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鸭坦布苏病毒全长E蛋白可溶性表达及免疫原性分析 预览
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作者 龚凤平 冯晓声 +4 位作者 王伟 罗梦萍 马海彬 王贵平 袁建丰 《动物医学进展》 北大核心 2019年第11期14-17,共4页
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种以产蛋量和采食量严重下降为主要特征的传染病。应用RT-PCR方法扩增DTMUV GDHD2014-3毒株的囊膜(E)蛋白全基因序列,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x,构建重组表... 鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)引起的一种以产蛋量和采食量严重下降为主要特征的传染病。应用RT-PCR方法扩增DTMUV GDHD2014-3毒株的囊膜(E)蛋白全基因序列,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x,构建重组表达质粒E-pMAL。将其转化E.coli BL21感受态细胞,经诱导表达条件优化,在30℃条件下IPTG诱导,可溶性表达重组的全长E蛋白(rf E),大小约110 ku。用Amylose Resin对目的蛋白进行纯化,并将纯化的rf E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆血清抗体。经Nu-PAGE以及Western blot分析,成功实现rf E蛋白可溶性表达,并能与DTMUV灭活疫苗免疫鸭血清多抗产生特异性反应。间接免疫荧光试验结果表明,rf E蛋白免疫小鼠获取的多克隆血清抗体能与DTMUV反应。实现了rf E蛋白的可溶性表达及纯化,并验证rf E蛋白具有良好的免疫原性,为DTMUV的亚单位疫苗的研制以及相关诊断试剂的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 囊膜(E)蛋白 可溶性表达 免疫原性分析
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口蹄疫病毒结构蛋白VP1与细胞间黏附分子ICAM-2重组融合蛋白的表达及免疫原性分析
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作者 芦延珍 刘新生 +5 位作者 周鹏 方玉珍 张永光 刘霞 王永录 杜晓华 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期939-944,共6页
利用PAS(PCR-based accurate synthesis)方法人工合成融合蛋白基因序列VP1-ICAM-2,通过限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ将合成的基因序列引入转移载体p Fast-Bac1,从而获得重组质粒pFastBac1-VP1-ICAM-2。然后将其转化至DH10Bac感受态细... 利用PAS(PCR-based accurate synthesis)方法人工合成融合蛋白基因序列VP1-ICAM-2,通过限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ将合成的基因序列引入转移载体p Fast-Bac1,从而获得重组质粒pFastBac1-VP1-ICAM-2。然后将其转化至DH10Bac感受态细胞后进行蓝白斑筛选,获得阳性重组杆粒rBacmidVP1-ICAM-2。将阳性重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-VP1-ICAM-2。Western-blot检测结果显示,重组蛋白约57 ku,与预期结果相符且能被FMDV A型阳性血清所识别。将亲和层析纯化的融合蛋白接种豚鼠,对其在豚鼠中的免疫原性进行分析;结果,融合蛋白VP1-ICAM-2能诱导豚鼠产生特异性抗口蹄疫病毒的体液免疫应答和细胞免疫应答。上述研究结果为研制新型口蹄疫亚单位疫苗提供了思路。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 融合蛋白 杆状病毒 表达 免疫原性分析
毒害艾美耳球虫配子体Engam59基因的克隆表达及其表达产物的免疫原性分析 被引量:1
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作者 刘丹丹 曹李琴 +2 位作者 朱玉兰 许金俊 陶建平 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第12期1510-1516,共7页
提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,应用RT-PCR扩增得到Engam59基因,对其克隆测序并进行序列分析。结果表明,Engam59基因全长为1 473 bp,为一个完整的开放阅读框,编码490个氨基酸,具有1个酪氨酸-丝氨酸富集区和1个脯氨酸-甘氨酸富集区,与... 提取毒害艾美耳球虫配子体总RNA,应用RT-PCR扩增得到Engam59基因,对其克隆测序并进行序列分析。结果表明,Engam59基因全长为1 473 bp,为一个完整的开放阅读框,编码490个氨基酸,具有1个酪氨酸-丝氨酸富集区和1个脯氨酸-甘氨酸富集区,与柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的同源性为93.4%。选择该基因编码的第211-432位氨基酸间的肽段进行截短表达,获得的重组蛋白大小在27.69 ku左右,主要以包涵体的形式存在。Western-blot分析结果显示,该重组蛋白能被小鼠抗重组蛋白多克隆抗体和毒害艾美耳球虫病鸡康复血清识别,表明该重组蛋白具有很好的免疫原性。本研究结果为进一步探析毒害艾美耳球虫配子体蛋白的功能与研制鸡球虫病基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 毒害艾美耳球虫 Engam59基因 克隆 原核表达 免疫原性分析
马链球菌马亚种IgG结合蛋白的原核表达和免疫原性 被引量:1
