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米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造 预览
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作者 蔡海莺 沈灵智 +3 位作者 赵敏洁 李杨 毛建卫 冯凤琴 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第4期85-91,共7页
米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的合成活性、热稳定性、溶剂耐受性以及sn-1,3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点。本研究通过密码子优化改造RML编码基因,并将其克隆、转化到毕赤酵母GS115菌株,经诱导发酵156h,酶活达到3.77U/mL。... 米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的合成活性、热稳定性、溶剂耐受性以及sn-1,3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点。本研究通过密码子优化改造RML编码基因,并将其克隆、转化到毕赤酵母GS115菌株,经诱导发酵156h,酶活达到3.77U/mL。为了进一步改善RML脂肪酶的重组表达,通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2酶切位点,结果显示:RML突变体表达量均显著低于野生型的RML脂肪酶,表明“-Arg196-Arg197-”序列并不影响RML的重组表达。通过对RML蛋白结构分析,Kex2酶切位点的肽键被包埋在蛋白内部,这表明该位点区域的折叠在进入分泌途径时已基本完成。本研究对异源蛋白的酵母重组表达具有一定参考价值。 展开更多
关键词 米黑根毛霉脂肪酶 重组表达 毕赤酵母 密码子优化 sn-1 3位置专一性
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人NGAL克隆表达及抗体的制备与鉴定
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作者 王石磊 靳鑫 +4 位作者 魏杰 张祥 阳媛 牛司强 汪德强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期555-560,共6页
目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后... 目的:高效表达人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)重组蛋白并制备其多克隆及单克隆抗体。方法:人工合成经密码子优化的 NGAL 基因,构建原核表达重组质粒 pW28-NGAL,IPTG 诱导表达后分离纯化并分析在溶液中的聚集状态;获得的 rhNGAL 抗原免疫兔子制备多克隆抗体,免疫小鼠筛选高效价的特异性单克隆抗体并鉴定抗体亚型;Protein G 亲合柱纯化,等温滴定量热法及非竞争 ELISA 法检测抗体的亲和力,SDS-PAGE 分析纯度;最后运用 Western blot、免疫荧光和免疫组化对抗体进行鉴定。结果:高效获得高纯度 NGAL 重组蛋白,主要以单体形式存在;成功制备兔多抗,同时筛选获得 6 株高效价单克隆抗体;其中,25 号单抗为 IgG1 亚型,余者均属 IgG2a 亚型,且 19、35 号单抗的亲和常数分别为 3.06×10^9、2.14×10^9。SDS-PAGE 分析表明纯度均大于 90%。进一步的鉴定结果表明制备的抗体皆具有良好免疫反应性及特异性,且单抗的特异性明显高于多抗。结论:本研究利用密码子优化技术高效表达制备了 NGAL 重组蛋白,获得了其高效价多克隆抗体和高特异性单克隆抗体,为 NGAL 的病理生理作用等功能研究提供了良好的实验材料,为NGAL临床免疫检测诊断试剂的国产化奠定了有力的基础。 展开更多
关键词 密码子优化 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体
重组人bFGF的原核表达及功能分析
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作者 窦媛媛 林艳 +3 位作者 高向征 王燕芳 王小引 王天云 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2019年第7期1365-1370,共6页
为研究重组人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor, bFGF)的原核表达及纯化条件,并分析其功能,该研究根据bFGF基因序列,优化密码子,构建pE T-28a原核表达载体,经IPTG诱导, SDS-PAGE电泳分析验证,采用Ni柱进行... 为研究重组人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor, bFGF)的原核表达及纯化条件,并分析其功能,该研究根据bFGF基因序列,优化密码子,构建pE T-28a原核表达载体,经IPTG诱导, SDS-PAGE电泳分析验证,采用Ni柱进行分离纯化目的蛋白bFGF。培养NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞,并进行CCK-8实验检测蛋白活性。结果显示,成功构建原核表达载体。经电泳分析,在1 mmol/L IPTG诱导条件下,成功表达目的蛋白bFGF,表达量约占菌体蛋白量32%,蛋白纯度约为96%。活性检测结果显示, ED50分别为5.97 ng/mL、4.21 ng/mL、6.71 ng/mL,可以有效促进NIH3T3细胞、HEK293细胞及CHO细胞增殖。该研究得出,经原核表达系统成功表达人bFGF蛋白且其活性较高。 展开更多
关键词 大肠杆菌 重组人bFGF 密码子优化 表达 纯化
三疣梭子蟹PtCrustin2抗菌肽基因优化及其在毕赤酵母中高效表达 预览
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作者 王艳慧 陶妍 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期42-46,共5页
Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定。参考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根据毕赤酵母( Pichi... Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定。参考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根据毕赤酵母( Pichia pastoris )的密码子偏爱性对其相关密码子进行优化,合成5′端含 Xho Ⅰ限制性位点和Kex2信号肽酶切位点、3′端含 Xba Ⅰ限制性位点和6×his标签的目的基因“ smPtCrustin2 ”;以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA- smPtCrustin2,将其转入毕赤酵母X-33细胞后,通过含高浓度博来霉素的抗性平板筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子;筛选获得的酵母转化子在28 ℃、250 r/min条件下,使用0.5%甲醇诱导表达目的蛋白,并通过固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行分离纯化。Tricine-SDS-PAGE分析显示:纯化的重组体smPtCrustin2的分子量约为9.6 ku,并形成分子量约20 ku的二聚体。Western Blot分析进一步证明了纯化产物为预期的目的蛋白。建立的毕赤酵母表达系统获得了表达量为22.4 mg/L的重组体smPtCrustin2。 展开更多
关键词 三疣梭子蟹 PtCrustin2成熟肽 密码子优化 毕赤酵母 重组DNA表达
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EB病毒EA-D抗原在毕赤酵母中的表达及产物在鼻咽癌血清学诊断中的应用
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作者 王瑞雪 张丽中 +2 位作者 韩亚萍 李林 罗敏琪 《中国卫生检验杂志》 CAS 2019年第6期644-647,共4页
目的合成适合酵母表达的EB病毒(EBV)早期弥散型抗原(EA-D)基因BMFR1,在毕赤酵母中表达;探讨表达产物在鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)血清学诊断中的应用。方法选用酵母偏爱的密码子合成BMFR1基因转入毕赤酵母菌株表达;将重组EA-... 目的合成适合酵母表达的EB病毒(EBV)早期弥散型抗原(EA-D)基因BMFR1,在毕赤酵母中表达;探讨表达产物在鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)血清学诊断中的应用。方法选用酵母偏爱的密码子合成BMFR1基因转入毕赤酵母菌株表达;将重组EA-D作为包被抗原,用ELISA检测IgA;收集NPC患者以及健康体检者血清进行检测。结果SDS电泳、免疫印迹显示EBV EA-D在毕赤酵母表达;早期和晚期NPC患者EA-D-IgA阳性检出率分别为60.0%和68.8%,高于对照组5.0%,差异具有统计学意义(P<0.05)。早期NPC患者组与晚期患者组之间差异无统计学意义(P>0.05)。该方法诊断NPC的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为(早期NPC组/晚期NPC组):60.0%/68.8%、95.0%/95.0%、47.4%/76.7%、96.9%/92.7%。结论毕赤酵母表达出重组EBV EA-D抗原,用表达产物建立的EA-D-IgA抗体检测方法可作为NPC诊断的辅助手段。 展开更多
关键词 BMRF1 毕赤酵母 密码子优化 鼻咽癌
马槟榔甜蛋白基因(MabinlinⅡ)的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达 预览
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作者 何明娟 刘宁 +3 位作者 邹曙明 蒋霞云 潘迎捷 吴文惠 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第18期78-84,共7页
本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载... 本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-MabinlinⅡ(AB)Plus,进而转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果表明,密码子优化后的基因MabinlinⅡ(AB)Plus在大肠杆菌中最佳表达条件为:最适IPTG浓度1.4 mmol/L,最佳诱导剂温度为37℃,最适菌株起始生长量OD600为0.7,最佳诱导时间8 h。在最佳诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白约33.0%,与优化前约有提高7%。目的蛋白的上清液经过亲和纯化,在19 kDa处有单一的目的条带。经过感官评定,目的蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。这为研发以马槟榔甜蛋白为基础的新型甜味剂提供了科学的理论依据。 展开更多
关键词 甜蛋白 MabinlinⅡ 密码子优化 诱导表达
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产角蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建及酶学性质 预览
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作者 许佳惠 尹雅洁 +4 位作者 李欣悦 柳凯 梁运祥 赵述淼 胡远亮 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期71-76,共6页
将Brevibacillus brevis US575角蛋白酶基因kerUS进行密码子优化,并在毕赤酵母GS115中表达,以提高角蛋白酶产量。结果表明:优化的基因可在毕赤酵母中成功表达,重组角蛋白酶的分子质量约30 ku,最佳反应条件为pH 9.5和60℃,1 mmol/L的Mn^2... 将Brevibacillus brevis US575角蛋白酶基因kerUS进行密码子优化,并在毕赤酵母GS115中表达,以提高角蛋白酶产量。结果表明:优化的基因可在毕赤酵母中成功表达,重组角蛋白酶的分子质量约30 ku,最佳反应条件为pH 9.5和60℃,1 mmol/L的Mn^2+、Ba^2+对角蛋白酶活性有促进作用。此外,重组角蛋白酶易降解干酪素和β角蛋白(羽毛粉),酶促反应最大速度v max=0.019 g/(L·min),Km=4.64 g/L,比活力=440/mg。研究获得的产角蛋白酶重组毕赤酵母具有较好的应用前景。 展开更多
关键词 角蛋白酶 毕赤酵母 密码子优化 重组 表达
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组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达 预览
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作者 陈双全 刘松 +1 位作者 堵国成 陈坚 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期35-43,共9页
