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人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定
1
作者 王石磊 靳鑫 +4 位作者 魏杰 张祥 阳媛 牛司强 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期555-560,共6页
目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后... 目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的 rhNGAL 抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G 亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争 ELISA 法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE 分析纯度;最后运用 Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度 NGAL 重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得 6 株高效价单克隆抗体;其中,25 号单抗为 IgG1 亚型,余者均属 IgG2a 亚型,且 19、35 号单抗的亲和常数分别为 3.06×10^9、2.14×10^9。SDS-PAGE 分析表明纯度均大于 90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论:本研究利用密码子优化技术高效表达制备了 NGAL 重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为 NGAL 的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。 展开更多
关键词 密码子优化 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体
全球抗体药物研发态势分析
2
作者 李东巧 陈芳 +6 位作者 Cynthia Liu Yingzhu Li Yi Deng 韩涛 余敏 杨艳萍 王学昭 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期11-21,共11页
1引言抗体(antibody,Ab)是指浆细胞(效应B细胞)在抗原刺激下产生并释放的可与其发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),是机体免疫系统的一个重要组成部分。根据抗体结合抗原决定簇的数量,抗体一般可以分为单克隆抗体(monoclon... 1引言抗体(antibody,Ab)是指浆细胞(效应B细胞)在抗原刺激下产生并释放的可与其发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig),是机体免疫系统的一个重要组成部分。根据抗体结合抗原决定簇的数量,抗体一般可以分为单克隆抗体(monoclonal antibody)和多克隆抗体(polyclonal antibody)。 展开更多
关键词 单克隆抗体 态势分析 药物研发 抗原决定簇 机体免疫系统 免疫球蛋白 特异性结合 多克隆抗体
双抗夹心ELISA快速检测冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a
3
作者 王怡雯 张帅 +4 位作者 张红星 齐颖颖 谢远红 刘慧 鲁舟 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第2期230-235,共6页
为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1... 为建立冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a双抗夹心ELISA检测体系,采用福氏志贺氏菌2a抗原免疫获得多克隆抗体,应用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选出1株福氏志贺氏菌2a单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为2C10。试验结果表明,2C10杂交瘤细胞株抗体效价为1∶10.24×104,抗体纯度为96%,免疫球蛋白亚型为IgG2a。用此单克隆抗体作为检测抗体,多克隆抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心ELISA体系,检测限为1 000 CFU/g。用此体系检测宋内志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌及阪崎肠杆菌,均无交叉反应。本研究可为冷鲜肉中福氏志贺氏菌2a的检测提供一种特异性强,准确度高的ELISA检测方法。 展开更多
关键词 福氏志贺氏菌2a 双抗夹心ELISA 单克隆抗体 多克隆抗体
重组鹅IFN-α在大肠杆菌中的表达及抗血清制备
4
作者 周游 杨文涛 +9 位作者 黄科谚 晋玉北 冯博 石春卫 黄海滨 王建忠 姜延龙 康元环 杨桂连 王春凤 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第19期5-9,共5页
为了研究鹅α干扰素(goIFN-α)基因原核表达产物的反应原性并进行goIFN-α抗血清的制备,试验首先根据大肠杆菌偏爱密码子对goIFN-α基因进行优化,随后采用PCR方法扩增goIFN-α编码序列并进行同源性分析。将goIFN-α片段与表达载体pET-28... 为了研究鹅α干扰素(goIFN-α)基因原核表达产物的反应原性并进行goIFN-α抗血清的制备,试验首先根据大肠杆菌偏爱密码子对goIFN-α基因进行优化,随后采用PCR方法扩增goIFN-α编码序列并进行同源性分析。将goIFN-α片段与表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot检测。通过切胶回收的方法回收目的条带,将碾碎的蛋白胶与PBS混合后注入小鼠体内,15 d后回收血清进行Western-blot检测。结果表明:试验成功扩增出goIFN-α基因;与多种IFN-α基因序列进行比较,goIFN-α基因氨基酸序列的同源性为92.5%~98.1%;随后成功构建出重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,重组蛋白goIFN-α的分子质量约为18 ku,具有良好的反应原性;回收血清进行Western-blot检测,鼠抗goIFN-α血清制备成功。说明重组goIFN-α蛋白能够在大肠杆菌中表达,大小符合预期且具有良好的反应原性,并成功制备出鼠抗goIFN-α血清。 展开更多
