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水稻稻瘟病抗性基因的克隆、育种利用及稻瘟菌无毒基因研究进展
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作者 杨德卫 王莫 +2 位作者 韩利波 唐定中 李生平 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期265-276,共12页
稻瘟病是世界上影响水稻(Oryza sativa)粮食生产的主要病害之一,抗病基因的发掘与利用是抗病育种的基础和核心。随着寄主水稻和病原菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)基因组测序和基因注释的完成,水稻和稻瘟病菌的互作体系成为研究植物与... 稻瘟病是世界上影响水稻(Oryza sativa)粮食生产的主要病害之一,抗病基因的发掘与利用是抗病育种的基础和核心。随着寄主水稻和病原菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)基因组测序和基因注释的完成,水稻和稻瘟病菌的互作体系成为研究植物与真菌互作的模式系统。该文对稻瘟病抗病基因的遗传、定位、克隆及育种利用进行概述,并通过生物信息学分析方法,探讨了水稻全基因组中NBS-LRR类抗病基因在水稻12条染色体上的分布情况,同时对稻瘟病菌无毒基因的鉴定及无毒蛋白与抗病蛋白的互作进行初步分析。最后对稻瘟病抗病基因研究存在的问题进行分析并展望了未来的研究方向,以期为水稻抗稻瘟病育种发展和抗病机制的深入理解提供参考。 展开更多
关键词 稻瘟病 基因定位 分子克隆 分子育种 无毒基因
三疣梭子蟹含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及其表达分析 预览
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作者 李蒙 王金凤 +1 位作者 黄骞 李才文 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期149-158,共10页
为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为... 为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为102bp,3′-UTR长度为87bp,开放阅读框长度为507bp,编码168个氨基酸,其中含有一个典型的由蛋白石终止密码子(220TGA222)编码的硒半胱氨酸(40U)。预测了该基因编码的氨基酸序列及其中的保守结构域,包括GPx家族签名序列(64LAFPCNQF71)、活性位点序列(152WNFEKF157)以及与酶催化活性相关的氨基酸位点包括谷氨酰胺(74Q)、精氨酸(90R和168R)和色氨酸(142W)。相似性比对和系统发育分析结果表明,三疣梭子蟹硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)与甲壳动物中的SeGPxs相似性较高,其中与拟穴青蟹SeGPx相似性最高,并与其在系统发育树中聚为一支。经血卵涡鞭虫侵染后(0—192h),SeGPx基因在三疣梭子蟹的血细胞、肝胰腺和鳃组织中的转录水平均发生显著性升高。该结果表明,SeGPx在三疣梭子蟹应对血卵涡鞭虫的免疫反应中发挥重要作用,可通过调控甲壳宿主体内被病原扰乱的氧化还原状态进而起到宿主组织保护作用。 展开更多
关键词 甲壳动物 固有免疫 寄生虫 谷胱甘肽过氧化物酶基因 分子克隆 基因表达
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嗜水气单胞菌气溶素的表达纯化和活性实验 预览
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作者 董靖 刘永涛 +3 位作者 胥宁 杨秋红 杨移斌 艾晓辉 《中国渔业质量与标准》 2019年第1期27-33,共7页
气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建ae... 气溶素(AerA)是嗜水气单胞菌分泌的重要毒力因子之一。为开展抗气溶素药物的筛选,本实验设计得到高纯度的气溶素重组蛋白并研究其生物学活性。本实验依据嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)序列设计特异性引物,采用PCR扩增、酶切、连接构建aerA-pGEX-6p-1原核表达载体,经测序验证后将其转化至BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导、亲和层析、离子交换层析纯化,然后进行溶血试验测定其生物学活性。结果表明,当表达温度为16℃,经0.2mmol/LIPTG诱导表达16h后可得到可溶性蛋白,纯化后其纯度大于95%,该蛋白对绵羊红细胞的溶血单位为54.17HU/μg。本实验通过原核表达、纯化得到的可溶性重组气溶素蛋白,具有良好的溶血活性,为进一步探究气溶素功能及其应用铺垫基础。[中国渔业质量与标准,2019,9(1):27-33]. 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 气溶素 原核表达 纯化 溶血活性 PCR扩增 分子克隆
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人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达
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作者 李莎莎 贺虹 +3 位作者 崔冠一 欧丽娜 邓博 王梅林 《生物技术》 CAS 2019年第3期205-209,共5页
[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该... [目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。 展开更多
