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菊花萜类物质代谢关键酶FAS基因的克隆及功能分析 认领
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作者 胡昊 杨婷 +2 位作者 高莉萍 Maarten AJongsma 王彩云 《园艺学报》 CAS 北大核心 2021年第2期313-324,共12页
以菊花模式品种(Chrysanthemum morifolium‘1581’)为材料,通过固相微萃取(SPME)结合GC-MS气相质谱联用技术分析其叶片及子房中次生代谢挥发物成分及相对含量,发现萜类代谢物在挥发物中占主要地位。基于转录组测序结果,从萜类合成酶基... 以菊花模式品种(Chrysanthemum morifolium‘1581’)为材料,通过固相微萃取(SPME)结合GC-MS气相质谱联用技术分析其叶片及子房中次生代谢挥发物成分及相对含量,发现萜类代谢物在挥发物中占主要地位。基于转录组测序结果,从萜类合成酶基因FDS基因家族中克隆得到1个菊花法尼醇合成酶(Farnesol synthase,CmFAS)基因。其ORF全长1197 bp,编码氨基酸398个,5′端具有质体定位信号肽。进化树分析表明CmFAS属于菊科植物FDS家族,与除虫菊及艾蒿中的单萜合成酶CDS亲缘关系最近。多重比对及氨基酸序列分析证实,CmFAS具备该基因家族典型的类异戊二烯代谢催化活性保守结构域。基因时空表达分析显示CmFAS在菊花幼嫩组织中表达量最高,其次是子房与成熟叶片,但均低于菊花中另外2个FDS基因。通过大肠杆菌原核表达与酶学反应证实,CmFAS可以利用类异戊二烯代谢路径上游底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)以及菊基焦磷酸(CPP)分别产生法尼醇和菊基醇,同时具备了异戊烯基转移酶以及萜类合成酶的双重活性。法尼醇合成酶CmFAS是菊花中鉴定的第1个质体定位的倍半萜合成酶。 展开更多
关键词 菊花 法尼醇合成酶 萜类化合物 基因表达 原核表达
炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析 认领
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作者 邹晖 赵亮 +3 位作者 袁婷 郭启高 吴頔 梁国鲁 《园艺学报》 CAS 北大核心 2021年第2期367-376,共10页
以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种‘Peluches’的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1。该基因全长为731 bp(GenBank登录号为MN92775),5′端... 以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种‘Peluches’的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1。该基因全长为731 bp(GenBank登录号为MN92775),5′端非编码区79 bp,3′端非编码区91 bp。其中ORF阅读框为561 bp,编码186个氨基酸,蛋白质等电点为5.63,分子量为21485.34,其预测结果的理论值与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与其他6种蔷薇科植物PR1蛋白的氨基酸序列相似性在76.41%~94.36%之间。接种炭疽菌后时序表达分析结果表明,该基因在高抗品种‘Peluches’中受病原菌诱导后明显上调表达,在接种后96 h最高,但在高感品种‘森尾早生’中无明显变化,说明EjPR1可能参与了枇杷的抗病防御过程。 展开更多
关键词 枇杷 EjPR1 基因克隆 原核表达 表达分析
当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆与表达分析 认领
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作者 张培 侯云龙 +5 位作者 苏敏 孙利 徐登封 宋涛 周璐恒 赵韶华 《中国野生植物资源》 2021年第1期20-28,共9页
目的:为了研究当归阿魏酸生物合成途径的功能基因,从当归中克隆了一条当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(AsCOMT),进行生物信息学分析、基因表达模式分析及原核表达。方法:首先依据当归COMT基因的序列(GenBank注册号KP188587),利用PCR的方法... 目的:为了研究当归阿魏酸生物合成途径的功能基因,从当归中克隆了一条当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(AsCOMT),进行生物信息学分析、基因表达模式分析及原核表达。方法:首先依据当归COMT基因的序列(GenBank注册号KP188587),利用PCR的方法克隆该基因的cDNA全长。对AsCOMT基因进行实时荧光定量PCR分析。采用无缝克隆技术构建AsCOMT基因的原核表达载体,通过热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)。进一步利用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导大肠杆菌表达重组蛋白,并筛选出最佳IPTG诱导表达条件。结果:AsCOMT基因的开放阅读框为1098 bp,编码365个氨基酸,蛋白分子量约为40.230 kDa,等电点为5.43。