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汉滩病毒核衣壳蛋白与宿主相互作用蛋白的分离与纯化
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作者 刘赫 叶伟 +5 位作者 张亮 程林峰 马宏炜 董阳超 雷迎峰 张芳琳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期97-102,共6页
目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV N... 目的构建带有亲和素标签的汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)表达质粒,转染HEK293T细胞并表达后,鉴定与其相互作用的宿主蛋白。方法合成亲和素标签基因(SF)与HTNV NP基因,先后克隆入哺乳动物真核表达载体pCAGGS,构建带有亲和标签SF的HTNV NP表达质粒,酶切鉴定重组质粒,获得的重组质粒命名为pCAGGS-SF-NP。将重组表达质粒瞬时转染到HEK293T细胞中, Western blot法检测重组质粒的表达;瞬时转染并收获蛋白样品,与StrepTrapTM HP琼脂珠混匀后, 4℃过夜孵育;转移到层析柱中,经缓冲液洗涤、脱硫生物素洗脱完成亲和层析,获得洗脱样本;洗脱样品进行SDS-PAGE,分离得到与NP相互作用的宿主蛋白。结果酶切鉴定结果表明成功构建pCAGGS-SF和pCAGGS-SF-NP,重组质粒成功表达串联SF与NP的融合蛋白;在亲和层析过程中,成功特异富集融合蛋白SF-NP;洗脱样品成功分离出与NP相互作用的宿主蛋白。结论构建的重组表达质粒可以在真核细胞中成功表达融合蛋白SF-NP并获得了与NP相互作用的宿主蛋白。 展开更多
关键词 汉滩病毒 核衣壳蛋白 亲和纯化
结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化
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作者 赵加玲 武舒佳 +7 位作者 王红 李芊璘 孙金帅 常蕾 戴二黑 武军驻 张瑶 徐平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1771-1786,共16页
Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的... Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂(Amyloseresin)亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 新基因 原核表达 亲和纯化
新型H7N9禽流感病毒NA蛋白胞外区片段的生物信息学分析及其多克隆抗体制备 预览
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作者 仇书兴 殷星 +5 位作者 苏淑娟 殷俊磊 张家友 刘雪贺 贾坤义 杨晓明 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期85-93,共9页
旨为以原核表达系统表达、纯化新型H7N9禽流感病毒(安徽株)NA蛋白胞外区片段并制备该蛋白的多克隆抗体。对新型H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白胞外区片段进行生物信息学分析,基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化... 旨为以原核表达系统表达、纯化新型H7N9禽流感病毒(安徽株)NA蛋白胞外区片段并制备该蛋白的多克隆抗体。对新型H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白胞外区片段进行生物信息学分析,基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化并合成该蛋白编码基因。将构建的重组质粒pET28b-tN9(Truncated N9)转化至E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta和E.coli Arctic Express(DE3),进行诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定。选取E.coli BL21(DE3)重组菌进行放大培养、IPTG诱导并对诱导产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以Western blotting和间接ELISA法检测抗体特异性及效价。成功表达并纯化目标蛋白,Western blotting显示制备的多克隆抗体能特异性识别重组蛋白和新型H7N9禽流感病毒(上海株),间接ELISA方法检测制备的多克隆抗体,效价为1∶256000。利用原核表达系统高效表达并纯化了tN9蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,旨为深入探索NA蛋白结构及功能、H7N9禽流感病毒致病机制和建立快速检测方法奠定基础。 展开更多
关键词 H7N9禽流感病毒 生物信息学 NA蛋白胞外区 亲和纯化 多抗
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E型肉毒神经毒素重组Hc-C亚单位疫苗免疫原性研究
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作者 李珍 徐青 余云舟 《军事医学》 CAS 北大核心 2019年第5期346-351,共6页