关键词 鹅 基因工程 干扰素Α 基因克隆 原核表达 多克隆抗体
猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 预览
5
作者 杨文静 李玉鹏 +5 位作者 梁冬梅 王倩 杨升 乔家运 姚胜宁 李海花 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第9期2707-2714,共8页
试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP 6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+... 试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP 6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP 6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪NLRP6蛋白 克隆 原核表达 多克隆抗体
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刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用
6
作者 闫爱霞 邹洋 +5 位作者 黄敏君 李晶晶 李威 田小军 贾永根 谷俊朝 《中国热带医学》 CAS 2019年第7期634-637,共4页
目的原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAG... 目的原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示:TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示:TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 弓形虫前纤维蛋白 多克隆抗体 内参抗体
趋化因子CCL28基因的克隆表达及其多抗制备 预览
7
作者 陆文静 王礼学 +7 位作者 王国相 王伟康 谢泉 谢菁 邵红霞 高巍 秦爱建 叶建强 《扬州大学学报:农业与生命科学版》 CAS 北大核心 2019年第4期44-48,54共6页
将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命... 将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命名为pcDNA3.1-CCL28。间接免疫荧光及Western blot试验结果进一步证明,所获得的抗GST-CCL28多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-CCL28质粒的DF-1细胞内高表达的CCL28蛋白。这一研究为制备抗CCL28单克隆抗体和探究与CCL28相关的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 趋化因子CCL28 克隆表达 多克隆抗体
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小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体的制备及鉴别 预览
8
作者 吴国娣 蒋煊 +3 位作者 徐福远 吴岚岚 陈佳妮 傅红兴 《生物化工》 2019年第3期67-69,共3页
目的:制备得到小鼠抗家兔胰岛细胞的多克隆抗体。方法:选择雄性新西兰大白兔作为胰岛供体,采用胆总管灌注胶原酶的方法进行胰岛细胞团的分离,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂超声乳化后,选择雌性Balb/c小鼠进... 目的:制备得到小鼠抗家兔胰岛细胞的多克隆抗体。方法:选择雄性新西兰大白兔作为胰岛供体,采用胆总管灌注胶原酶的方法进行胰岛细胞团的分离,用磷酸盐缓冲液洗涤细胞,加入弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂超声乳化后,选择雌性Balb/c小鼠进行多次免疫接种,收集含抗体的小鼠血清,进行家兔胰腺组织的免疫组化实验,观察阳性染色情况。结果:通过家兔胰腺组织HE染色和免疫组化染色,可明显观察到胰岛部位呈阳性染色,确认小鼠血清中存在抗家兔胰岛细胞多克隆抗体。结论:通过本方法可制得小鼠抗家兔胰岛细胞多克隆抗体。 展开更多
关键词 抗胰岛细胞抗体 多克隆抗体 免疫组化 胰岛分离纯化
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草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用 预览
9
作者 范成坚 苏博洋 苏建国 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2019年第1期9-13,共5页
为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼... 为探讨干扰素3(Interferon3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 干扰素3 多克隆抗体 抗体效价 蛋白表达
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免疫分析多残留同步法测定饲料中硝基呋喃类药物
10
作者 袁利鹏 刘波 +1 位作者 马莹 尹凯丹 《食品安全质量检测学报》 CAS 2019年第16期5427-5431,共5页
目的建立酶联免疫吸附多残留同步法测定饲料中硝基呋喃类违禁药物残留的分析方法。方法采用5-硝基糠醛和对羧基苯肼反应合成含有硝基呋喃类共有结构的半抗原4-硝基呋喃甲醛-(4-羧基-苯基)-腙(4-nitrofuran formaldehyde-(4-carboxyl phe... 目的建立酶联免疫吸附多残留同步法测定饲料中硝基呋喃类违禁药物残留的分析方法。方法采用5-硝基糠醛和对羧基苯肼反应合成含有硝基呋喃类共有结构的半抗原4-硝基呋喃甲醛-(4-羧基-苯基)-腙(4-nitrofuran formaldehyde-(4-carboxyl phenyl)hydrazon,NFHBA)。通过偶联载体蛋白牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)后的免疫原NFHBA-BSA免疫新西兰大白兔,成功制备了特异性识别呋喃环位点硝基的多克隆抗体。结果该抗体对4种目前主要使用的硝基呋喃类抗生素药物:呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、块喃妥因的检测半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别达5.2、64、26.6、4.2 ng/mL,饲料样品平均添加回收率均在80%-90%之间。结论该方法能达到产品检测要求,可用于饲料中硝基呋喃类药物多残留同步快速检测。 展开更多