AsCOMT蛋白含有1个S-腺苷-L-甲硫氨酸结合位点,属于COMT蛋白家族成员。通过实时荧光定量表达分析表明,AsCOMT基因在当归的不同组织均有表达,根中表达量最高,其次是叶片,叶柄中表达量最低。原核表达载体pGEX-4T-3-AsCOMT在E.coli BL21(DE3)中大量表达当归AsCOMT蛋白,且经SDS-PAGE分析显示其相对分子质量约为40.23 kDa,其最优表达条件为25℃、1.0 mmol/L IPTG终浓度、诱导8 h,得到的当归AsCOMT蛋白主要以可溶性形式存在。结论:本研究成功克隆了AsCOMT基因,且该基因的表达具有组织特异性。构建的AsCOMT原核表达菌株在最适IPTG诱导表达条件下能大量表达当归COMT蛋白,为研究COMT基因在当归阿魏酸生物合成途径中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 当归 COMT 荧光定量PCR 原核表达 最佳表达条件
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‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b的克隆及功能分析 认领
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作者 鲁俊倩 武舒 +3 位作者 钟姗辰 张伟溪 苏晓华 张冰玉 《林业科学研究》 北大核心 2021年第1期26-34,共9页
[目的]本研究克隆了银腺杨‘84K’(Populus alba×P.glandulosa‘84K’)组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及编码区,并对其表达进行检测及功能鉴定,为深入研究PaHK3b基因在杨树生长发育的调控作用提供线索,为杨树分子育种及品种改良奠定... [目的]本研究克隆了银腺杨‘84K’(Populus alba×P.glandulosa‘84K’)组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及编码区,并对其表达进行检测及功能鉴定,为深入研究PaHK3b基因在杨树生长发育的调控作用提供线索,为杨树分子育种及品种改良奠定基础。[方法]根据毛果杨(P.trichocarpa Torr.&Gray)基因组信息,设计引物克隆‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3b启动子及CDS序列,并对其保守结构域和启动子顺式作用元件进行分析;同时,对‘84K’杨进行植物激素处理(10μmol·L^(−1)ABA、10μmol·L^(−1)6-BA、10μmol·L^(−1) IBA、10μmol·L^(−1) GA3及10μmol·L^(−1)水杨酸(SA))及非生物胁迫处理(42℃高温、0℃低温、200 mmol·L^(−1) NaCl和5%PEG6000),利用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测PaHK3b基因表达情况与表达响应差异,并采用原核表达方法初步确定PaHK3b基因的生物学功能。[结果]PaHK3b基因编码框区长度为3060 bp,编码1019个氨基酸,PaHK3b蛋白具有CHASE、HisKA和REC等典型的细胞分裂素受体结构域。PaHK3b基因启动子序列中不仅含有大量TATA框和CAAT框常见核心元件,还包含低温响应元件LTR、防御与胁迫响应元件TC-rich repeats、赤霉素响应元件GARE-motif、水杨酸响应元件TCA-element等顺式作用元件,这些元件与杨树的激素响应和逆境胁迫响应密切相关。qRT-PCR分析表明:PaHK3b基因在叶片中表达最高,根部中等,茎中最少;另外,与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG处理时,PaHK3b基因表达量与对照明显增高,分别为对照的2.67、2.61、2.28、1.87倍;用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈下调表达;在添加5%PEG6000的LB液体培养基中,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌株生长速度显著高于对照,在添加50~150 mmol·L^(−1)NaCl的LB固体培养基上,转入PaHK3b基因原核表达载体的大肠杆菌菌 展开更多
关键词 银腺杨‘84K’ 组氨酸激酶 表达模式 原核表达
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琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析 认领
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作者 李琼艳 陈安利 +4 位作者 荀利杰 刘增虎 廖鹏飞 杨伟克 董占鹏 《昆虫学报》 CAS 北大核心 2021年第1期41-50,共10页