目的利用大肠杆菌高效表达并纯化E型肉毒神经毒素(BoNT/E)受体结合区Hc的亚结构域EHc C蛋白,并进行免疫原性研究。方法利用PCR技术扩增出EHc C基因,克隆于载体pTIG Trx His tag中得到重组质粒pTIG Trx EHc C,转入表达菌株BL21(DE3),经I... 目的利用大肠杆菌高效表达并纯化E型肉毒神经毒素(BoNT/E)受体结合区Hc的亚结构域EHc C蛋白,并进行免疫原性研究。方法利用PCR技术扩增出EHc C基因,克隆于载体pTIG Trx His tag中得到重组质粒pTIG Trx EHc C,转入表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,超声破碎菌体,收集上清,经镍柱亲和纯化获得重组抗原EHc C蛋白,通过SDS PAGE和Western印迹检测纯化效果,之后免疫BALB/c小鼠,评价其免疫原性。结果通过原核表达纯化获得了纯度>90%的重组抗原EHc C蛋白,该重组抗原作为亚单位疫苗免疫小鼠产生了特异性抗体反应,10μg剂量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104 LD50E型肉毒毒素攻击,血清中和抗体效价可达1.00 U/ml。结论获得的重组EHc C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻击,产生强烈保护作用,可作为亚单位候选疫苗预防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗体的功能表位。 展开更多
关键词 肉毒毒素类 免疫原性 原核表达 亲和纯化 疫苗 亚单位 重组抗原EHc C蛋白
甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性 预览
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作者 李柳 郑喆 +6 位作者 吴凤玉 郝一江 赵笑 曹永强 余志坚 陈超 杨贞耐 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第22期39-46,共8页
为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶(I3EB99)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21(DE3)表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标... 为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶(I3EB99)的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21(DE3)表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为(15870±1.17)SU/g,蛋白水解活力为(263.81±0.94)U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。 展开更多
关键词 凝乳酶I3EB99 全基因合成 原核表达 亲和纯化 结构预测
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Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域原核表达的影响 预览
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作者 吴炳男 陈丽 +2 位作者 张云龙 陈婷 陆昌瑞 《食品与药品》 CAS 2019年第2期105-110,共6页
目的研究Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域的原核表达、纯化过程的影响,并对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。方法采用分子克隆的方法构建PPR蛋白锌指结构域及其突变体的His-SUMO融合蛋白表达质粒,研究Zn^2+对其原核表达及Ni-柱亲和纯化过程的... 目的研究Zn^2+对PPR蛋白锌指结构域的原核表达、纯化过程的影响,并对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。方法采用分子克隆的方法构建PPR蛋白锌指结构域及其突变体的His-SUMO融合蛋白表达质粒,研究Zn^2+对其原核表达及Ni-柱亲和纯化过程的影响,并利用快速诱导法对Zn^2+的作用机制进行了初步探索。结果培养基中添加1mmol/LZn^2+可明显提高融合蛋白的稳定性;亲和纯化时在上清中添加10mmol/LEDTA可明显提高亲和纯化效率;Zn^2+作用机制的初探实验表明只有Zn^2+可作用于锌指结构位点,并帮助稳定锌指结构域。结论Zn^2+可作用于PPR蛋白的锌指结构位点,并使锌指结构变得稳定;在蛋白原核表达时添加一定浓度的Zn^2+可明显提高蛋白稳定性。 展开更多
关键词 ZN^2+ PPR蛋白 锌指结构域 亲和纯化
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可溶型小鼠细胞因子LIGHT/TNFSF14的原核表达、纯化及活性验证 预览
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作者 颜晓庆 刘飞 +1 位作者 刘庆亚 寇艳波 《中国医学创新》 CAS 2018年第32期27-31,共5页