本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到... 本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。p PIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1%。在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1)。结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3%,达到450.12 U/mL。应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3 L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL。研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义。 展开更多
关键词 碱性果胶酶 毕赤酵母 密码子优化 分子伴侣 指数流加
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基于密码子优化策略的斑马鱼FOXP3A分子的原核表达及多克隆抗血清制备 预览
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作者 陈芳 王兰 张左兵 《生物技术通讯》 CAS 2019年第1期47-52,共6页
目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白的原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA的894bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑... 目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白的原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA的894bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白并纯化,纯化后的蛋白免疫家兔,制备斑马鱼FOXP3A蛋白的多克隆抗血清,4次免疫后取血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果:在16℃经0.5mmol/LIPTG诱导10h的条件下,SDS-PAGE分析表明斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白以包涵体形式产生;间接ELISA检测结果显示,FOXP3A蛋白多克隆抗血清的效价在1.6×10^5以上。结论:制备了高效价的斑马鱼FOXP3A多克隆抗血清,为进一步解析斑马鱼FOXP3A蛋白的功能提供了基础工具。 展开更多
关键词 斑马鱼 FOXP3A 密码子优化 原核表达 多克隆抗血清
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高产β-丙氨酸基因工程菌的构建与优化 预览
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作者 李博 宿承璘 +2 位作者 范超 洪皓 张春枝 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期1-4,共4页
为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,得到重组菌后,采用不同方法进行优化。通过选用不同表达载体、对目的基因序列进行密码子优化以及对菌株进行... 为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,得到重组菌后,采用不同方法进行优化。通过选用不同表达载体、对目的基因序列进行密码子优化以及对菌株进行自动诱导的策略,逐步提高目的蛋白的表达量,进而提高β-丙氨酸产量。结果表明,经优化后,菌株30a-1的β-丙氨酸产量提高到140.82mmol/L,较优化前提高了2.5倍。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸-α-脱羧酶 Β-丙氨酸 密码子优化 自动诱导
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FAdV-4 NP株F1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 预览
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作者 陈媛 屈贵蜀 +2 位作者 彭尧舜 许丽惠 王全溪 《福建农林大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第5期614-618,共5页
根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化,以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物,将... 根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化,以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物,将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白,最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·􀅰L^-1,最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃,咪唑洗脱浓度为80 mmol·􀅰L^-1时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000. 展开更多
关键词 禽腺病毒血清4 F1 基因 原核表达 密码子优化 多克隆抗体
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狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白密码子优化、原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 郭冰峰 张少宁 +3 位作者 安文琪 梁雪爽 张静静 马小伟 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期147-151,共5页