【目的】本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物... 【目的】本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织(头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮)中的表达模式;构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达AaSGF-1,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔子,获得高效的抗体。利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕蚁蚕丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺中的表达情况。【结果】克隆了琥珀蚕AaSGF-1的cDNA序列(GenBank登录号:MK889510.1),开放阅读框(ORF)序列长1050 bp,编码349个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为38.8 kD,理论等电点(pI)为8.74。qPCR检测结果显示AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫丝腺组织尤其是后部丝腺中高量表达,而在其他组织中几乎不表达。免疫荧光结果表明AaSGF-1在蚁蚕及4龄幼虫的丝腺中表达。【结论】本研究原核表达了琥珀蚕AaSGF-1,制备了多克隆抗体,证实了AaSGF-1在琥珀蚕幼虫的丝腺中高表达,为进一步研究该基因在琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 琥珀蚕 丝腺转录因子 基因克隆 原核表达 多克隆抗体 组织表达谱
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杨树桑黄蓝光受体蛋白编码基因SvWC1的克隆及原核表达 认领
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作者 齐梦娇 杜芳 +2 位作者 胡清秀 邹亚杰 弥春霞 《食用菌学报》 北大核心 2021年第2期11-17,共7页
对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)蓝光受体蛋白编码基因SvWC 1进行克隆及原核表达,并利用定量PCR方法研究菌丝体在不同光照时间(0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、11 h)处理后,SvWC 1表达情况。结果显示:SvWC 1全长为3074 bp,... 对杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)蓝光受体蛋白编码基因SvWC 1进行克隆及原核表达,并利用定量PCR方法研究菌丝体在不同光照时间(0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、11 h)处理后,SvWC 1表达情况。结果显示:SvWC 1全长为3074 bp,含有一个2937 bp的开放阅读框(open reading frame,OFR),编码978个氨基酸;SvWC1无跨膜结构域和信号肽,主要定位于细胞核,属于亲水性蛋白,理论相对分子质量为106388,等电点为6.31;SvWC1氨基酸序列与其他真菌的相似性低,但均含有PAS(Per-Arnt-Sim)保守结构域;随着光照时间增加,SvWC 1的转录水平呈动态变化,其0.25 h表达量是对照的38倍,之后表达量开始下降,9 h上调,达到最大值,是对照的97倍;SvWC1在大肠杆菌E.coli BL21中成功表达,相对分子质量与预测的一致。 展开更多
关键词 杨树桑黄 蓝光受体蛋白 基因克隆 表达特性 原核表达
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红花1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CtDXS1的克隆及表达分析 认领
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作者 谭政委 李磊 +6 位作者 余永亮 许兰杰 杨红旗 董薇 鲁丹丹 马新明 梁慧珍 《河南农业科学》 北大核心 2021年第2期39-49,共11页
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中的第一个关键酶,在植物萜类化合物生物合成中起着重要作用。为了明确红花DX... 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中的第一个关键酶,在植物萜类化合物生物合成中起着重要作用。为了明确红花DXS基因的序列特征和表达特点,结合红花转录组数据,以豫红花1号为试验材料,首次克隆得到1个红花DXS基因的全长cDNA序列,命名为CtDXS1,并对其进行生物信息学分析和基因表达特点分析。结果表明,红花CtDXS1基因的开放阅读框(ORF)长2136 bp,编码711个氨基酸,其蛋白质分子质量是76503.10 u,蛋白质保守区预测表明,CtDXS1具有典型的转酮醇酶家族功能结构域。系统进化分析显示,CtDXS1与来自黄花蒿的DXS亲缘关系最近,属于DXS基因家族的Ⅰ类基因。组织特异性表达分析表明,CtDXS1基因在苞片中表达量最高,其次是叶和茎,在其他组织部位中表达量较低;不同花色红花基因表达定量分析表明,CtDXS1基因在黄色红花中表达量较高;干旱、低温胁迫能够诱导CtDXS1基因表达上调;茉莉酸甲酯(MeJA)能诱导CtDXS1基因的表达,而赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)对CtDXS1基因表达有一定的抑制作用。构建原核表达载体pET28-CtDXS1并转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行原核表达,成功表达了CtDXS1重组蛋白。 展开更多
关键词 红花 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 基因表达 原核表达