目的前期研究发现小鼠细胞因子LIGHT(TNFSF14)能够抑制脂肪前体细胞分化,表达纯化LIGHT并验证其活性,将为进一步明确其调控脂肪前体细胞分化的机制提供坚实的基础.方法:以小鼠脾脏总cDNA为模板,通过PCR扩增得到LIGHT胞外段编码序列,... 目的前期研究发现小鼠细胞因子LIGHT(TNFSF14)能够抑制脂肪前体细胞分化,表达纯化LIGHT并验证其活性,将为进一步明确其调控脂肪前体细胞分化的机制提供坚实的基础.方法:以小鼠脾脏总cDNA为模板,通过PCR扩增得到LIGHT胞外段编码序列,并将其克隆至pGEX4T-1,经菌液PCR、限制性内切酶酶切及测序验证后获得重组质粒pGEX4T-1-LIGHTc.重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达后SDS-PAGE检测菌体破碎液上清中可溶型LIGHTc的存在.含有重组蛋白的上清经亲和纯化后获得GST-LIGHTc重组蛋白,重组蛋白经凝血酶消化后得到游离型LIGHTc单体,最后通过结肠癌细胞生长抑制实验验证LIGHTc单体的活性.结果:通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得了GST-LIGHTc重组蛋白,经凝血酶处理后得到有活性的游离型小鼠LIGHT蛋白.结论:通过大肠杆菌异源表达及亲和纯化获得有活性的小鼠LIGHTc重组蛋白,为进一步研究LIGHT影响脂肪前体细胞分化的分子机制奠定了重要的材料基础. 展开更多
关键词 LIGHT 肿瘤坏死因子 异源表达纯化 亲和纯化
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DLL4蛋白真核表达及多克隆抗体制备 预览
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作者 金巧 甘志凯 +1 位作者 周鹏 刘霞 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2018年第8期175-180,共6页
该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有tPA信号肽的DLL4基因,并克隆到pGZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48h后对发酵上清液进行镍柱亲和... 该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有tPA信号肽的DLL4基因,并克隆到pGZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯化。利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作仪检测DLIA的生物活性;免疫兔子制备DLL4多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。PCR扩增出1.6kb的tPA-DLL4-6His目的片段,测序结果表明,与NCBI数据库中的DLL4序列(NM_019074.3)相同。一步亲和纯化后,得到纯度为95%的DLL4蛋白,Dot blotting和Western blotting检测到发酵上清液中含有DLIA蛋白,DLL4蛋白和DLIA抗体之间的亲和力在1.848E-10,R2=0.999,ELISA法获得DDL4抗体效价为1:12800,Western blotting检测DLL4抗体具有良好的特异性。成功制备出具有免疫原性的DLL4蛋白及其多克隆抗体。 展开更多
关键词 DLL4 真核表达 亲和纯化 多克隆抗体 大分子互作仪
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重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定
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作者 邓学天 毛海洲 +3 位作者 刘丹丹 于淼 于双营 张守涛 《生物技术》 2018年第4期335-340,312共7页
[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋... [目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人肿瘤坏死因子Α 原核表达 亲和纯化
果蝇Hey蛋白的原核表达与多克隆抗体制备 预览
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作者 刘松年 荆凌华 +1 位作者 伍星 王俊红 《基础医学与临床》 CSCD 2018年第8期1151-1152,共2页
Hey基因属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bH LH)转录因子超家族,具有bH LH结构域、Orange结构域和C末端的YRPW保守四肽。哺乳动物的Hey基因通常作为Notch信号通路的靶基因,参与心血管系统形成、神经发生、骨骼和骨骼肌... Hey基因属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bH LH)转录因子超家族,具有bH LH结构域、Orange结构域和C末端的YRPW保守四肽。哺乳动物的Hey基因通常作为Notch信号通路的靶基因,参与心血管系统形成、神经发生、骨骼和骨骼肌发育等。 展开更多
关键词 融合蛋白 哺乳动物 HEY 抗体制备 亲和纯化 酶切分析 试剂盒
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亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白 预览
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作者 王静 张学梅 +3 位作者 李征 李夏雨 马健 沈守荣 《中南大学学报:医学版》 CSCD 北大核心 2017年第4期365-373,共9页
