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基于CMV启动子表达鹦鹉热衣原体PmpD-N蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建 预览
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作者 刘杉杉 孙伟 +5 位作者 张稳 贾长青 罗杰 沈易华 郁建生 何诚 《动物医学进展》 北大核心 2018年第7期13-18,共6页
为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HV... 为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HVT重组病毒,并在体外评价该重组病毒的相关特性。结果表明,转染细胞后成功获得HVT重组病毒。通过Westernblot和IFA分析表明,重组病毒表达了PmpD-N蛋白。Confocal分析表明,PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。HVT重组病毒的复制特性和野生型HVT一致。HVT重组病毒能够激活巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6和NO的产生。该试验成功构建了含有CMV启动子,能够表达PmpD-N蛋白的HVT重组病毒,为下一步进行动物试验和分析该病毒的免疫效力奠定了基础。 展开更多
关键词 鹦鹉热衣原体 多型外膜蛋白D的N端 火鸡疱疹病毒 细菌人工染色体技术 巨细胞病毒启动子
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巨细胞病毒和猴空泡病毒40启动子在中国仓鼠卵巢细胞中驱动基因表达效率比较 预览
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作者 王喜成 贾岩龙 +2 位作者 郭潇 张玺 王天云 《新乡医学院学报》 CAS 2016年第7期553-555,共3页
目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体L... 目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将表达载体质粒分别转染CHO-K1细胞,倒置荧光显微镜观察转染后CHO-K1细胞中EGFP的表达情况;流式细胞术检测EGFP的荧光强度,以比较2种启动子驱动外源基因表达的效率。结果 2种启动子均能够驱动EGFP在CHO-K1细胞中表达。转染质粒pWTY-02的CHOK1细胞的平均荧光强度明显高于转染质粒pWTY-03的CHO-K1细胞(P〈0.05)。结论 CMV启动子在CHO-K1细胞中驱动EGFP的表达效率较高,为后续CHO表达系统中提高外源基因表达效率启动子的选择提供了依据。 展开更多
关键词 巨细胞病毒启动子 猴空泡病毒40启动子 绿色荧光蛋白 中国仓鼠卵巢细胞
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制备转基因模型小鼠的基础:人白细胞抗原A*0206基因慢病毒载体构建及鉴定 预览 被引量:2
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作者 张修彦 詹纯列 张晓玉 《中国组织工程研究》 北大核心 2015年第24期3813-3817,共5页
背景:有研究表明人白细胞抗原-A*0206亚型与鼻咽癌的发生正相关,但目前还没有相应的转基因动物模型,以用于从整体水平评价HLA-A*0206与鼻咽癌的关系及进一步研究免疫和基因疗法。目的:构建 pLVX-CMV-人白细胞抗原-A*0206-HA-mCMV... 背景:有研究表明人白细胞抗原-A*0206亚型与鼻咽癌的发生正相关,但目前还没有相应的转基因动物模型,以用于从整体水平评价HLA-A*0206与鼻咽癌的关系及进一步研究免疫和基因疗法。目的:构建 pLVX-CMV-人白细胞抗原-A*0206-HA-mCMV-ZsGreen 载体,并进行病毒包装,以用于HLA-A*0206转基因小鼠制作。方法:合成HLA-A*0206序列,利用聚合酶链式反应在5’端引入Eco RⅠ酶切位点,在3’端引入Bam HⅠ酶切位点和流感病毒血凝素标签,Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切目的片段及pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen质粒,连接酶切产物,转化到大肠杆菌 JM109感受态细胞,双酶切及测序鉴定阳性重组质粒,阳性重组质粒与四质粒包装系统共转染表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系293T细胞,产生含目的基因的慢病毒。结果与结论:凝胶电泳及测序证实人白细胞抗原A*0206基因成功导入pLVX-CMV-mCMV-ZsGreen骨架质粒,转染293T细胞48 h后的转染率为92%。荧光法测定病毒滴度,获得病毒滴度约为5×108。结果证实,实验成功构建了含巨细胞病毒启动子、HLA-A*0206、流感病毒血凝素标签以及ZsGreen报告基因的慢病毒。 展开更多
关键词 组织构建 组织工程 鼻咽癌 转基因小鼠 病毒 人白细胞抗原 绿色荧光蛋白 四质粒包装系统 流感病毒血凝素 巨细胞病毒启动子 质粒
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肿瘤特异性Survivin启动子与甲胎蛋白启动子的活性评价与比较 被引量:4
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作者 况舸 黄爱龙 唐霓 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期 440-442,共3页
目的研究并比较肿瘤特异性Survivin和甲胎蛋白(AFP)基因启动子在不同肝细胞癌细胞系中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法采用聚合酶链反应法扩增获得Survivin和AFP基因的启动子片段,并克隆入表达虫荧光素酶基因的报告质粒中... 目的研究并比较肿瘤特异性Survivin和甲胎蛋白(AFP)基因启动子在不同肝细胞癌细胞系中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法采用聚合酶链反应法扩增获得Survivin和AFP基因的启动子片段,并克隆入表达虫荧光素酶基因的报告质粒中,通过测定荧光素酶报告基因的表达情况,测定Survivin与AFP基因启动子的转录活性,同时采用巨细胞病毒启动子为对照,评价其转录活性水平.结果 Survivin启动子在肝癌细胞中具有相当强的活性,其活性水平在高表达AFP的肝癌细胞中为AFP启动子的54~100倍,达到巨细胞病毒启动子活性的16%~21%.结论Survivin启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性,可望开发成为新的肝癌靶向性基因治疗工具. 展开更多