关键词 Smurf1 分子克隆 转染 免疫荧光
草鱼脂酰辅酶A合成酶4基因全长cDNA分子克隆及表达调控 预览
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作者 韩振 高琦 +4 位作者 许建和 易乐飞 申欣 丁祝进 程汉良 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期2442-2450,共9页
本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同... 本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂0、3、6、12和24h后草鱼肝胰脏中ACSL4基因表达情况进行研究。结果显示:草鱼ACSL4基因cDNA全长2418bp,其开放阅读框2121bp,共编码706个氨基酸;草鱼ACSL4蛋白的氨基酸序列包含1个跨膜结构域、1个脂肪酸绑定基序和1个ATP/AMP绑定基序。草鱼ACSL4mRNA在大脑和脾脏中相对表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05),在肌肉中相对表达量最低;投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05);饥饿再投喂12h后,草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量达到最高值,显著高于其他时间段(P<0.05),24h后恢复至最初水平。本试验从草鱼10种混合组织中克隆了ACSL4基因全长cDNA,其所编码的氨基酸序列的主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ATP/AMP绑定基序在不同物种间高度保守;草鱼ACSL4基因主要在大脑和脾脏中表达;饲料中淀粉源对草鱼肝胰脏中ACSL4基因的表达无显著影响;在饥饿再投喂12h后,草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量达到最高值,随后显著下降至最初水平。 展开更多
关键词 草鱼 长链脂酰辅酶A合成酶4 分子克隆 表达调控
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黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析 预览 被引量:1
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作者 王鑫 金鹏 +3 位作者 宋鹏 董自星 刘晓光 王正祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期40-46,共7页
酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH >3.0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIMF0510的酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了克隆表达... 酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH >3.0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIMF0510的酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115(pPIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257380RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3.0;分别在40~50℃或pH2.5~3.5孵育1h后,仍能保留80%左右的活力。Zn^2+、Ca^2+、Fe^2+和Mn^2+对其活性有一定的促进作用;而Cu^2+、Co^2+、Fe^3+、EDTA和SDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 酸性蛋白酶 黑曲霉 分子克隆 酶学特征
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异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA克隆及其摄食功能 预览
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作者 商振达 刘锁珠 +3 位作者 谭占坤 商鹏 王宏辉 孔庆辉 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期834-843,共10页
旨在研究异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)缩胆囊素(cholecystokinin,CCK)基因的摄食功能。本研究克隆得到了异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其属于CCK-1亚型。异齿裂腹鱼CCK的cDNA全长为773 bp,其中开放阅读框... 旨在研究异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)缩胆囊素(cholecystokinin,CCK)基因的摄食功能。本研究克隆得到了异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其属于CCK-1亚型。异齿裂腹鱼CCK的cDNA全长为773 bp,其中开放阅读框(ORF)为372 bp,可以编码123个氨基酸。异齿裂腹鱼CCK由1个信号肽和1个典型的CCK-8肽保守结构域组成,为亲水性蛋白,但没有跨膜结构。运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测异齿裂腹鱼CCK基因在组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对其表达量的影响。结果表明,异齿裂腹鱼CCK在各组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,在肠道、心脏、肝、脾、肾、皮肤、鳃、眼和鳔中表达量相对较高,在肌肉中表达量最低。餐后CCK基因的表达量显著升高,禁食使异齿裂腹鱼CCK基因的表达量显著下降,而复喂使CCK基因的表达量显著上升,表明CCK基因既是异齿裂腹鱼的餐后饱感信号因子,又是长期调控摄食因子。本研究为异齿裂腹鱼的人工饲养和品种保护等提供了理论依据。 展开更多