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作者 邵俊高 姜慧娇 +3 位作者 常建新 张宝江 李善春 苏艳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期577-583,共7页
为研究马链球菌马亚种IgG结合蛋白(EAG)免疫原性和保护力,评价其作为马链球菌疫苗抗原的价值。采用PCR法扩增马链球菌马亚种EAG基因,将测序正确的EAG扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒,对转化后的大肠杆菌进行诱... 为研究马链球菌马亚种IgG结合蛋白(EAG)免疫原性和保护力,评价其作为马链球菌疫苗抗原的价值。采用PCR法扩增马链球菌马亚种EAG基因,将测序正确的EAG扩增产物与原核表达载体pET-28a(+)连接构建重组质粒,对转化后的大肠杆菌进行诱导表达,用诱导纯化后的重组蛋白作免疫原免疫小鼠,分析重组蛋白免疫小鼠后的抗体水平及对小鼠的免疫保护力。结果表明,诱导后可得到26 kDa的EAG重组蛋白,且该蛋白可与该菌阳性血清发生特异性反应。间接ELISA检测免疫小鼠的抗体效价可达1∶8 100,重组蛋白免疫后对小鼠保护力可达90%。该结果表明,表达的EAG蛋白具有良好的抗原性,可有效提高小鼠的体液免疫水平及免疫保护力。 展开更多
关键词 马链球菌马亚种 EAG蛋白 表达 免疫原性分析
坏死梭杆菌120ku血凝素相关外膜蛋白的原核表达及免疫原性分析 预览 被引量:2
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作者 吴洪超 刘晓颖 +5 位作者 冯二凯 朱言柱 万洪理 冯卓 闫喜军 陈立志 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第11期2843-2849,共7页
为了揭示坏死梭杆菌(F.necrophorum)120ku血凝素相关外膜蛋白的免疫原性,根据F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因的抗原表位分布情况设计特异性引物,扩增出3个彼此重叠、覆盖整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3,分别构建重组... 为了揭示坏死梭杆菌(F.necrophorum)120ku血凝素相关外膜蛋白的免疫原性,根据F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白基因的抗原表位分布情况设计特异性引物,扩增出3个彼此重叠、覆盖整个开放阅读框的基因片段p1、p2、p3,分别构建重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2、pET-32a-p3,在大肠杆菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting分析重组蛋白的表达情况和反应原性;以纯化的重组蛋白为抗原免疫试验兔,分析重组蛋白的免疫原性。结果显示,重组蛋白P1、P2、P3在大肠杆菌中均得到表达,分子质量分别约为48、59、62ku,能与F.necrophorum阳性的小鼠血清反应,可以刺激试验兔产生特异性抗体,说明F.necrophorum120ku血凝素相关外膜蛋白具有良好的免疫原性,为F.necrophorum基因工程亚单位疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 坏死梭杆菌 血凝素相关外膜蛋白 原核表达 免疫原性分析
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牛流行热病毒糖蛋白基因的原核表达与抗原性鉴定 预览
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作者 李志 郑福英 +3 位作者 高闪电 王素艳 岳城 殷宏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第9期2246-2253,共8页
为探索可用来开发牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白(G)基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,... 为探索可用来开发牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus,BEFV)疫苗和诊断试剂的候选基因,本研究针对BEFV糖蛋白(G)基因设计了2对特异性引物,用PCR方法扩增基因片段,PCR产物经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后亚克隆到表达载体pET-30上,将鉴定正确的重组质粒(480-pET-30、1107-pET-30)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,培养阳性菌株D600nm值为0.6-1.0,37℃下用1.0mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,将其纯化之后进行SDS-PAGE和Western blotting免疫原性分析。同时,应用间接ELISA、动物免疫试验及交叉反应试验对目的蛋白进行分析。结果表明,首次发现的1 107bp基因片段是分段表达的,具有很好的生物活性和特异性,更适合作为开发疫苗和诊断试剂的候选基因,为今后建立BEFV的血清学诊断方法及疫苗研发提供了理论基础。 展开更多
关键词 牛流行热病毒 原核表达 免疫原性分析
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副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白的表达及其免疫原性分析 预览
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作者 张飞 都启 +3 位作者 张洋溢 文心田 黄小波 曹三杰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期621-630,共10页