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文章速递双委夜蛾气味结合蛋白AdisOBP6的原核表达、抗体制备及表达谱分析 认领
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作者 宋月芹 宋智煜 +2 位作者 董钧锋 陈庆霄 孙会忠 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期149-157,共9页
【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次... 【目的】本研究旨在对双委夜蛾Athetis dissimilis气味结合蛋白OBP6进行原核表达、抗体制备以及表达谱分析,便于今后对AdisOBP6功能展开研究。【方法】利用生物信息学软件分析AdisOBP6蛋白结构特征;利用通过原核表达获得的重组蛋白4次免疫新西兰大白兔,制备AdisOBP6抗体;采用荧光定量PCR和Western blot技术检测AdisOBP6在双委夜蛾雌雄成虫触角、不同时期精巢以及受精卵和未受精卵中的表达情况。【结果】同源建模预测显示,AdisOBP6具有6个保守半胱氨酸残基和7个α-螺旋结构,并折叠成一个结合口袋。原核表达结果显示,在20℃下0.5 mmol/L IPTG诱导重组蛋白表达量最多、最稳定。4次免疫重复中,抗体效价分别超过1∶512000,1∶512000,1∶512000和1∶64000。Western blot检测获得的抗体与AdisOBP6蛋白能够特异性结合。荧光定量PCR结果显示,AdisOBP 6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的,在幼虫期精巢中AdisOBP 6就已经开始表达,在蛹期精巢中表达量低于在幼虫期的,成虫羽化后精巢中的表达量逐渐进入高峰,在未受精卵和受精卵中几乎不表达或表达量极低。Western blot分析发现,AdisOBP6蛋白也主要在精巢中表达,在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。【结论】本研究实现了AdisOBP6的原核表达,成功地制备了抗体;并证实AdisOBP6在双委夜蛾精巢中大量表达,成虫羽化后表达量达到高峰,推测AdisOBP6可能参与了授精过程。本研究结果为今后进一步研究AdisOBP6的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 双委夜蛾 气味结合蛋白 精巢 原核表达 抗体 表达谱
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文章速递管氏肿腿蜂毒液丝氨酸蛋白酶同源物SgSPH对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响 认领
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作者 李丽芳 吴朝妍 +2 位作者 韩开健 吴国星 朱家颖 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期170-177,共8页
【目的】本研究旨在通过克隆表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue,SPH)基因SgSPH,探索其编码的毒液蛋白对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响。【方法】利用RT-PCR技术克隆管氏肿腿蜂毒液SgSP... 【目的】本研究旨在通过克隆表达管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue,SPH)基因SgSPH,探索其编码的毒液蛋白对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响。【方法】利用RT-PCR技术克隆管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的开放阅读框(ORF),采用生物信息学软件分析其基因序列结构特征;采用qPCR技术检测该基因在不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、老熟幼虫、吐丝幼虫、黄茧蛹、黑茧蛹和羽化后1-5 d成虫)和雌成虫不同组织(头部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)中的相对表达量;利用载体pSUMO-Mut对该基因进行原核表达,用镍亲和层析柱纯化表达的重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot对获得的重组蛋白进行鉴定;用酶活性测定方法,分析SgSPH重组蛋白对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的抑制作用。【结果】克隆获得管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登录号:MT920663)的ORF,长798 bp,编码265个氨基酸,其中第1-20位氨基酸为信号肽,理论分子量为30.53 kD,等电点为9.59。多序列比对分析表明,SgSPH与其他寄生蜂毒液丝氨酸蛋白酶和SPH具有较低的氨基酸序列一致性(9%~17%),且缺乏保守的催化三联体。qPCR分析表明,SgSPH基因在管氏肿腿蜂成虫阶段和毒液器官中高表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot检测发现,成功表达SgSPH重组蛋白,并纯化得到了高纯度SgSPH重组蛋白。酶活性检测结果显示,SgSPH能抑制寄主黄粉虫蛹血淋巴的酚氧化酶活性。【结论】结果提示管氏肿腿蜂毒液SgSPH具有干扰寄主酚氧化酶级联反应的功能。 展开更多