关键词 CCK基因 异齿裂腹鱼 分子克隆 组织分布 摄食功能调节
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黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析 预览
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作者 蔡可 王太康 +5 位作者 王君 董自星 田康明 金鹏 刘晓光 王正祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期29-35,共7页
利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC3.2.1.89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌G... 利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC3.2.1.89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(pPIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶AghA的酶活为130U/mL,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4.5和45℃,且在pH4.0~6.0或30~50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶AghA的酶活没有显著影响;Fe^3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg^2+则可使AghA几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400mg/(mL·min)和0.08mg/mL。此外,重组酶AghA还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。 展开更多
关键词 内切β-1 4-半乳聚糖酶 低聚半乳糖 黑曲霉 分子克隆 酶学性质
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微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究概述 预览
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作者 孙晓明 辛嘉英 +3 位作者 王艳 吴永存 王宁 陈书明 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2019年第1期201-206,共6页
对微生物发酵法产阿魏酸酯酶以及释放阿魏酸的国内外研究进展进行综述,重点介绍阿魏酸酯酶的微生物来源、理化性质及阿魏酸酯酶分子克隆专利,同时对释放阿魏酸的生产工艺及影响因素进行简单总结,为探讨新产品的生产工艺提供参考信息。
关键词 阿魏酸酯酶 阿魏酸 培养条件 发酵优化 分子克隆
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忽地笑α-葡萄糖苷酶编码基因的分子克隆与原核表达
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作者 李宜奎 李洁 +2 位作者 程丽 钱彬彬 汪仁 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期3562-3569,共8页
利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花瓣中克隆获得一个α-葡萄糖苷酶编码基因Lau Agl。该基因cDNA全长2 810 bp,开放阅读框为2 613 bp,编码含有870个氨基酸残基的LauAgl蛋白质。LauAgl蛋白质氨基酸序列具有α-葡... 利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花瓣中克隆获得一个α-葡萄糖苷酶编码基因Lau Agl。该基因cDNA全长2 810 bp,开放阅读框为2 613 bp,编码含有870个氨基酸残基的LauAgl蛋白质。LauAgl蛋白质氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶特征性的保守结构域和天冬氨酸残基组成的活性中心,其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列,还具有一些蛋白质糖基化的潜在位点(N-X-S/T共有序列)。LauAgl蛋白质与石刁柏、椰子、油棕等其他植物的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列一致性达到63%以上。利用pET表达系统,通过截掉其N-端信号肽序列,可以实现LauAgl蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达。本研究为Lau Agl蛋白质的功能鉴定及其在忽地笑种子萌发与生长发育中的作用研究提供理论基础。 展开更多
关键词 忽地笑 Α-葡萄糖苷酶 分子克隆 原核表达