目的对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,... 目的对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经亲和层析和复性后,免疫豚鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA检测多抗的免疫反应性以及效价。结果成功构建了pET-28b-M重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,经亲和层析及透析获得纯化的重组M蛋白,制备的多克隆抗体可与M蛋白发生特异性结合,效价达1∶21 870。结论成功优化表达了狂犬病病毒CTN-1株M蛋白,制备了高效价的多克隆抗体,为后续M蛋白生物学分析以及新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 基质蛋白 密码子优化 原核表达 亲和层析 多克隆抗体
基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质 预览
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作者 董聪 高庆华 +1 位作者 王玥 罗同阳 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期114-120,共7页
旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶。通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高... 旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶。通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高且稳定的重组菌株,在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养,酶活达到257 600 U/L。酶学性质分析表明,以葡萄糖为底物时最适温度和pH分别为55℃和7.0,在50℃下处理150 min仍有70%的活性,在pH 4-7范围内,37℃保温4 h,FAD-GDH仍能保持50%以上的活性。金属离子Cu2+对酶活抑制作用比较大。FAD-GDH的底物专一性较好,以葡萄糖为最适底物。经毕赤酵母密码子偏好性优化实现了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达,为应用于血糖检测提供理论依据。 展开更多
关键词 FAD依赖的葡萄糖脱氢酶 密码子优化 重组毕赤酵母 酶学性质
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外切型琼胶酶AgaO的高效表达及酶学性质表征 预览
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作者 程媛媛 陈庆敏 +3 位作者 李俊鸽 李淑焕 王延辉 韩文君 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2019年第7期107-113,共7页
根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明... 根据大肠杆菌的密码子偏好性,优化外切型琼胶酶AgaO的基因并人工全合成,克隆入表达载体质粒pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件即诱导温度、诱导时间和诱导剂IPTG终浓度,纯化重组蛋白rEAgaO,并分析其酶学性质变化。结果表明,重组酶rEAgaO在16℃、IPTG终浓度0.1 mmol/L条件下诱导20 h时表达量最高;95%以上的重组蛋白质为水溶性表达,产量约为1432.7 mg/L,较优化前原始基因的产量提高了10.9倍;重组酶rEAgaO的最适反应温度为45℃,在低于40℃的温度下预处理2 h后,仍然具有90%以上的残余活性,最适pH为7.0,在pH6.0~10.0不同缓冲体系4℃处理2 h仍保留69.5%以上的活性;该酶降解琼脂糖后的最终产物经TLC分析鉴定为新琼二糖。基因密码子优化虽不改变蛋白质氨基酸序列,但可明显提高水溶性重组蛋白质的产率及酶活,对促进相关酶类的生产和应用具有借鉴意义。 展开更多
关键词 琼胶酶 密码子优化 原核表达 酶学性质 新琼二糖
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猪FUT2基因密码子使用偏好性分析及优化 预览
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作者 戴开宇 黄焱杰 +2 位作者 吴丽思 包文斌 吴圣龙 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第7期1863-1872,共10页
为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和... 为了揭示猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因密码子使用特性并提高其在外源宿主内的表达量,本研究综合运用EMBOSS Explorer网站和CodonW软件包分析了猪FUT2基因的密码子使用偏好性的相关参数,并与3种模式生物(大肠杆菌、酵母菌和果蝇)基因组密码子使用模式进行比较,最后参照与之最为相近的模式生物基因组密码子使用方式,利用JCat和OPTIMIZER两个密码子优化网站对猪FUT2基因密码子进行优化。结果显示,猪FUT2基因表达水平不高,存在24种偏好密码子,且这24种偏好密码子中有23种以G/C结尾;猪FUT2基因与果蝇基因组密码子使用模式的差异小于大肠杆菌和酵母基因组,表明果蝇更适合猪FUT2基因的外源表达;根据果蝇基因组密码子使用模式优化猪FUT2基因密码子,优化后其适应指数有了明显提高,而整体GC含量没有明显变化,说明在理论上猪FUT2基因优化成功。本研究从翻译水平上揭示了猪FUT2基因的密码子使用特性,为其在遗传改良中选择最佳外源表达系统及提高其在宿主细胞内的表达水平提供一定的理论依据。 展开更多
关键词 FUT2基因 密码子使用偏好性 密码子优化
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疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达和性质鉴定
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作者 蔡海莺 张婷 +6 位作者 Dumba Trish 赵敏洁 李杨 童志超 毛建卫 张辉 冯凤琴 《中国食品学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期262-271,共10页
通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上... 通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上清脂肪酶表达量达到0.1 mg/m L,对应的p NPP水解酶活达到312.72U/m L。与对应的原始编码基因重组菌酶活(179.42 U/m L)相比,密码子优化后酶活提高74.29%,表明密码子优化策略成功提高了TLL在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。比较毕赤酵母来源的重组TLL与商业化的米曲霉酶学性质发现它们具有相似的最适p H和温度耐受范围。另外,它们在有机溶剂耐受性、表面活性剂和金属离子效应以及位置选择性方面均较为相似,表明毕赤酵母来源的重组TLL同样具有商业化应用的潜力。 展开更多
