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桦褐孔菌膜二肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达
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作者 黄金金 王艳 +3 位作者 胡萍 袁雯雯 赵艳霞 郑维发 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期686-697,共12页
本研究利用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris蛋白表达体系表达了药用担子菌桦褐孔菌的一个二肽酶基因。该二肽酶基因编码区全长1814bp,包含6个内含子,编码465个氨基酸。生物信息学分析发现,二肽酶基因编码的蛋白中不含信号肽序列,但在第55... 本研究利用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris蛋白表达体系表达了药用担子菌桦褐孔菌的一个二肽酶基因。该二肽酶基因编码区全长1814bp,包含6个内含子,编码465个氨基酸。生物信息学分析发现,二肽酶基因编码的蛋白中不含信号肽序列,但在第55–77位氨基酸之间存在一个跨膜结构。将含跨膜结构和去跨膜结构蛋白的cDNA序列分别克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA上,电转化至巴斯德毕赤酵母X-33中,用1%(V/V)甲醇诱导重组菌株表达目标蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot检测表达蛋白。结果显示,巴斯德毕赤酵母可表达含跨膜结构的完整基因,但目标蛋白不能分泌到胞外,存在于破碎细胞的沉淀中,且没有催化活性;而去跨膜结构的蛋白则可分泌表达到胞外,并具有催化活性。Ni-NTA纯化去跨膜结构的桦褐孔菌二肽酶浓度可达0.12mg/mL,并发现其在pH 7.3、反应温度50℃、反应时间2h的条件下,以Gly-Gly为底物时,其比活为433U/mg。同时检测到其对Ile-Leu、Trp-Trp和Phe-Phe具有较高的水解活性。 展开更多
关键词 桦褐孔菌 二肽酶 巴斯德毕赤酵母表达体系 表达
真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达
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作者 麦婉莹 洪葵 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1092-1099,共8页
【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P45... 【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。 展开更多
关键词 真菌细胞色素P450 大肠杆菌表达系统 表达 N端修饰
结合区部分缺失的纤维素酶基因的克隆与表达及酶学性质初步测定 预览
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作者 还萍 李锐 +2 位作者 李华南 江正兵 马向东 《湖北大学学报:自然科学版》 CAS 2019年第5期477-482,共6页
从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40.06 kD.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,... 从梧桐腐枝上分离到一株可降解纤维素的细菌菌株,发现克隆于该菌株的内切纤维素酶基因(egt)结合区部分缺失(8 bp),导致移码并提前终止,全长1 146 bp,编码381个氨基酸,分子量为40.06 kD.克隆含有完整结合区的基因(eg),通过酶学性质研究,表明两者均仅具有羧甲基纤维素钠活性,纤维素酶EGT和EG的最适反应温度分别为45 ℃和55 ℃,EGT更加耐高温.最适pH均为7.0,都具有较好的pH稳定性. Mn^2+、Fe^2+对两者具有激活作用,Zn^2+、Ca^2+、K ^+、NH4^2+ 和Mn^2+对其都具有抑制作用.EGT的 K m=3.09 mg/mL,比酶活为98.4 U/mg;EG的 K m=8.654 mg/mL,比酶活为53.53 U/mg. EGT结合区的部分缺失导致酶与底物的亲和能力更好,同时比酶活提高183%,水解能力更强. 展开更多
关键词 内切纤维素酶 表达 结合区 酶学性质
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磷脂酶D的重组表达及其在磷脂酰丝氨酸合成中的应用 预览
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作者 侯海娟 龚劲松 +7 位作者 翟珅 徐敏 周文斌 陈杰鹏 段丽丽 张晓梅 许正宏 史劲松 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第13期9-14,共6页
对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确... 对磷脂酶D(phospholipase D,PLD)进行重组表达,并探究其在生物催化合成磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)中的应用。以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为PLD的异源表达宿主,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子量,并对培养条件进行优化,进一步探究重组菌的酶学性质。在有机相-水相双相反应体系中进行PS的制备,并对制备工艺进行系统优化。成功构建了重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-sspld,通过蛋白分析确定其分子质量约为60 kDa。重组菌通过诱导条件优化,酶活最高可达38.58 U/mL,是优化前的2.26倍。PLD粗酶液的最适pH值为7.5,最适反应温度为60℃。制备工艺优化结果表明40℃条件下,在8 mL的乙酸乙酯中溶解64 mg的卵磷脂,在4 mL酶液中溶解160 mg的L-丝氨酸,得到的PS转化率最高,可达28%,产量为1.34 g/L。该PLD粗酶液催化性能良好,为酶法制备磷脂酰丝氨酸奠定了基础。 展开更多
关键词 磷脂酶D 磷脂酰丝氨酸 表达 酶学性质 催化条件