目的:利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法:构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标签的真核表达载体p3×Flag... 目的:利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法:构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果:通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,e IF5A等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生相互作用。结论:利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。 展开更多
关键词 亲和纯化 S100A8 S100A9 相互作用蛋白
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氨基端前B型钠尿肽单克隆抗体的制备及其鉴定 预览
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作者 谌海兰 陈特 毕小云 《中国老年学杂志》 CAS 北大核心 2017年第3期525-528,共4页
目的 通过经典单克隆抗体制备技术制备氨基端前B型钠尿肽(NT-pro BNP)单克隆抗体,将单克隆抗体进行特异性和亲和力鉴定,并用于免疫学检测试剂盒的开发。方法 用带His-Trx-标签蛋白的NT-pro BNP免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体。使用PEG1... 目的 通过经典单克隆抗体制备技术制备氨基端前B型钠尿肽(NT-pro BNP)单克隆抗体,将单克隆抗体进行特异性和亲和力鉴定,并用于免疫学检测试剂盒的开发。方法 用带His-Trx-标签蛋白的NT-pro BNP免疫Balb/C小鼠制备单克隆抗体。使用PEG1500化学融合法将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用不带标签的NT-pro BNP对获取的杂交瘤细胞进行反复多次克隆筛选,将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠诱导产生腹水,经蛋白G亲和纯化后获得NT-pro BNP单克隆抗体并对其进行亲和力和特异性进行鉴定。结果 成功进行细胞融合并获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体分泌亚型为Ig G1,可特异性识别NT-pro BNP。经腹腔体内诱生法和蛋白G亲和纯化,获得高质量NT-pro BNP单克隆抗体,经ELISA检测抗体效价在1∶10-5以上。结论 通过传统经典单克隆抗体制备技术成功制备NT-pro BNP单克隆抗体,为NT-pro BNP检测试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 氨基端前B型钠尿肽 单克隆抗体 亲和纯化 心力衰竭
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腺相关病毒的受体研究进展
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作者 王立振 侯莹 +3 位作者 成志云 郭思佳 许瑞安 唐明青 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期462-468,共7页
腺相关病毒的安全与长效特点,使其成为基因治疗中最有前景的病毒载体之一。虽然第一个以该病毒为载体的基因药物Glybera已在欧盟获批上市,然而如何进一步提高载体的靶向性与产品纯度仍是当务之急。腺相关病毒的受体是介导病毒与靶细胞... 腺相关病毒的安全与长效特点,使其成为基因治疗中最有前景的病毒载体之一。虽然第一个以该病毒为载体的基因药物Glybera已在欧盟获批上市,然而如何进一步提高载体的靶向性与产品纯度仍是当务之急。腺相关病毒的受体是介导病毒与靶细胞结合的分子基础,其与病毒的结合具有很强的特异性,因此相关受体的研究不仅有助于改善基因治疗的靶向性,亦能为高纯度病毒的亲和纯化带来希望。目前已有11种腺相关病毒的受体被发现,本文就其受体的发现过程、结构特点、功能应用等方面展开综述,为今后相关研究提供一些思路。 展开更多
关键词 腺相关病毒(AAV) 受体 特异性 亲和纯化 靶向治疗
奶山羊SCD的多克隆抗体制备与鉴定 被引量:1
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作者 邱思源 罗军 +2 位作者 晏原 朱江江 马功珍 《农业生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期1111-1118,共8页
硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-Co A desaturase,SCD)既是乳中调控不饱和脂肪酸合成的限速酶,同时又是反刍动物肉及乳中共轭亚油酸内源合成的关键酶。为了制备奶山羊(Capra hircus)SCD的多克隆抗体并进行初步应用。本研究通过生物... 硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-Co A desaturase,SCD)既是乳中调控不饱和脂肪酸合成的限速酶,同时又是反刍动物肉及乳中共轭亚油酸内源合成的关键酶。为了制备奶山羊(Capra hircus)SCD的多克隆抗体并进行初步应用。本研究通过生物信息学分析选取SCD基因片段,采用PCR方法扩增SCD基因,连接至p ET32a(+)载体上,原核表达载体p ET32a(+)-SCD转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中诱导表达。