关键词 管氏肿腿蜂 毒液 丝氨酸蛋白酶同源物 原核表达 表达特征 酚氧化酶
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抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 认领
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作者 孙佳卉 刘志艺 +3 位作者 黄聪 李传峰 刘光清 陈宗艳 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第1期58-63,共6页
自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9~19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征。建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要。... 自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9~19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征。建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要。为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因原核表达质粒pET-30a-Cap,转化BL21(DE3)后用IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot检测Cap蛋白的表达。大量表达并纯化重组蛋白后,将其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测免疫小鼠抗体效价,制备单克隆抗体,并对其进行鉴定。结果显示:获得的重组蛋白分子量约为28 kDa;通过3次亚克隆筛选最终获得5株杂交瘤细胞株1A5G10、1C11B11、5B7G8、9A12B12、9C3E11,抗体效价均可达1:51~200以上;1A5G10、5B7G8、9C3E11重链为IgG1型,1C11B11、9A12B12重链为IgG2b型,轻链均为κ型;制备的单克隆抗体均可与重组蛋白反应或GoAstV发生反应;其中5B7G8株与GoAstV发生反应,1C11B11、9A12B12株与GoAstV发生反应。本研究结果为GoAstV诊断方法的建立以及GoAstV Cap蛋白功能的进一步研究奠定了坚实基础。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 CAP蛋白 原核表达 单克隆抗体
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重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrP^Sc结合能力的鉴定 认领
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作者 朱峰 谭家亮 +3 位作者 吴江 杨茹 毕昊 夏剑波 《华中科技大学学报:医学版》 CAS 北大核心 2021年第1期38-43,共6页
目的利用基因克隆技术制备重组G5P蛋白,并鉴定其结合朊病毒(PrPSc)的能力。方法化学合成G5P全长基因核苷酸片段,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)质粒中,获得pET-28a-c(+)-G5P重组质粒。将其转化到E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,... 目的利用基因克隆技术制备重组G5P蛋白,并鉴定其结合朊病毒(PrPSc)的能力。方法化学合成G5P全长基因核苷酸片段,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)质粒中,获得pET-28a-c(+)-G5P重组质粒。将其转化到E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化重组G5P蛋白。制备重组G5P蛋白偶联磁珠,将其与含有或不含有PrP^Sc的人脑匀浆液混合,进行PrP^Sc的捕获实验。利用Western blot检测技术鉴定重组G5P蛋白与PrP^Sc结合的特异性与结合力。结果成功获得纯化的重组G5P蛋白,捕获实验显示重组G5P蛋白偶联磁珠仅从散发性克雅氏病(sCJD)患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白,而从非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后仍能检出Western blot条带,证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为PrP^Sc而非正常朊蛋白。将sCJD患者的脑匀浆液稀释10000倍后重组G5P蛋白仍可捕获到PrP^Sc。结论该研究利用基因克隆技术成功获得了纯化的重组G5P蛋白。该蛋白具有特异性结合PrP^Sc的能力,并具有较高亲和力。这为下一步研发新型朊病毒检测技术和滤除技术打下基础。 展开更多
关键词 G5P 原核表达 纯化 PrP^Sc 结合能力 鉴定