关键词 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶 重组表达 密码子优化 性质鉴定 sn-1 3位置专一性 毕赤酵母
犬细小病毒VP2主要抗原表位基因的密码子优化及原核表达
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作者 潘素敏 仲飞 +4 位作者 贺英 史秋梅 潘素娜 崔丹 王晓燕 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第19期118-121,共4页
为了制备大量廉价的可溶性犬细小病毒(CPV)VP2蛋白抗原,试验截选了VP2抗原表位集中的基因片段VP2-70进行密码子优化及合成,将合成基因克隆到pET-32a(+)载体中,构建原核表达载体pET-32-VP2-70,转化BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达... 为了制备大量廉价的可溶性犬细小病毒(CPV)VP2蛋白抗原,试验截选了VP2抗原表位集中的基因片段VP2-70进行密码子优化及合成,将合成基因克隆到pET-32a(+)载体中,构建原核表达载体pET-32-VP2-70,转化BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达后进行Ni-NTA亲和层析纯化,Western-blot检测验证其生物学活性。结果表明:试验构建的VP2-70表达载体能够介导VP2-70融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达量高出野生型VP2-70融合蛋白16 mg/L;Western-blot检测显示,该蛋白具有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。 展开更多
关键词 犬细小病毒 抗原表位基因 密码子优化 克隆 原核表达 融合蛋白
猪细小病毒NS1基因的克隆、表达及密码子优化提高表达水平 被引量:1
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作者 张建楼 徐瑞涛 +3 位作者 霍珊珊 崔丹 左玉柱 仲飞 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第10期1840-1845,共6页
通过PCR方法从猪细小病毒(PPV)基因组中扩增NS1基因,将其克隆到pcDNA3.1A质粒中,构建成与Myc/His标签融合的NS1真核表达载体。将表达载体转染PK-15细胞使其表达。利用猪偏爱的密码子对NS1全基因进行了密码子优化,通过构建表达载体和... 通过PCR方法从猪细小病毒(PPV)基因组中扩增NS1基因,将其克隆到pcDNA3.1A质粒中,构建成与Myc/His标签融合的NS1真核表达载体。将表达载体转染PK-15细胞使其表达。利用猪偏爱的密码子对NS1全基因进行了密码子优化,通过构建表达载体和转染细胞,检测并比较了密码子优化前后的表达水平。结果显示:扩增的NS1基因与GenBank序列一致,构建的表达载体结构正确;Western blot检测表明,NS1基因能够在PK-15细胞中进行表达,但表达水平很低,有时检测不到,从而严重影响对其的进一步研究;密码子优化后NS1基因的表达水平由优化前的7μg/T25培养瓶增加至32μg/T25培养瓶,是原来的4倍。可见密码子优化可明显提高NS1蛋白在PK-15细胞中的表达,这为下一步研究NS1蛋白的功能提供了有利条件。 展开更多
关键词 NS1基因 猪细小病毒 密码子优化
羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达 预览
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作者 张静 范峻豪 +3 位作者 刘春羽 赵一 温永俊 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2018年第10期95-98,共4页
B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His... B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His-tag融合可溶性标签的表达重组载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的His融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTAagarose亲和纯化后,进行Western-blot验证。结果显示,经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定的目的条带分子质量与预期大小相符。本试验成功在上清中表达和纯化出B2L基因编码蛋白。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 截短表达 密码子优化
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重组角质细胞生长因子(KGF)的原核表达及优化 预览
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作者 田顺立 郑春阳 《安徽农业科学》 CAS 2018年第33期71-74,共4页
[目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMO-K... [目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF(ΔN23),并测试不同表达温度(37、23℃)对KGF(ΔN23)表达结果的影响。[结果]在BL21(DE3)菌株中,37℃表达时KGF(ΔN23),SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)的表达量都较高,其中可溶性蛋白表达量KGF(ΔN23)<SUMO-KGF(ΔN23)<Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)。降低诱导温度为23℃后,3种KGF的表达量都显著降低,但是可溶性蛋白的占比显著提高,均接近100%。[结论]降低诱导温度能够促进KGF的可溶性表达,但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达能够提高KGF在37℃表达时可溶性蛋白占比,其中融合Fh8-SUMO标签的KGF表达量和可溶性蛋白占比较高。 展开更多
关键词 角质细胞生长因子(KGF) 原核表达系统 密码子优化 融合表达 标签蛋白
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