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巴伦葛兹类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的表达、酶学性质及结构解析 预览 被引量:1
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作者 黄平 吴世旺 +1 位作者 江正强 杨绍青 《食品科学技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期20-27,共8页
从克隆巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904中克隆得到一个β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达,研究了重组酶的酶学性质,进一步解析了该酶的晶体结构。研究结果表明,该酶的最适温度和pH值分别为50℃和7.5。该酶底物特异性较广,能够... 从克隆巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904中克隆得到一个β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中进行了异源表达,研究了重组酶的酶学性质,进一步解析了该酶的晶体结构。研究结果表明,该酶的最适温度和pH值分别为50℃和7.5。该酶底物特异性较广,能够水解β-1,2、β-1,3、β-1,4、β-1,6-糖苷键等在内的多种糖苷键,对昆布多糖、大麦β-葡聚糖和地衣多糖等聚糖均有水解作用。晶体结构信息表明,该酶呈现糖苷水解酶(GH)3家族典型的多结构域结构,其催化口袋由类似(α/β)5的三明治结构域和(β/α)8折叠桶结构域中间的loop构成,其中芳香氨基酸残基Trp748侧链提供-1位结合位点,Trp749侧链提供+1位结合位点,Trp131侧链提供+2位结合位点,这些芳香氨基酸残基形成了一个小的口袋和疏水性环境,不利于转糖苷反应。 展开更多
关键词 巴伦葛兹类芽孢杆菌 Β-葡萄糖苷酶 表达 酶学性质 晶体结构
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厌氧菌Sunxiuqinia sp. SH-52外切型海藻酸裂解酶的异源表达及酶学特征
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作者 陈可可 何漫漫 +2 位作者 王康 严金平 伊日布斯 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期531-540,共10页
【背景】目前已报道的海藻酸分解菌多数为好氧菌,未见有关厌氧菌的报道。从分离的海藻酸分解菌中表征的海藻酸裂解酶大多为内切型海藻酸裂解酶,外切型较少。【目的】研究来自厌氧海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因,表征新型海藻酸裂解酶... 【背景】目前已报道的海藻酸分解菌多数为好氧菌,未见有关厌氧菌的报道。从分离的海藻酸分解菌中表征的海藻酸裂解酶大多为内切型海藻酸裂解酶,外切型较少。【目的】研究来自厌氧海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因,表征新型海藻酸裂解酶并阐明其酶学性质,为海藻酸裂解酶的多样性和微生物降解海藻酸机制提供理论依据。【方法】对来自厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqinia sp. SH-52的海藻酸裂解酶SHA-4编码基因进行克隆,分析基因序列,构建重组质粒PGEX-4T-1-SHA-4并在大肠杆菌中实现异源表达,经纯化后对其酶学性质及降解特征进行研究。【结果】该酶在28°C、用0.1 mmol/L IPTG (异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)条件下诱导6 h达到最大表达量,纯化后酶的比活力达到21 U/mg。酶学性质分析表明SHA-4的最适温度为37°C;最适pH为7.5;对PolyMG (杂聚古罗糖醛酸-甘露糖醛酸嵌段)具有底物偏好性;Na+对该酶的活性具有抑制作用,而金属离子Cu2+具有明显促进作用,使活性提高了约168%;SHA-4催化海藻酸的Km值为2.5 mg/mL,Vmax为8.7 mg/(mL·min);SHA-4为外切型海藻酸裂解酶,降解海藻酸终产物为单糖。【结论】异源表达了来自一株厌氧海藻酸分解菌Sunxiuqiniasp.SH-52的海藻酸裂解酶SHA-4,该酶是PL6家族中第一个对PolyMG有底物偏好性的外切型海藻酸裂解酶,而且活性较高,作为工具酶有很好的应用前景,为海藻酸降解机制的探索提供了新的线索。 展开更多
关键词 厌氧海藻酸分解菌 Sunxiuqinia sp. SH-52 外切型海藻酸裂解酶 表达 酶学性质
葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化 预览
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作者 郭亚兰 周雨朦 +1 位作者 吴斌 何冰芳 《生物加工过程》 CAS 2019年第4期379-384,共6页
为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养... 为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。 展开更多
关键词 葡萄糖醛酸木聚糖酶 枯草芽孢杆菌 表达 穿梭质粒 木聚糖
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α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究 预览
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作者 刁文涛 向凌云 +5 位作者 宁萌 王雪妍 马焕 冯菲 陈国参 周伏忠 《中国酿造》 CAS 北大核心 2019年第8期60-66,共7页