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牛Nebovirus VP1蛋白的表达及免疫原性研究 认领
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作者 王珍贤 汤承 岳华 《西南民族大学学报:自然科学版》 CAS 2021年第1期11-18,共8页
Nebovirus(NeV)是导致犊牛腹泻的重要病原,是国内的新发病毒.VP1是NeV主要结构蛋白,在病毒的感染与免疫中发挥重要作用.以国内NeV流行毒株VP1基因序列为模板,进行密码子偏好性优化、序列合成并插入到pET28a(+)的Nde I和Xho I酶切位点间... Nebovirus(NeV)是导致犊牛腹泻的重要病原,是国内的新发病毒.VP1是NeV主要结构蛋白,在病毒的感染与免疫中发挥重要作用.以国内NeV流行毒株VP1基因序列为模板,进行密码子偏好性优化、序列合成并插入到pET28a(+)的Nde I和Xho I酶切位点间,构建了表达VP1完整编码框的pET28a-VP1-BL21(DE3)表达载体.SDS-PAGE结果显示,表达的目的蛋白大小约60 kDa,与预期相符;Western-blot结果显示该重组蛋白可以特异地与NeV抗血清反应;家兔免疫试验结果显示该重组蛋白可以刺激兔体产生特异性抗体.本试验成功表达了NeV VP1重组蛋白,具有良好的免疫原性.为进一步研究NeVVP1蛋白的功能和血清学检测方法奠定了基础. 展开更多
关键词 Nebovirus VP1蛋白 原核表达 免疫原性
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牛环形泰勒虫HSP70基因的克隆表达、特性分析及互作蛋白网络构建 认领
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作者 樊新丽 宋瑞其 +5 位作者 呼尔查 李敏 翟雪洁 郝蕴伟 巴音查汗 张杨 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第1期1-11,共11页
为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分... 为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 牛环形泰勒虫 HSP70基因 原核表达 反应原性 生物信息学分析
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粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白全长和N端的原核表达与多克隆抗体制备 认领
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作者 刘金玉 黄鹰 《浙江农业学报》 北大核心 2021年第1期34-42,共9页
采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体... 采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE电泳切胶纯化法获得重组蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting检测抗体特异性。结果表明,SpTrz2是一个跨膜蛋白,含有3个跨膜结构域,具有多个B细胞抗原表位。SDS-PAGE电泳分析发现,粟酒裂殖酵母SpTrz2的全长和N-末端一半(SpTrz2和SpTrz2N)都以包涵体形式高效表达,其理论相对分子质量分别约为75.99 ku和44.77 ku。Western blotting检测显示,制备的兔抗SpTrz2和SpTrz2N多克隆抗体可以特异性识别天然的SpTrz2蛋白。本研究成功诱导表达、纯化重组蛋白SpTrz2和SpTrz2N,并制备了多克隆抗体,为SpTrz2蛋白的生物学功能相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 粟酒裂殖酵母 SpTrz2蛋白 原核表达 多克隆抗体
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牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备 认领
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作者 李明珠 曲哲会 +4 位作者 宋志峰 李臣锋 于越洋 高明春 王君伟 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第1期265-272,共8页
本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。... 本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1∶819200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。 展开更多
关键词 牛副流感病毒3型(BPIV3) HNex蛋白 原核表达 多克隆抗体
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肺炎克雷伯菌CRP蛋白表达与纯化及生物学特征分析 认领
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作者 徐丽 邱雪梅 +3 位作者 骆海龙 杨靖 李蓓 汪静杰 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第4期98-102,127,共6页