树鼩BACE1全长编码序列的克隆及分子特征分析 预览
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作者 苗雨润 李明学 +7 位作者 李娜 王文广 匡德宣 仝品芬 孙晓梅 罕园园 陆彩霞 代解杰 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第8期1-10,共10页
目的获取树鼩β-淀粉样前体蛋白切割酶BACE1(beta-site APP cleaving enzyme-1)的全长编码序列并进行分子特征分析,为开展AD疾病的机制研究提供依据。方法提取树鼩大脑及其他脏器组织总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)... 目的获取树鼩β-淀粉样前体蛋白切割酶BACE1(beta-site APP cleaving enzyme-1)的全长编码序列并进行分子特征分析,为开展AD疾病的机制研究提供依据。方法提取树鼩大脑及其他脏器组织总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)实验得到的序列与中间序列进行拼接得到树鼩BACE 1全长编码序列,使用DNAMAN、MEGA 10.0.5、PyMOL等生物信息学软件,对其序列和分子特征进行分析。结果树鼩BACE 1除在脑组织表达外,在外周组织也有表达。树鼩BACE 1核酸序列和蛋白质分子整体结构与人类高度相似,树鼩与人类的BACE1蛋白在膜内结构区均存在一个高度保守的DXXLL的ACDL分选内吞基序,两者具有相同的胞外域、跨膜域及胞内域,但树鼩BACE1蛋白质相比人少一个潜在的乙酰基化位点,并且在折叠结构上存在差异。结论本研究获得树鼩BACE 1基因完整编码序列,其蛋白基本结构与人的基本相似,提示树鼩可能是作为研究AD病理改变或药物研究潜在的理想模型。 展开更多
关键词 树鼩 β-淀粉样前体蛋白切割酶 分子克隆 结构预测 系统发育分析
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虹鳟Fc受体FcγR的α和γ亚基基因的克隆及表达分析 预览
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作者 王鹏 张弩 +1 位作者 张旭杰 张永安 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期27-36,共10页
Fc受体(FcR)是一种表达在免疫细胞表面的受体分子,由多亚基构成,通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc段结合引起包括炎症因子释放和吞噬作用等体液和细胞免疫反应。研究采用RACE技术首次克隆得到了虹鳟FcγR的α亚基基因(FcγRα)和γ亚基基因(FcR... Fc受体(FcR)是一种表达在免疫细胞表面的受体分子,由多亚基构成,通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc段结合引起包括炎症因子释放和吞噬作用等体液和细胞免疫反应。研究采用RACE技术首次克隆得到了虹鳟FcγR的α亚基基因(FcγRα)和γ亚基基因(FcRγ)的cDNA序列,采用生物信息学软件对FcγRα和FcRγ的序列进行了特征分析,实时荧光定量PCR检测了其在不同组织和细胞亚群中以及在Poly(I:C)和LPS刺激后头肾中的表达。结果显示:FcγRα的cDNA全长1677bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸;FcγRα由信号肽和2个Ig样结构域构成,但没有跨膜区和胞内区。FcRγ亚基存在2种形式,分别命名为FcRγ1和FcRγ2(包含FcRγ2a和FcRγ2b两个剪接异构体),它们均由信号肽、跨膜区和胞内的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)构成。氨基酸序列相似性分析表明虹鳟FcγRα与斑点叉尾鮰FcRI相同率最高(30%),虹鳟FcRγ1和FcRγ2a/2b与哺乳动物FcRγ相同率最高可达40%。组织表达显示FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在头肾、脾脏和血液中表达较高;细胞亚群表达显示FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在髓样细胞群中表达最高;LPS和Poly(I:C)刺激后,FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在头肾中的表达显著上调,这表明FcγR在机体抗细菌和抗病毒免疫中可能发挥重要作用。 展开更多
关键词 FC受体 FcγRα FcRγ 虹鳟 分子克隆 基因表达
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东北狍PTN基因cDNA克隆及表达分析
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作者 卢斌山 王强辉 +2 位作者 张强 高悦禹 夏彦玲 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期82-86,共5页
采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲... 采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质,其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占46.71%、32.34%和20.96%;生物信息分析发现,东北狍PTN基因在进化上较为保守,与其他物种同源性均>89%;构建的进化树表明,东北狍PTN基因与野牦牛、绵羊、野猪等偶蹄目动物亲缘关系较近,这一结果符合经典分类学规律;实时荧光定量RT-PCR分析显示,PTN基因在狍茸顶端组织不同生长层表达量存在显著差异,其中前软骨和间充质组织层的表达量明显高于皮肤和软骨组织层。 展开更多