使用组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠纯化融合蛋白,纯化的SCD蛋白皮下免疫兔子(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)和Western blot检测血清效价和特异性。PCR扩增获得SCD基因N端210 bp的序列,成功诱导原核表达载体p ET32a(+)-SCD在25℃、1 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)、12 h条件下表达,在Rosetta(DE3)上清中获得了可溶的SCD重组蛋白。ELISA检测结果表明,制备的SCD多抗效价达1∶64 000,能特异性检测原核和真核细胞中表达的SCD蛋白。本研究成功表达并纯化了SCD融合蛋白,同时获得了高效价及高特异性的山羊SCD多抗,为进一步研究SCD在羊奶短中链脂肪酸代谢中的调控功能提供了重要的实验工具。 展开更多
关键词 奶山羊 硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因 原核表达 亲和纯化 多克隆抗体
烟草CSN4基因的原核表达及纯化 预览
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作者 龚露 钟杰 +2 位作者 高洁 佟硕秋 吴拥军 《山地农业生物学报》 2017年第2期19-24,共6页
以野生型烟草(Nicotiana tabacum)为试验材料,采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4c DNA序列,基因登录号为KC866360。序列分析表明,CSN4基因ORF长为1194 bp,编码398个氨基酸,蛋白分子质量为43.78 k Da。将CSN4构建至原核表达载体,获... 以野生型烟草(Nicotiana tabacum)为试验材料,采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4c DNA序列,基因登录号为KC866360。序列分析表明,CSN4基因ORF长为1194 bp,编码398个氨基酸,蛋白分子质量为43.78 k Da。将CSN4构建至原核表达载体,获得重组子pET28a-CSN4/BL21(DE3),通过Ni-IDA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western Blotting检测,结果显示:0.25 mM IPTG,15℃诱导16 h获得浓度为0.476 mg/m L、纯度高达95%的CSN蛋白,为后续CSN4基因功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 COP9信号复合体 基因克隆 原核表达 亲和纯化
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吡咯喹啉醌高通量检测方法的建立与优化 预览 被引量:1
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作者 夏雨 周景文 陈坚 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期122-128,共7页
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种新型辅酶,具有广阔的应用前景。传统PQQ检测方法在检测发酵液中PQQ浓度时都存在一定的缺陷,且检测效率偏低。本研究在大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))中表达E.coli K-12来... 吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种新型辅酶,具有广阔的应用前景。传统PQQ检测方法在检测发酵液中PQQ浓度时都存在一定的缺陷,且检测效率偏低。本研究在大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))中表达E.coli K-12来源的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH),并通过亲和层析分离纯化PQQGDH,得到了高浓度、高纯度的PQQGDH。通过酶液和PQQ样品用量的双因素正交实验对传统重组酶法的反应体系加以改进,得到适用于96孔板高通量检测的反应体系。结果表明30μL纯化后酶液、2μL PQQ样品配合1.2 m L的显色剂组成的显色体系检测效果最佳。该方法线性范围大且具有较高的精确度和重现性。本研究中利用高浓度、高纯度的PQQGDH配合96孔板和酶标仪,所建立的PQQ高通量检测方法,不仅降低了实验误差,而且大幅提高了PQQ发酵液样品的检测效率。 展开更多
关键词 吡咯喹啉醌 葡萄糖脱氢酶 亲和纯化 重组酶法检测 高通量检测
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拟南芥开花抑制基因TFL1多克隆抗体的纯化与特异性检测 预览
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作者 袁敏 张越 +3 位作者 王莉 葛伟娜 张岚 邢继红 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期18-23,共6页