运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAG... 运用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌SC-1株荚膜多糖输出蛋白(CPEP)基因,克隆至pMD-19T载体。经鉴定测序验证后,将获得的CPEP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建原核表达质粒pET-32a-CPEP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE以及Western blot分析免疫原性,纯化CPEP,并用纯化的蛋白免疫小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平及攻毒保护率。结果显示,成功构建原核表达质粒pET-32aCPEP;SDS-PAGE分析结果显示,得到约35ku的蛋白;Western blot分析显示,CPEP能与Hps SC-1阳性血清发生抗原抗体的特异性反应,证实该重组CPEP蛋白具有反应原性。以致死剂量的强毒株SC-1攻毒CPEP免疫小鼠,重组蛋白的免疫能够减缓发病,并表现出40%的保护率。重组蛋白CPEP的部分保护作用表明其可以作为免疫候选因子,为未来副猪嗜血杆菌标准化疫苗的研制奠定基础。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 荚膜多糖输出蛋白基因 克隆表达 免疫原性
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猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析 预览 被引量:2
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作者 李平花 白兴文 +9 位作者 孙普 李冬 卢曾军 包慧芳 曹轶梅 付元芳 陈应理 谢宝霞 殷宏 刘在新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期 1562-1569,共8页
近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染... 近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16)。O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株。 展开更多
关键词 猪口蹄疫 基因工程病毒 构建 免疫原性分析
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表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析 预览 被引量:21
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作者 唐丽杰 欧笛 +5 位作者 葛俊伟 徐义刚 李一经 史达 夏春丽 郁茵 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期 340-344,共5页
根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒DNZ8112进行连接,通过电击转化进入... 根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒DNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明TGEVS蛋白在乳酸乳球菌中获得表达,所表达的TGEVS蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性。间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品进行抗体检测,结果表明分泌型的重组菌DNZ8112-Sa/NZ9000免疫小鼠能够产生明显的抗TGEV sIgA抗体。 展开更多
关键词 TGEV S蛋白 乳酸乳球菌 表面表达 免疫原性分析
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表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒的构建及小鼠免疫试验 被引量:3
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作者 官婷 张守峰 +6 位作者 刘晔 孙程龙 杨洋 陈奇 钱方 刘博浩 扈荣良 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期26-31,共6页
构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭... 构建表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组复制缺陷型人5型腺病毒,评价其对小鼠免疫效果。本研究将编码PCV2Cap蛋白的ORF2克隆到腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd5CMV-Cap。将被限制性内切酶PacI线性化后的骨架质粒和重组穿梭质粒共转染HEK293AD细胞,两者在真核细胞内同源重组并包装出携带PCV2-Cap基因的复制缺陷型重组人5型腺病毒,命名为rAd5-Cap;以同样方法重组获得了不含任何靶基因的野生型重组腺病毒wt-rAd5。病毒增殖稳定后,rAd5-Cap与wt-rAd5滴度可达到108.5 TCID50/mL左右;一步增殖实验证明,相对于wt-rAd5,rAd5-Cap中Cap基因的引入几乎没有给重组腺病毒增殖造成影响。RT-PCR和间接免疫荧光实验显示,rAd5-Cap能够有效介导PCV2Cap蛋白在真核细胞HEK293AD细胞中表达。以107 TCID50的rAd5-Cap肌肉注射接种小鼠,14d后小鼠血清中产生可检测水平的针对Cap蛋白的体液免疫应答,并且至少在免疫后28d之前抗体水平持续加强。对重组腺病毒的分子生物学鉴定和在小鼠上的初步免疫试验结果表明,重组腺病毒rAd5-Cap可介导Cap蛋白在真核细胞中的表达,并且表达的靶蛋白具有较好的免疫原性,为进一步将其开发成新型PCV2疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 重组腺病毒 免疫原性分析
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