关键词 硝基呋喃 半抗原 多克隆抗体 多残留
猪流行性腹泻病毒流行株S蛋白高变区B细胞线性表位肽的鉴定
11
作者 刘英杰 李凤平 +4 位作者 董世娟 王瑞阳 于瑞嵩 王燕 李震 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1772-1784,共13页
【背景】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,变异位点主要集中在S蛋白的N端。【目的】鉴定PEDV流行毒株S蛋白高变区(S10A,1-496 aa)的B细胞线性表位肽,特别是流行毒... 【背景】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,变异位点主要集中在S蛋白的N端。【目的】鉴定PEDV流行毒株S蛋白高变区(S10A,1-496 aa)的B细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性B细胞表位肽。【方法】以SDS-PAGE割胶纯化大肠杆菌表达的PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区片段(S10A^SD2014),免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;在E.coli中谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase,GST)融合表达覆盖S10A^SD2014序列全长且彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S10A^SD2014多抗为一抗,通过Western blot筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S10A^SD2014上的B细胞线性表位肽;利用抗PEDV经典毒株(CV777)S蛋白高变区片段(S10A^CV777)多抗血清鉴定S10A^SD2014上的保守性B细胞线性表位肽。【结果】重组表达的S10A^SD2014相对分子质量约为72 kD;纯化的S10A^SD2014表位肽能被PEDV阳性血清识别。制备的抗S10A^SD2014多抗可以识别PEDV DR13弱毒株。利用抗S10A^SD2014血清和抗S10A^CV777血清从61个GST融合表达的16肽中鉴定到28个阳性反应16肽,其中13个为2种血清共同识别16肽。对24株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明2个阳性16肽为保守性表位肽。【结论】确定了PEDV流行株SD2014 S蛋白高变区的B细胞线性表位肽,B细胞线性表位肽,特别是流行毒株特异性表位肽的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立以表位为基础的PEDV感染检测方法打下良好基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 纤突蛋白高变区 多克隆抗体 B细胞线性表位
猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定
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作者 李凤平 刘英杰 +4 位作者 董世娟 王瑞阳 王剑 于瑞嵩 李震 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1785-1795,共11页
【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆... 【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E.coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 多克隆抗体 线性B细胞表位
Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 预览
13
作者 余琳 吕利群 王浩 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1463-1471,共9页
针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基... 针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型鲤疱疹病毒 ORF121 原核表达 多克隆抗体 间接免疫荧光检测
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NMHC-ⅡA蛋白的重组表达、多克隆抗体制备及其功能的初步探讨 预览
14
作者 熊丹 杜勇 +3 位作者 张华 武薇 莫红梅 张秀明 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第11期1281-1285,1292共6页
目的 对人源非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHC-ⅡA)蛋白进行重组表达、纯化并制备其多克隆抗体,初步探讨其生物学功能。方法 将MYH9编码基因克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG诱导重组表达。以谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠纯化产物为免疫原制备兔抗N... 目的 对人源非肌肉肌球蛋白重链ⅡA(NMHC-ⅡA)蛋白进行重组表达、纯化并制备其多克隆抗体,初步探讨其生物学功能。方法 将MYH9编码基因克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,IPTG诱导重组表达。以谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠纯化产物为免疫原制备兔抗NMHC-ⅡA多克隆抗体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和免疫印迹(Western-blot)检测抗体特异性;采用酶联免疫吸附法(ELISA)对纯化抗体的活性进行评价;采用抗体阻断试验进一步证实NMHC-ⅡA在EB病毒(EBV)感染鼻咽上皮细胞中的作用。结果 本研究生产和纯化两株多克隆NMHC-ⅡA抗体的浓度分别是600μg/mL和1.35mg/mL。制备的NMHC-ⅡA多克隆抗体以剂量依赖性的方式抑制EB病毒感染上皮细胞。结论 本研究成功实现NMHC-ⅡA的重组表达、抗体制备,实现了对其功能的初步研究,为其在鼻咽癌的发生发展过程中进一步深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 EB病毒 非肌肉肌球蛋白重链ⅡA 多克隆抗体 免疫特异性