利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,成功异源表达了一株链球菌(Streptococcus)S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最... 利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,成功异源表达了一株链球菌(Streptococcus)S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50℃,在碱性环境中(pH 7.5~10.0)及在40℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷(pNPG)的最大水解速率(Vmax)为508.38μmol/(min·mg),米氏常数(Km)值为1.2 mmol/L;通过薄层层析(TLC)法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。 展开更多
关键词 链球菌 大肠杆菌 表达 重组α-半乳糖苷酶 酶学性质
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大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达 预览
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作者 汪薛良 钮成拓 +2 位作者 包敏 李崎 王金晶 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第14期34-40,共7页
该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体pP43NMK-amyB,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amyB。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386U/mL,纯化后测得... 该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体pP43NMK-amyB,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amyB。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386U/mL,纯化后测得其比酶活为613U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适pH值为5.0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81.8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。 展开更多
关键词 大麦β-淀粉酶 表达 枯草芽孢杆菌 酶学性质 麦芽糖
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产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能
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作者 魏佳 王壮壮 +3 位作者 于海波 冯丽妍 徐建中 张伟国 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期695-706,共12页
【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组... 【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysCfbr、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysCfbr)、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。 展开更多
关键词 L-苏氨酸 大肠杆菌 基因敲除 表达 转运途径
非洲菊CAD基因的密码子偏好性分析 预览
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作者 王星淇 石小保 +5 位作者 林芳柯 孙雪丽 刘范 田娜 郝向阳 程春振 《园艺与种苗》 CAS 2019年第4期10-14,共5页
[目的]研究非洲菊肉桂醇脱氢酶基因(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)的密码子使用偏好性。[方法]从非洲菊转录组数据中筛选获得具有完整CDS的CAD基因,运用CodonW、EMBOSS、SPSS和Origin软件分析其密码子使用情况。[结论]筛选获得5... [目的]研究非洲菊肉桂醇脱氢酶基因(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)的密码子使用偏好性。[方法]从非洲菊转录组数据中筛选获得具有完整CDS的CAD基因,运用CodonW、EMBOSS、SPSS和Origin软件分析其密码子使用情况。[结论]筛选获得5条具有完整CDS的非洲菊CAD基因,其密码子偏好性较弱,编码氨基酸时倾向于使用较多的A或T。GC1s、GC2s、GC3s、GC和ENC之间无显著性的相关性。该基因编码氨基酸时除受突变压力的影响外,外界因素与自然压力影响较大。酵母菌真核表达系统适合作为异源表达系统,拟南芥则是较为理想的受体。[结论]该研究可为非洲菊CAD遗传转化研究奠定基础。 展开更多
关键词 非洲菊 CAD基因 密码子偏好性 表达
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米曲霉酸性蛋白酶基因在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质
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作者 岳晓平 陈朋 +5 位作者 朱玥明 曾艳 刘汉民 刘红彦 王敏 孙媛霞 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期415-424,共10页
酸性蛋白酶作为一类重要的天冬氨酸蛋白酶,被广泛应用于食品、医药和皮革等领域。为推动酸性蛋白酶的研究及应用,通过对发酵豆制品样品进行宏基因组测序,从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA,在毕赤酵母GS115中进行异源表达,并对重组酶Pep... 酸性蛋白酶作为一类重要的天冬氨酸蛋白酶,被广泛应用于食品、医药和皮革等领域。为推动酸性蛋白酶的研究及应用,通过对发酵豆制品样品进行宏基因组测序,从中获得米曲霉酸性蛋白酶基因pepA,在毕赤酵母GS115中进行异源表达,并对重组酶PepA进行酶学性质分析。结果显示毕赤酵母发酵上清液中酸性蛋白酶的活性为50.62 U/mL。SDS-PAGE验证PepA的分子量约为50 kDa,且发酵上清液几乎无杂蛋白。PepA的最适pH值为4.5,最适温度为50℃,Mn2+和Cu2+对其具有激活作用,而Fe3+、Fe2+与Ca2+则具有抑制作用。上述研究结果可为米曲霉酸性蛋白酶的异源表达及其相关工业应用提供指导。 展开更多
