc405aa—480aa,转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1mmol/LIPTG诱导重组肽段表达。将重组rHis-Gc405aa—480aa肽段,通过Ni+-NTA树脂亲和层析方法纯化后,用Western-bloting和ELISA分析其抗原性。SDS-PAGE显示,重组rHis-Gc405aa—480aa肽段以完全可溶性形式在大肠杆菌中得到高效表达;用Ni+-NTA树脂亲和层析方法纯化,获得了较高纯度的重组rHis-Gc405aa—480aa肽段;Western-blotting显示,该重组肽段对赤羽病病毒阳性血清具有很强的反应原性。本研究表达、纯化和鉴定了具有强抗原性的重组rHis-Gc405aa—480aa肽段,为进一步开展Gc蛋白单克隆抗体制备、B细胞表位鉴定和诊断试剂研制奠定了基础。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 Gc蛋白 重组肽段 原核表达 纯化 抗原性鉴定
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肺炎克雷伯菌调控蛋白RcsAB的构建表达及活性鉴定
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作者 李璇 彭丹 +5 位作者 刘品 苏克文 何蔷 张仲双 邱景富 李迎丽 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期630-635,共6页
为了探讨转录调控子Rcs AB对靶基因的转录调控作用,构建肺炎克雷伯菌RcsA和RcsB的重组质粒,之后诱导蛋白表达,提取纯化后测定其活性。PCR得到rcsA、rcsB片段,分别将两DNA片段克隆至表达载体pMAL-C5X、pET28a,构建重组质粒。再将重组质... 为了探讨转录调控子Rcs AB对靶基因的转录调控作用,构建肺炎克雷伯菌RcsA和RcsB的重组质粒,之后诱导蛋白表达,提取纯化后测定其活性。PCR得到rcsA、rcsB片段,分别将两DNA片段克隆至表达载体pMAL-C5X、pET28a,构建重组质粒。再将重组质粒导入E. coli BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,超声破碎。破碎后的上清过柱、透析纯化,得到高纯度的蛋白,通过EMSA进行蛋白活性鉴定。RcsA,RcsB蛋白成功表达纯化,并能够与靶基因结合,初步证明蛋白具有生物学活性。成功制备有生物学活性的RcsA、RcsB蛋白,为进一步研究RcsAB蛋白复合物特异的生物学功能提供物质基础。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 RcsAB 蛋白表达 纯化
苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响
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作者 樊鑫桐 杜立新 +3 位作者 高坦坦 彭琦 张杰 宋福平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期258-268,共11页
【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方... 【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 SIGMA H 表达纯化 spo0A基因 芽胞形成
番茄果实转录因子CNR的原核表达与纯化及其抗体的制备 预览
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作者 李玲 白娟娟 +2 位作者 郭梅 王思禹 王晓玥 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期1-8,共8页
转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平... 转录因子CNR(Colourless non-ripening)在果实的发育和成熟过程中起重要作用。目前关于番茄转录因子CNR的研究主要集中在转录水平,然而蛋白水平才是CNR发挥作用的水平。通过对CNR进行原核表达和纯化,并制备CNR的多克隆抗体,在蛋白水平上确定番茄转录因子CNR的表达模式。结果表明:pET-CNR重组载体具有正确的读码框,且与已发表的番茄CNR编码序列完全一致,并且在27kD处有CNR蛋白表达,证明pET-CNR原核表达载体构建成功。诱导剂IPTG的最适宜浓度为1.0mmol/L,当用咪唑浓度为500mmol/L的洗脱缓冲液洗脱层析柱时得到单一的CNR蛋白,并以此作为抗原免疫小鼠,制得效价高且特异性好的CNR蛋白多克隆抗体。最后研究不同成熟时期番茄果实CNR蛋白的表达模式,结果发现转录因子CNR在番茄果实的破色期起重要作用。 展开更多
关键词 番茄 转录因子CNR 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体
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Biophysical characterization and ligand-binding properties of the elongation factor Tu from Mycobacterium tuberculosis
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作者 Juanjuan Yang Jing Hong +4 位作者 Ling Luo Ke Liu Chun Meng Zhi-liang Ji Donghai Lin 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第2期139-149,共11页
Mycobacterium tuberculosis(Mtb)is the key devastating bacterial pathogen responsible for tuberculosis.Increasing emergence of multi-drug-resistant,extensively drug-resistant,and rifampicin/isoniazid-resistant strains ... Mycobacterium tuberculosis(Mtb)is the key devastating bacterial pathogen responsible for tuberculosis.Increasing emergence of multi-drug-resistant,extensively drug-resistant,and rifampicin/isoniazid-resistant strains of Mtb makes the discovery of validated drug targets an urgent priority.As