目的:原核表达获得肺炎克雷伯菌KP1_RS23625基因(crp)编码的CRP蛋白,并解析CRP蛋白具体的生物学功能。方法:首先克隆肺炎克雷伯菌crp基因,并亚克隆至pET-28a(+)质粒构建重组蛋白表达载体;然后体外原核诱导表达、纯化目的蛋白并进行SDS-P... 目的:原核表达获得肺炎克雷伯菌KP1_RS23625基因(crp)编码的CRP蛋白,并解析CRP蛋白具体的生物学功能。方法:首先克隆肺炎克雷伯菌crp基因,并亚克隆至pET-28a(+)质粒构建重组蛋白表达载体;然后体外原核诱导表达、纯化目的蛋白并进行SDS-PAGE电泳分析。进一步通过生物学信息方法分析CRP蛋白的生物学功能:利用ProtParam、Protscale、SignalP4.1 Service、TMHMM Server v.2.0、SOPMA、SWISS-MODEL软件分别分析目的蛋白理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区域、二级与三级结构等一般生物学特征;并借助CDD数据库、Net Phos 3.1 Sever在线软件预测蛋白的功能结构域、磷酸化位点等功能特征;进一步利用ATRING 11.0交互式数据库进行蛋白质交联互作分析。结果:成功构建了重组目的蛋白表达载体pET-28a-crp,并通过原核诱导表达与镍柱亲和吸附法表达、纯化获得CRP目的蛋白;蛋白电泳结果显示CRP蛋白为水溶性蛋白,包括标签蛋白(约4 kDa)的重组目的蛋白分子质量约27 kDa。对CRP蛋白的生物信息学分析结果显示:CRP蛋白大小23.65 kDa、为亲水性蛋白;无跨膜结构域、无信号肽;蛋白二级结构主要由α螺旋与不规则卷曲构成,其中α-螺旋占比40%以上,结构较松散;同时成功构建了三级结构模型;CRP蛋白结构域分析表明含有1个功能结构域,属PRK11753超级家族;修饰位点及蛋白注释分析显示目的蛋白含20个磷酸化位点,与多个蛋白具有交互作用。结论:本研究利用基因工程方法成功获得了较高纯度肺炎克雷伯菌CRP蛋白,并通过生物信息学手段解析了其生物学特征,为肺炎克雷伯菌感染的临床治疗提供理论基础。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯菌 CRP蛋白 转录因子 原核表达 生物信息学
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猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性双价纳米抗体原核表达及活性鉴定 认领
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作者 王长江 曲光刚 +4 位作者 武曰星 郭广君 韩强 赵中伟 沈志强 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期7-11,共5页
以猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VHH_(cap)基因为模板,通过PCR分别克隆下游片段VHH_(down)和带(G_(4)S)_(3)-linker接头序列的上游片段VHH_(up),通过两步酶切连接反应,将VHH_(down)片段插入到pCold-SUMO载体中构建VHH_(down)-pCold-SUMO... 以猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白VHH_(cap)基因为模板,通过PCR分别克隆下游片段VHH_(down)和带(G_(4)S)_(3)-linker接头序列的上游片段VHH_(up),通过两步酶切连接反应,将VHH_(down)片段插入到pCold-SUMO载体中构建VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒,再将VHH_(up)片段插入到构建成功的VHH_(down)-pCold-SUMO重组质粒中,构建双价单特异性纳米抗体原核重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,表达产物经Ni^(2+)亲和层析柱纯化并进行SDS-PAGE鉴定;通过间接ELISA方法测定纯化后的双价纳米抗体重组蛋白biVHH_(cap)的效价水平,并与相同浓度的单价纳米抗体蛋白VHH_(cap)的ELISA效价进行比较分析。结果表明,重组表达质粒biVHH_(cap)-pCold-SUMO构建正确,Cap蛋白双价单特异性纳米抗体重组蛋白在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为45 ku;该双价纳米抗体与其单价组分相比,ELISA抗体效价提高约20倍,Cap蛋白双价纳米抗体的制备为PCV2的抗原检测和PCV2相关疾病的防控提供了新型候选抗体工具。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 CAP蛋白 双价纳米抗体 原核表达
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基于重组致密颗粒蛋白11的弓形虫胶体金免疫层析检测方法的建立 认领
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作者 张艳玲 孟庆玲 +5 位作者 乔军 任宏琪 赵春光 宁程程 季春晖 才学鹏 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期12-16,共5页