关键词 米曲霉 酸性蛋白酶 毕赤酵母 表达 酶学性质
特异腐质霉来源漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
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作者 张丽洁 徐欣欣 +3 位作者 田健 初晓宇 朱宝成 伍宁丰 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期46-53,共8页
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium ... 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。从特异腐质霉Y1(Humicola insolens Y1)中分离到了漆酶基因Lac1,其全长1 803 bp,编码600个氨基酸,与NCBI蛋白数据库比对结果表明,与来源于Chaetomium globosum CBS 148.51(XP001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71%,表明是一个新的漆酶基因。将其克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9r中,通过PCR和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3 L发酵罐中,重组Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液,酶活性达到1.3 U/mL发酵液。酶学性质分析结果显示,漆酶的最适作用温度为65℃,最适反应pH为4.5,且在pH 6~11的范围内酶的相对活力均在70%以上。 展开更多
关键词 漆酶 基因克隆 表达 毕赤酵母
埃坡霉素生物合成的遗传改造及营养调控 预览
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作者 易志恒 丁小军 +2 位作者 罗晓红 李亚伟 刘新利 《世界最新医学信息文摘(电子版)》 2019年第30期48-50,共3页
埃坡霉素是一类由纤维堆囊菌产生的抗肿瘤活性大环内酯类化合物,是目前备受关注的新型抗癌药物的先导物之一。本文对其天然产生菌的遗传改造、基因工程菌的构建及其营养调控进行了综述,为埃坡霉素家族化合物的产量提升提供线索,为更多... 埃坡霉素是一类由纤维堆囊菌产生的抗肿瘤活性大环内酯类化合物,是目前备受关注的新型抗癌药物的先导物之一。本文对其天然产生菌的遗传改造、基因工程菌的构建及其营养调控进行了综述,为埃坡霉素家族化合物的产量提升提供线索,为更多此品种的新药应用奠定基础。 展开更多
关键词 埃坡霉素 粘细菌堆囊菌 遗传改造 表达 营养调控
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基于序列宏基因组学技术的芳香聚酮抗生素的发现 预览
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作者 孟晓露 高凯 冯治洋 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期168-176,共9页
[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLAST... [目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf21)、链长因子基因(KSβ,orf20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf19)、环化酶基因(CYC,orf17和orf18)、糖基转移酶基因(orf12)、单加氧酶基因(orf16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。 展开更多
关键词 宏基因组学 序列筛选 表达 芳香聚酮抗生素
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蠼螋肠道中碱性内切葡聚糖酶基因的克隆表达及功能分析
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作者 陈俊梅 李文鹏 +5 位作者 赵素雅 黄冰纷 王博文 惠丰立 尹晓燕 牛秋红 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1798-1812,共15页
【目的】从蠼螋肠道细菌菌株Q5中获得一个新型耐碱纤维素酶基因,通过异源表达、酶学性质及功能分析,旨在为以后进一步研究开发高温碱性纤维素酶提供一些理论参考。【方法】采用刚果红平板初筛法,从河南南阳宝天曼国家级自然保护区落叶... 【目的】从蠼螋肠道细菌菌株Q5中获得一个新型耐碱纤维素酶基因,通过异源表达、酶学性质及功能分析,旨在为以后进一步研究开发高温碱性纤维素酶提供一些理论参考。【方法】采用刚果红平板初筛法,从河南南阳宝天曼国家级自然保护区落叶堆下的昆虫蠼螋肠道中,获得具有分泌较高活性碱性纤维素酶的细菌菌株。基于该菌株的形态学、生理学及16S rRNA序列特征等对高活性菌株进行分类鉴定。并通过设计简并引物,从高活性菌株中克隆出该菌株的纤维素酶基因,并进行序列分析,并导入大肠杆菌BL21中表达。【结果】获得1株具有分泌较高活性碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株Q5,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,进一步从Q5菌株中成功克隆出该菌株的一个全长1500 bp的内切葡聚糖酶基因(GenBank KR067575),在NCBI比对后发现该基因的氨基酸序列与芽孢杆菌菌株LM 4-2的耐碱性β-1,4-内切葡聚糖酶基因(AKE23721.1)有98%的同源性。重组菌经优化培养,细胞破碎后上清液中的酶活力可达3.46 U/mL,是出发菌株Q5(2.05 U/mL)的1.69倍。经正交实验优化后的酶活力为4.99 U/mL。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为50°C与pH 8.5,在pH 8.0和9.0保温48 h,其酶活力仍然维持到最高酶活的82%和81%;该酶在50°C以下较稳定,60°C以上酶活迅速降低。10 mmol/L的Ca^2+和Mg^2+对酶的活性有明显促进作用,重组酶Ega5的Km和Vmax分别是2.217 mol/mL和9.606μmol/(min·L)。该重组酶对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有显著抑制作用。【结论】本文首次从蠼螋肠道中筛选到了一株产碱性内切葡聚糖酶的细菌菌株并从中克隆出了一个碱性纤维素酶基因,为该酶在碱性条件的应用奠定了理论基础。 展开更多