a vital translational component of the protein biosynthesis system,elongation factor Tu(EF-Tu)is an important molecular switch responsible for selection and binding of the cognate aminoacyl-tRNA to the acceptor site on the ribosome.In addition,EF-Tu from Mtb(MtbEF-Tu)is involved in the initial step of trans-translation which is an effective system for rescuing the stalled ribosomes from non-stop translation complexes under stress conditions.Given its crucial role in protein biosynthesis,EF-Tu is identified as an excellent molecular target for drug design.Here,we reported the recombinant expression,purification,biophysical characterization,and structural modeling of the MtbEF-Tu protein.Our results demonstrated that prokaryotic expression plasmids of pET28a-MtbEF-Tu could be expressed efficiently in Escherichia coli.We successfully purified the 6× His-tagged proteins with a yield of 16.8 mg from 1 l of Luria Bertani medium.Dynamic light scattering experiments showed that MtbEF-Tu existed in a monomeric form,and circular dichroism experiments indicated that MtbEF-Tu was well structured.Moreover,isothermal titration calorimetry experiments displayed that the purified MtbEF-Tu protein possessed intermediate binding affinities for guanosine-5′-triphosphate(GTP)and GDP.The GTP/GDP-binding sites were predicted by flexible molecular docking approach which reveals that GTP/GDP binds to MtbEF-Tu mainly through hydrogen bonds.Our work lays the essential basis for further structural and functional studies of MtbEF-Tu as well as MtbEF-Tu-related novel drug developments. 展开更多
关键词 tuberculosis MtbEF-Tu PROTEIN BIOSYNTHESIS PROTEIN expression and purification protein-guanine NUCLEOTIDE interaction
人胃蛋白酶原原核表达、纯化及性能研究
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作者 杨群芳 温远生 刘丽芬 《药物生物技术》 CAS 2019年第1期21-24,共4页
构建人胃蛋白酶原原核表达载体,建立胃蛋白酶原大肠杆菌表达条件和纯化工艺,通过测试该重组蛋白的反应性及稳定性,评价重组胃蛋白酶原在制备免疫学检测标准物质中的应用前景。采用同源重组的方法构建表达载体,在N端加入6×His和SUM... 构建人胃蛋白酶原原核表达载体,建立胃蛋白酶原大肠杆菌表达条件和纯化工艺,通过测试该重组蛋白的反应性及稳定性,评价重组胃蛋白酶原在制备免疫学检测标准物质中的应用前景。采用同源重组的方法构建表达载体,在N端加入6×His和SUMO标签帮助提高胃蛋白酶原表达量和纯化;用镍亲和柱和阴离子交换层析方法纯化蛋白,用蛋白酶切除SUMO标签后再通过镍亲和柱层析方法获得高纯度胃蛋白酶原重组蛋白;按照试剂说明书测定重组胃蛋白酶原与自产胶乳的反应性,将纯化的重组胃蛋白酶原蛋白用储存液稀释至100 mg/L后等量分装,置于4℃保存,每隔5 d取出一份,通过SDS-PAGE分析粗略判断蛋白的稳定性。结果表明人胃蛋白酶原在大肠杆菌中大部分为包涵体形式且表达量高,产物纯度可达90%以上,稳定性较好,重组抗原与自产胶乳有良好的反应性。利用SUMO标签的促表达作用,成功在大肠杆菌中表达了胃蛋白酶原重组蛋白。该方法制备的蛋白适合作为制备胃蛋白酶原免疫检测的校准品的原材料。 展开更多
关键词 胃癌早筛 胃蛋白酶原 原核表达 纯化 稳定性 反应性
人参thionins的克隆、原核表达和活性研究 预览
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作者 张鹏飞 边帅 +2 位作者 赵月 赵雨 王佳雯 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期53-57,共5页
抗菌肽在人参的生长过程中发挥了抑菌抗逆等重要作用。通过研究人参硫堇蛋白(Thionins)的抗菌活性,为未来进行大规模生产和生物农药研究奠定基础。分析人参thionins序列,构建原核表达质粒,诱导蛋白表达,对包涵体进行亲和纯化,使用纸片... 抗菌肽在人参的生长过程中发挥了抑菌抗逆等重要作用。通过研究人参硫堇蛋白(Thionins)的抗菌活性,为未来进行大规模生产和生物农药研究奠定基础。分析人参thionins序列,构建原核表达质粒,诱导蛋白表达,对包涵体进行亲和纯化,使用纸片扩散法和质膜通透性实验检测纯化蛋白的抗菌活性。人参thionins长度为228bp,编码75个氨基酸,选取其成熟肽区域(29-75aa)进行后续的表达和纯化。成功构建了原核表达质粒pGEX-4T1-thionins,在大肠杆菌BL21中获得目的蛋白的高效表达,通过包涵体纯化获得目的蛋白,并进行复性和浓缩。人参硫堇蛋白在3和9μmol/L的浓度下,对黑斑病菌丝的生长抑制率分别为36.0%和51.1%,对黑斑孢子的半数抑制浓度为0.87μmol/L。人参硫堇蛋白具有显著抑制人参黑斑病真菌的活性的作用。 展开更多
关键词 人参 硫堇 原核表达 蛋白纯化 抑真菌活性
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