将弓形虫致密颗粒蛋白11(GRA11)部分基因片段插入pET32a(+)载体,构建原核表达载体pET-32a(+)-GRA11,并转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot对诱导表达的重组蛋白GRA11 (rGRA11)进行反应原性鉴定。以rGR... 将弓形虫致密颗粒蛋白11(GRA11)部分基因片段插入pET32a(+)载体,构建原核表达载体pET-32a(+)-GRA11,并转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot对诱导表达的重组蛋白GRA11 (rGRA11)进行反应原性鉴定。以rGRA11为检测线,兔抗犬IgG为质控线,制备胶体金免疫层析试纸条,与商品化的弓形虫抗体检测试剂盒对119份临床血清样品进行检测对比试验。成功构建了pET-32a(+)-GRA11原核表达载体,SDS-PAGE检测到的蛋白大小约36 ku。Western blot结果表明,弓形虫rGRA11蛋白可被弓形虫阳性血清所识别,具有较强的反应原性。与商品化弓形虫抗体间接血凝试剂盒相比,建立的免疫胶体金层析法敏感性为81.25%,特异性为100%,两种方法的总符合率为97.4%,为弓形虫病临床诊断方法研究奠定基础。 展开更多
关键词 弓形虫 原核表达 胶体金免疫层析试纸条
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红笛鲷SR-BI基因的原核表达及条件优化 认领
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作者 王一帆 陈子茵 +3 位作者 贾新蕾 黄增朝 吕静 黄郁葱 《安徽农学通报》 2021年第3期1-5,48,共6页
根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BI基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化。结... 根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BI基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化。结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku。融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h。研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 红笛鲷 SR-BI基因 原核表达 条件优化
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桃小食心虫化学感受蛋白CSP16配体结合特性 认领
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《中国农业科学》 CAS 北大核心 2021年第5期945-958,共14页
【目的】桃小食心虫(Carposina sasakii)是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关... 【目的】桃小食心虫(Carposina sasakii)是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据。【方法】通过原核表达系统获得CsasCSP16蛋白,并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺(N-pheny-1-naphthylamine,1-NPN)为荧光探针,从33种寄主挥发物和2种性信息素分子中筛选出与CsasCSP16结合亲和性高的配体分子。通过对CsasCSP16进行同源建模获得其三维结构模型,以CSPMbraA6(PDB ID:1N8U)为模板成功构建CsasCSP16的三维结构模型。使用Autodock Vina软件将CsasCSP16与亲和性高的配体分子进行对接,构建蛋白-配体复合物。然后使用GROMACS(2019.3)软件对复合物进行动力学模拟,从动力学模拟的平衡状态中选取100个构象,使用g_mmpbsa软件计算CsasCSP16与气味分子的结合能,并通过能量分解的方法预测关键氨基酸残基。【结果】成功构建了CsasCSP16的克隆表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。与35种配体分子的荧光竞争结合表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯有较强的结合活性,其Ki值分别为6.59、6.25、3.50、6.73和4.47μmol·L^(-1)。分子对接的结果表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯的Vina Score值分别为-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。动力学模拟结果表明,CsasCSP16与气味分子复合物在50 ns内达到平衡状态,通过g_mmpbsa计算复合物的结合能,CsasCSP16-水杨酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的结合自由能分别为-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol^(- 展开更多
关键词 桃小食心虫 化学感受蛋白 原核表达 荧光竞争结合 分子对接 动力学模拟
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