关键词 蠼螋肠道 碱性内切葡聚糖酶 基因克隆 表达 酶学性质和功能
纤维素内切酶的异源表达及分子改造研究进展 预览
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作者 林俊涵 潘志斌 +3 位作者 林谢榕 柯轶 王娜 林晨 《广东化工》 CAS 2019年第10期103-105,共3页
纤维素内切酶在应用中存在产量较低、热稳定性差和活性偏低等问题。纤维素内切酶产生菌的选育,异源表达和分子改造是解决这些问题的有效途径。产生菌的选育包括传统的选育和基于组学技术的筛选,后者更有效率。异源表达系统主要为大肠杆... 纤维素内切酶在应用中存在产量较低、热稳定性差和活性偏低等问题。纤维素内切酶产生菌的选育,异源表达和分子改造是解决这些问题的有效途径。产生菌的选育包括传统的选育和基于组学技术的筛选,后者更有效率。异源表达系统主要为大肠杆菌和毕赤酵母,而后者具有更多的优势。提高热稳定性和活性是分子改造的主要目标。改造酶的结构,可以提高热稳定性,而活性通常也能随之提高。理性化设计比传统分子改造技术具有更高的效率,是分子改造发展的主流技术。 展开更多
关键词 纤维素内切酶 表达 分子改造 理性化设计
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木聚糖酶异源表达的研究进展
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作者 李吉萍 包昌杰 +1 位作者 陈光 张斯童 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期91-99,共9页
木聚糖(xylan)在自然界中的含量极其丰富,在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显,对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶(xylanase)是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶,近年来,为了实现木... 木聚糖(xylan)在自然界中的含量极其丰富,在农作物和农林剩余物中大量存在。随着能源资源问题的日益凸显,对木聚糖的应用和研究越来越受到重视。木聚糖酶(xylanase)是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一类水解酶,近年来,为了实现木聚糖酶的高产、高酶活表达,科研工作者做了大量的研究工作,就木聚糖酶异源表达(heterologous expression)的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 木聚糖 木聚糖酶 表达
米曲霉(Aspergillus oryzae)黄酒小曲4转化体系的构建及脂肪酶的异源表达 预览
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作者 李童 李燕萍 《南昌大学学报:理科版》 CAS 北大核心 2019年第3期246-250,256共6页
以米曲霉(Aspergillus oryzae)H4为研究对象,初步探究了其对潮霉素的敏感度及原生质体的制备时间。在0.1mmol·L^-1氯丙嗪和150μg·mL^-1潮霉素B共同存在的条件下,H4的生长被完全抑制;在酶解时间为3.5h时,H4的原生质体有最佳... 以米曲霉(Aspergillus oryzae)H4为研究对象,初步探究了其对潮霉素的敏感度及原生质体的制备时间。在0.1mmol·L^-1氯丙嗪和150μg·mL^-1潮霉素B共同存在的条件下,H4的生长被完全抑制;在酶解时间为3.5h时,H4的原生质体有最佳的再生率33%。成功构建了重组表达载体pUC18-hygB-LIP并转化至米曲霉H4中。在液态发酵条件下,脂肪酶活力最高的转化子的酶活力比出发菌株H4高10.16U·mL^-1。 展开更多
关键词 米曲霉 表达 液态发酵 脂肪酶
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产纤维素酶大肠杆菌工程菌的构建和酶的表达
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作者 陈小玲 芦志龙 +4 位作者 吴仁智 陈英 黄俊 陆琦 陈东 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期2620-2626,共7页
为了使大肠杆菌(Escherichia coli)具备生产纤维素酶的能力,从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001克隆碱性纤维素酶基因,进行密码子优化后连到载体pET-22b,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,对工程菌进行表达优化并分析纤维素酶酶... 为了使大肠杆菌(Escherichia coli)具备生产纤维素酶的能力,从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PKC-001克隆碱性纤维素酶基因,进行密码子优化后连到载体pET-22b,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,对工程菌进行表达优化并分析纤维素酶酶活。结果表明大肠杆菌工程菌能生产分子量约39 kD的纤维素酶,在培养温度20℃、摇床转速170 r/min、IPTG终浓度0.01 mmol/L的条件下,纤维素酶的产量最大;在酸性条件下,细胞内和细胞外的滤纸酶活力(FPA)分别为5.78 U/mL和1.13 U/mL,在碱性条件下检测不到滤纸酶活。显然,重组纤维素酶仅在酸性条件下有活力。 展开更多
关键词 纤维素酶 大肠杆菌 酶活 表达
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