关键词 东北狍 PTN基因 分子克隆 生物信息分析 实时荧光定量RT—PCR
树鼩PSEN1全长编码序列的克隆及分子特征分析 预览
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作者 李明学 王文广 +6 位作者 李娜 匡德宣 仝品芬 黄鑫 黎晓慧 孙晓梅 陆彩霞 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期456-465,共10页
目的 获取树鼩早老素蛋白-1(PSEN1)的全长编码序列并进行分子特征分析。方法 以树鼩脑组织总RNA为材料,通过RT-PCR、RACE-PCR扩增和序列拼接获得PSEN1基因全长编码序列,进而通过DNAMAN、MEGA等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析... 目的 获取树鼩早老素蛋白-1(PSEN1)的全长编码序列并进行分子特征分析。方法 以树鼩脑组织总RNA为材料,通过RT-PCR、RACE-PCR扩增和序列拼接获得PSEN1基因全长编码序列,进而通过DNAMAN、MEGA等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析。qRT-PCR和Western Blot进一步分析PSEN1在树鼩各个组织的表达模式。结果 克隆鉴定了树鼩PSEN1基因,其cDNA的开放阅读框全长1128 bp,编码375个氨基酸。通过系统发育谱系树、氨基酸序列对比分析,发现树鼩PSEN1与小鼠、大鼠等相比更接近人类和非人灵长类动物。qRT-PCR和Western Blot的结果表明,树鼩PSEN1在脑组织的表达量明显高于其他脏器组织。结论 通过克隆树鼩PSEN1基因序列并进行分析,为今后进一步深入研究该基因功能和建立相关疾病动物模型提供理论基础。 展开更多
关键词 树鼩 PSEN1 分子克隆 系统发育分析
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芜菁BrrCIPAS8基因的克隆,序列分析与功能预测
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作者 陈迪 李雄 +1 位作者 和兆荣 杨永平 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期388-395,共8页
镉(Cd)诱导蛋白AS8基因(cadmium-induced protein AS8, CIPAS8)广泛存在于植物中,可能参与了植物对Cd等金属离子的响应过程,但目前关于它的功能报道很少。本研究从芜菁(Brassica rapa var. rapa,Turnip)中克隆得到了BrrCIPAS8基因的CDS... 镉(Cd)诱导蛋白AS8基因(cadmium-induced protein AS8, CIPAS8)广泛存在于植物中,可能参与了植物对Cd等金属离子的响应过程,但目前关于它的功能报道很少。本研究从芜菁(Brassica rapa var. rapa,Turnip)中克隆得到了BrrCIPAS8基因的CDS序列,其全长开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸。预测的蛋白分子量为18.7 kD,理论等电点为8.35,不稳定系数为20.49。蛋白序列分析显示BrrCIPAS8蛋白有2个保守的跨膜结构域,亚细胞定位检测发现其定位于细胞质膜。基因表达量分析表明BrrCIPAS8基因主要在芜菁叶中表达,并随着植物生长有上调表达趋势。此外,BrrCIPAS8基因对多种金属离子胁迫有响应,Zn、Cu和Mn能诱导芜菁叶中BrrCIPAS8基因的表达,Co和Cd会抑制叶中BrrCIPAS8基因的表达。说明该基因可能参与了芜菁吸收和转运金属离子。本研究将促进对植物CIPAS8基因的认识,为深入研究BrrCIPAS8基因的功能提供理论依据。 展开更多
关键词 芜菁 分子克隆 基因表达 金属离子
盐肤木查尔酮异构酶的克隆、表达及特性分析
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作者 杨晓月 王景 +2 位作者 李晨 任竹梅 马文丽 《中国中药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第15期3253-3260,共8页
黄酮类化合物是药用植物盐肤木Rhus chinensis中主要的功能成分,具有多种药理活性,广泛用于疾病治疗和食品保健等领域。查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI,EC 5. 5. 1. 6)是黄酮类化合物生物合成途径的关键酶。该研究通过RTPCR及rapi... 黄酮类化合物是药用植物盐肤木Rhus chinensis中主要的功能成分,具有多种药理活性,广泛用于疾病治疗和食品保健等领域。查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI,EC 5. 5. 1. 6)是黄酮类化合物生物合成途径的关键酶。该研究通过RTPCR及rapid-amplification of c DNA Ends (RACE)技术克隆了盐肤木查尔酮异构酶(命名为Rc CHI)全长c DNA序列共1 058bp,包含738 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸。序列分析表明,Rc CHI与其他植物CHI序列相似性在47. 1%~71. 6%,属于Ⅰ型CHI。通过实时荧光定量PCR检测发现盐肤木不同组织总黄酮含量与Rc CHI的mRNA表达呈正相关。进一步构建原核表达载体p GEX-6P-1-RcCHI并转化大肠杆菌BL21,成功获得了重组Rc CHI的高效可溶表达。该研究为利用基因工程菌株进行黄酮类化合物的生物合成奠定了基础。 展开更多
关键词 盐肤木 查尔酮异构酶 分子克隆 表达 黄酮生物合成
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略