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水疱性口炎病毒纯化抗原制备多克隆抗体的检测结果分析 预览
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作者 胡涛 金郁 +1 位作者 汪学龙 李群 《热带病与寄生虫学》 2019年第1期40-42,共3页
目的水疱性口炎病毒纯化抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,免疫学方法检测其结果分析比较。方法纯化的抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,采用双向琼脂扩散试验,间接ELISA方法和中和试验测定效价。结果兔抗VSV多克隆抗体最高效价双向琼脂扩散试验为1... 目的水疱性口炎病毒纯化抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,免疫学方法检测其结果分析比较。方法纯化的抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,采用双向琼脂扩散试验,间接ELISA方法和中和试验测定效价。结果兔抗VSV多克隆抗体最高效价双向琼脂扩散试验为1∶32,间接ELISA法为1∶640,中和试验为1∶256。结论试验结果分析比较表明,建立纯化抗原制备的兔抗VS多克隆抗体,中和试验特异性好、敏感性高,可做为VSV的血清学检测和流行抗学调查抗供技术保障。 展开更多
关键词 水疱性口炎病毒 中和试验 抗原纯化 多克隆抗体
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越南水稻黄矮病毒多克隆血清抗体的制备 预览
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作者 何越强 陈氏懦花 +5 位作者 陈阮河 杜新勇 阮德辉 韦善富 覃武 吕荣华 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1472-1482,共11页
【目的】制备用于检测水稻黄矮病毒(RYSV)的多克隆抗体,为水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断提供技术支持。【方法】利用两种不同来源的RYSV抗原免疫家兔,一种是从受感染的水稻病叶组织纯化获得RYSV病毒粒子;另一种是从越南RYSV分离株克隆出完... 【目的】制备用于检测水稻黄矮病毒(RYSV)的多克隆抗体,为水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断提供技术支持。【方法】利用两种不同来源的RYSV抗原免疫家兔,一种是从受感染的水稻病叶组织纯化获得RYSV病毒粒子;另一种是从越南RYSV分离株克隆出完整N蛋白编码基因,然后将其连接至pET-28a载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中进行诱导表达获得N蛋白抗原。其中,N蛋白抗原又以两种形式(洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆)对家兔进行免疫。最后,采用PTA-ELISA分析评估家兔抗体血清(多克隆抗体)对水稻叶片和黑尾叶蝉RYSV的特异性和敏感性。【结果】分离自越南RYSV分离株的N基因由1542个核苷酸组成,与来自我国和日本RYS分离株N基因序列进行比对,其核苷酸序列同源性分别为98.1%和97.9%,对应的推导氨基酸序列同源性为83.4%和99.4%。以RYSV病毒粒子、洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆3种抗原免疫家兔获得的多克隆抗体均能有效检测出水稻植株中的RYSV,其中,感病植株的OD405分别为1.449、2.337和1.649,健康植株的OD405分别为0.375、0.294和0.283。PTA-ELISA检测结果表明,获得的多克隆抗体能从单个带病毒黑尾叶蝉中检测出RYSV,且该结论在RT-PCR检测中得到进一步验证。【结论】制备获得的多克隆抗体对RYSV具有较高特异性和敏感性,可用于水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断,同时表明以含有病毒植物蛋白的聚丙烯酰胺切片直接注射免疫模型动物制备多克隆抗体具有可行性。 展开更多
关键词 水稻黄矮病毒 多克隆抗体 酶联免疫吸附测定(ELISA) N蛋白 表达 病毒纯化
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抗重金属汞、镉离子小鼠多克隆抗体快速制备 预览
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作者 吴峰 吕琦 +2 位作者 毛茅 岑瑜 马岚 《云南大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第A01期108-111,共4页
用鸡卵清蛋白偶联EDTA螯合的重金属汞离子、镉离子作为免疫原,采用快速免疫佐剂分别免疫Balb/C小鼠,并通过腹腔注射NS-1骨髓瘤细胞,制备抗重金属汞离子、镉离子小鼠多克隆抗体腹水.通过此方法可快速大量获得高效价的能用于重金属汞离子... 用鸡卵清蛋白偶联EDTA螯合的重金属汞离子、镉离子作为免疫原,采用快速免疫佐剂分别免疫Balb/C小鼠,并通过腹腔注射NS-1骨髓瘤细胞,制备抗重金属汞离子、镉离子小鼠多克隆抗体腹水.通过此方法可快速大量获得高效价的能用于重金属汞离子、镉离子免疫检测试剂开发的小鼠多克隆抗体. 展开更多
关键词 重金属 汞 镉 多克隆抗体
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利用番鸭整合素α4亚基多克隆抗体对MDRV感染雏番鸭淋巴细胞归巢的研究 预览
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作者 刘珍妮 李明慧 +5 位作者 骆钰 刘秉珲 黄诗杭 吴宝成 黄一帆 吴异健 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期847-852,共6页