为了获得敏感性和特异性高的TFL1多克隆抗体,本研究构建了GST-TFL1和His-TFL1原核表达载体并转入大肠杆菌表达菌株BL21中。经IPTG诱导和蛋白纯化,成功获得了分子量约为46kD的GST-TFL1和22kD的His-TFL1融合蛋白。利用纯化的融合蛋白His-T... 为了获得敏感性和特异性高的TFL1多克隆抗体,本研究构建了GST-TFL1和His-TFL1原核表达载体并转入大肠杆菌表达菌株BL21中。经IPTG诱导和蛋白纯化,成功获得了分子量约为46kD的GST-TFL1和22kD的His-TFL1融合蛋白。利用纯化的融合蛋白His-TFL1作为抗原免疫,获得了TFL1的多克隆抗体血清。抗体血清经偶联了GST-TFL1融合蛋白的纯化基质进行免疫亲和纯化获得了纯化的TFL1多克隆抗体。免疫印迹检测抗体敏感性和特异性发现,纯化后的抗体不仅能特异地识别细菌内纯化的GST-TFL1和His-TFL1融合蛋白,也能与拟南芥中TFL1蛋白发生特异性反应。该研究结果为深入研究TFL1抑制植物开花的分子机制提供了有力的工具。 展开更多
关键词 TFL1 多克隆抗体 亲和纯化 特异性 敏感性
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3α-羟类固醇脱氢酶的亲和纯化及化学修饰提高酶稳定性 预览
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作者 方亚男 段敬霞 +1 位作者 张玲 杨海麟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期747-751,共5页
研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAG... 研究了3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)经化学修饰后的稳定性变化。已构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET28a-hsd经诱导表达、镍柱亲和纯化得到电泳纯的3α-HSD酶,酶蛋白得率是16.5%,活性回收率为64.7%,纯化倍数约为3.8,15%SDS-PAGE结果显示3α-HSD酶为单一条带,相对分子质量在28 000左右。采用邻苯二甲酸酐(PA)作为修饰剂,对3α-HSD纯酶进行化学修饰,与对照组相比,修饰酶抵抗p H波动的能力有所增强,50℃水浴10 min后酶的热稳定性明显提高,37℃贮藏40 h后修饰酶的贮藏稳定性比原酶提高9倍。 展开更多
关键词 3α-羟类固醇脱氢酶 亲和纯化 邻苯二甲酸酐 化学修饰 稳定性
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突变型人源乙酰胆碱神经受体α7的构建表达纯化
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作者 张斯维 程浩 王旻 《药物生物技术》 CAS 2016年第2期95-98,共4页
为增强神经型乙酰胆碱受体(n AChR)蛋白的稳定性和表达量,以满足晶体学研究的要求。根据同源蛋白的氨基酸序列比对结果,设计了胞内5个切除位点,设计合适的引物,利用分子克隆的方法扩增出相应的改造后c DNA序列并构建到BacMam表达载体... 为增强神经型乙酰胆碱受体(n AChR)蛋白的稳定性和表达量,以满足晶体学研究的要求。根据同源蛋白的氨基酸序列比对结果,设计了胞内5个切除位点,设计合适的引物,利用分子克隆的方法扩增出相应的改造后c DNA序列并构建到BacMam表达载体,最后利用BacMam杆状病毒表达系统构建表达突变型重组杆状病毒,并转染到HEK293F哺乳动物细胞中,诱导表达重组蛋白。采用免疫印迹法小规模表达检测后,选取合适突变型进行表达,并利用MBP亲和层析和分子排阻法进行两步纯化后,通过电子显微镜负染技术检测纯化后的蛋白质量。结果显示,成功克隆并表达了乙酰胆碱神经受体α7的5种不同的胞内区域突变型,且蛋白表达量与野生型相比均有所提高,其中P5突变型表达量最高。经表达纯化后,能够获得毫克级别的乙酰胆碱受体蛋白,并且电子显微镜观察的结果表明蛋白呈现出相对稳定的五聚体形貌,大小尺寸与理论相符。 展开更多
关键词 神经型乙酰胆碱受体 BacMam哺乳动物细胞表达 亲和纯化 电子显微镜
抗A型流感病毒聚合酶碱性蛋白1多克隆抗体的制备和鉴定 被引量:1
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作者 秦玉洁 张廷虹 叶昕 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期105-113,共9页
流感病毒属于正黏病毒科,为有包膜包裹的单股负链RNA病毒。它的8个基因片段编码至少16种病毒蛋白,其中3个蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。流感病毒聚合酶碱性蛋白1(PB1)是该复合体的组分之一,在病毒的转录、复制及重配中发挥重要的... 流感病毒属于正黏病毒科,为有包膜包裹的单股负链RNA病毒。它的8个基因片段编码至少16种病毒蛋白,其中3个蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。流感病毒聚合酶碱性蛋白1(PB1)是该复合体的组分之一,在病毒的转录、复制及重配中发挥重要的作用。为研究其功能,构建His-PB1(aa 550–755)融合蛋白原核表达质粒,IPTG诱导融合蛋白表达,通过镍柱亲和将其纯化,然后作为抗原免疫家兔。对抗血清进行间接ELISA检测,表明抗体效价可达1∶100 000。兔源PB1蛋白抗血清经亲和纯化后,用于免疫印迹检测流感病毒WSN毒株PB1蛋白以及外源转染的FLAG-PB1蛋白,结果表明该PB1抗体具有良好的特异性,同时也能特异性识别其他亚型的A型流感病毒的PB1蛋白,为进一步研究流感病毒PB1蛋白的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 流感病毒 PB1 多克隆抗体 亲和纯化
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