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作者 杨发誉 杨云彭 霍毅欣 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期364-370,共7页
随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的... 随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的培训周期长,不利于以流水线形式进行工程化使用,已经逐步在生物工程领域内被淘汰。文中论述了一系列适于机械化操作的新一代分子克隆技术,即不依赖基因序列和连接反应克隆方法、Gibson组装、聚合酶环形延伸克隆、细胞裂解物体外无痕连接和细胞体内组装克隆。对这些方法的建立、基本原理及应用前景等方面进行了总结,并对其优缺点进行了比较。 展开更多
关键词 分子克隆 不依赖基因序列和连接反应克隆方法 Gibson组装 聚合酶环形延伸克隆 细胞裂解物体外无痕连接 细胞体内组装克隆
日本鳗鲡UNAG蛋白的克隆及其在非结合胆红素检测中的应用 预览
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作者 刘晋强 李增鹏 陈建明 《应用海洋学学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期413-417,共5页
血清中非结合胆红素含量升高与新生儿脑损伤的发展相关,但目前临床上没有方法可以直接测定非结合胆红素的血清水平.从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中成功克隆了其UNAG基因,在原核细胞中成功表达UNAG重组蛋白,并通过Ni~(2+)-NTA进... 血清中非结合胆红素含量升高与新生儿脑损伤的发展相关,但目前临床上没有方法可以直接测定非结合胆红素的血清水平.从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中成功克隆了其UNAG基因,在原核细胞中成功表达UNAG重组蛋白,并通过Ni~(2+)-NTA进行纯化得到含量为1.8 mg/cm~3的UNAG目的蛋白,银染检测说明其纯度较高.利用该基因可以与非结合胆红素结合并发光的特异性,设计了一种新型的非结合胆红素检测方法,结果表明UNAG发光值与胆红素浓度呈良好的线性关系,回归方程为Y=17.96 X+4.333 3(R=0.994 9).该法可用于胆红素浓度的测定. 展开更多
关键词 海洋生物学 胆红素 日本鳗鲡 UNAG基因 分子克隆 检测
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16S rRNA甲基化酶RmtB耐药重组菌的构建及其稳定性研究 预览
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作者 陈琳 管远红 +12 位作者 黄东璋 齐富刚 魏冬霞 陈瀛川 张欢 王亚南 苏哲君 张洪涛 区卓麟 陈冬冬 吴怀秀 于淼淼 杨雨秋 《江苏农业科学》 2018年第19期167-170,共4页
为构建16SrRNA甲基化酶RmtB重组菌并测定其稳定性,应用分子克隆技术构建16SrRNA甲基化酶RmtB重组菌,采用菌落PCR、双酶切、药敏试验及序列分析等方法鉴定重组质粒,测定重组菌的生长曲线及传代后的最低抑菌浓度(MICs)以确定重组菌的稳定... 为构建16SrRNA甲基化酶RmtB重组菌并测定其稳定性,应用分子克隆技术构建16SrRNA甲基化酶RmtB重组菌,采用菌落PCR、双酶切、药敏试验及序列分析等方法鉴定重组质粒,测定重组菌的生长曲线及传代后的最低抑菌浓度(MICs)以确定重组菌的稳定性。结果表明,构建了16SrRNA甲基化酶RmtB重组菌pRmtB1、pRmtB2、pRmtB4。重组菌对阿米卡星、庆大霉素高度耐药。在没有抗生素选择压力下传代3次后,3株重组菌的生长曲线基本相似,但只有pRmtB1维持了对庆大霉素和阿米卡星的高度耐药性。由此可知,重组菌pRmtB1较稳定,可作为16SrRNA甲基化酶耐药抑制剂筛选模型。 展开更多
关键词 16SRRNA甲基化酶 RmtB 重组 分子克隆 耐药性
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USTB-05-B基因在大肠杆菌中的表达与纯化研究
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作者 张旭东 王华生 +1 位作者 刘祖文 闫海 《环境科学与技术》 CSCD 北大核心 2018年第1期1-5,共5页
采用生物学技术对高效降解线性微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)的USTB-05-B酶进行克隆表达及纯化研究。首先利用分子克隆技术得到重组菌pET30a(+)/USTB-05-B/BL21(DE3)。在诱导剂IPTG浓度为0.25 mmol/L、温度30℃和诱导时间... 采用生物学技术对高效降解线性微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)的USTB-05-B酶进行克隆表达及纯化研究。首先利用分子克隆技术得到重组菌pET30a(+)/USTB-05-B/BL21(DE3)。在诱导剂IPTG浓度为0.25 mmol/L、温度30℃和诱导时间4 h条件下,重组菌能大量表达目的蛋白。然后利用亲和层析柱对重组菌破碎后的无细胞提取液(cell free extracts,CE)进行纯化,当咪唑浓度为100 mmol/L时,洗脱下来的蛋白纯度高。最终得到USTB-05-B蛋白纯度为91.1%,浓度为0.205 mg/m L。纯化后的USTB-05-B酶具有较高的活性,能在1 h内将10.8 mg/L的线性MC-LR降解完全。纯化后的目的蛋白为研究USTB-05降解MCs分子机理奠定基础,为有效提高降解MCs速率提供新材料。 展开更多
关键词 微囊藻毒素 分子克隆 亲和层析 纯化
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