关键词 Survivin 肿瘤特异性 甲胎蛋白启动子 活性评价 荧光素酶报告基因 巨细胞病毒启动子 靶向性基因治疗 聚合酶链反应法 基因启动子 荧光素酶基因 AFP启动子 转录活性 活性水平 AFP基因 启动子活性 肝癌细胞 表达情况 治疗工具
携蜂毒素基因重组腺病毒载体的构建 预览 被引量:5
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作者 李绍祥 凌昌全 李瑞利 《河北医科大学学报》 CAS 2003年第3期 139-143,共5页
目的构建含巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子或甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP) 调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒,进行体外抗肿瘤效果的比较.方法人工合成蜂毒素基因时,用Kozak序列优化翻译起始区,并进行人类最适密码子的转... 目的构建含巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子或甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP) 调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒,进行体外抗肿瘤效果的比较.方法人工合成蜂毒素基因时,用Kozak序列优化翻译起始区,并进行人类最适密码子的转换,然后置于CMV启动子或AFP调控序列之后,用细菌内高效同源重组法构建腺病毒质粒,脂质体转染293细胞进行包装.结果目的基因成功地重组人腺病毒质粒.结论上述蜂毒素-腺病毒载体构建时的几个特点,有助于载体的顺利构建,并为下一步的实验奠定了基础. 展开更多
关键词 携蜂毒素基因 重组腺病毒 载体构建 巨细胞病毒启动子 甲胎蛋白
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噬菌体介导的核酸免疫 预览
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作者 江丽君 陈锦荣 《生物制品快讯》 2004年第6期 24,共1页
关键词 噬菌体 介导 核酸免疫 巨细胞病毒启动子 乙肝表面抗原
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代毒株反向遗传系统的优化 预览
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作者 李燕华 韦祖樟 +1 位作者 谭菲菲 袁世山 《中国动物传染病学报》 CAS 2010年第3期 13-20,共8页
反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定... 反向遗传系统已成为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)结构与功能非常重要的手段,并且在设计基因工程疫苗中发挥不可替代的作用。因而,有效提高感染性克隆拯救病毒的效率和稳定性以及降低经济成本是一个急需解决的课题。本研究在已构建完成的高致病性PRRSV细胞传代毒株反向遗传系统(pAJXM)的基础上,做了以下三方面的工作:(1)将T7启动子换成hCMV(人类巨细胞病毒,Human cytomegalovirus)启动子,从而全长cDNA克隆不需经过体外转录成mRNA的过程,直接通过DNA转染MARC-145细胞拯救病毒;(2)研究hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间最佳的碱基数目,使体内转染获得的病毒基因组5末端序列为病毒的真实序列;(3)在病毒基因组3末端添加丁型肝炎病毒核酶(delta hepatitis virus ribozyme,HDVr)序列,体内转染获得的病毒基因组3末端的非病毒序列通过核酶自动去除。研究发现,基于DNA转染的反向操作系统是可行的,并且hCMV启动子的TATA框与病毒基因组5末端之间的碱基数目设置为25和在病毒基因组3末端添加HDVr序列后,能够有效地提高全长感染性cDNA克隆的病毒拯救效率和稳定性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 反向遗传系统 人类巨细胞病毒启动子 丁型肝炎病毒核酶
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不同启动子对HA-VP2重组杆状病毒蛋白表达的影响 预览
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作者 于航 高冬妮 +2 位作者 田兆峰 平文祥 葛菁萍 《中国农学通报》 2017年第23期100-105,共6页
为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组... 为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组杆状病毒,并通过侵染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)分析蛋白表达水平,以确定最优启动子。用Gel-Pro analyzer 4.5软件分析Western blotting条带。结果表明,含有CMV、CBA及EF1α启动子的重组杆状病毒所表达的HA-VP2蛋白强度分别为270.61、290.26及83.45,且各启动子活性差异显著(P〈0.05),其中CMV与CBA启动子的活性相近能够较高效率地表达HA-VP2蛋白,但EF1α启动子活性较以上2种启动子活性较低。本研究通过比较分析不同启动子对蛋白表达水平的影响,以此择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的发展提供新思路。 展开更多
关键词 VP2 杆状病毒表达系统 巨细胞病毒立即早期启动子(CMV) 包含CMV立即早期增强区与鸡肌动蛋白启动子区的复合启动子(CBA) 人类延伸因启动子(EF1α)
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