为研究番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染鸭后肠淋巴细胞归巢中的细胞定位,本研究通过RT-PCR方法扩增番鸭肠道α4编码基因,构建重组表达质粒p ET-His-α4,将其转化E.coli BL21 (DE3)表达了r His-α4,以其为抗原免疫福建黄兔,制备了抗r His-α4... 为研究番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染鸭后肠淋巴细胞归巢中的细胞定位,本研究通过RT-PCR方法扩增番鸭肠道α4编码基因,构建重组表达质粒p ET-His-α4,将其转化E.coli BL21 (DE3)表达了r His-α4,以其为抗原免疫福建黄兔,制备了抗r His-α4多克隆抗体,该多克隆抗体的间接ELISA和琼扩效价分别为1∶52 000和1∶32。利用制备的多抗对MDRV感染的番鸭淋巴细胞进行western blot和间接免疫荧光检测,结果显示体外淋巴细胞在感染MDRV后,α4蛋白的表达量呈增长趋势;雏番鸭感染MDRV后盲肠的α4+淋巴细胞增加的同时CFSE+淋巴细胞也显著增加,表明MDRV感染后诱导淋巴细胞大量表达了α4整合素,导致淋巴细胞向肠道黏膜组织归巢。本研究制备的番鸭r His-α4兔源多克隆抗体可以用于番鸭整合素α4的检测,同时也为进一步阐明MDRV感染诱导淋巴细胞归巢的分子机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 番鸭整合素α4 原核表达 多克隆抗体 番鸭呼肠孤病毒 淋巴细胞归巢
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黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用 预览
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作者 李歌 董旭 +2 位作者 危婉婷 叶彦杰 兰汉红 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1483-1488,共6页
【目的】制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持。【方法】通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,... 【目的】制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持。【方法】通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a重组构建重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体,并以多克隆抗体为一抗,采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况。【结果】RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp,构建的pET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白,其最适表达条件:温度28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间5 h,摇床转速220 r/min。以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1∶106,抗体浓度约350μg/mL。Western blotting检测结果表明,AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒(RDV)感染黑尾叶蝉中均有表达,但与健康黑尾叶蝉相比,AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高,即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平。【结论】制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价,且特异性强,可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平,进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制。 展开更多
关键词 水稻矮缩病毒(RDV) 黑尾叶蝉 RNAI AGO2蛋白 多克隆抗体 效价
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青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法的建立 预览
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作者 刘伟怡 刘凤银 +4 位作者 江海超 王宇 刘佳 邹红丽 穆洪涛 《生物化工》 2019年第1期52-55,59共5页
为了建立青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法,本文通过活泼酯法将青霉素G(PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-OVA,将PEN-BSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,研究了同源包被与异源包被模式及ELISA各影响因素对检测灵敏度的影响,并考察了... 为了建立青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法,本文通过活泼酯法将青霉素G(PEN)合成人工抗原PEN-BSA和PEN-OVA,将PEN-BSA免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,研究了同源包被与异源包被模式及ELISA各影响因素对检测灵敏度的影响,并考察了此方法对测定牛奶中青霉素类抗生素残留的适用性。结果表明:制备的PEN多克隆抗体效价高达10^-5,测定8种青霉素类抗生素几乎无交叉反应,以CAR-OVA为异源包被原具有较高的灵敏性,最低可检测浓度为2.22μg/mL,检测限为0.14μg/mL。以1、10、100μg/mL作为加标浓度,添加回收率范围为74.0%~106.3%,变异系数小于0.21%。 展开更多
关键词 青霉素类抗生素 广谱性 多克隆抗体 异源包被 ELISA
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