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杂交鹅掌楸LhARF2基因启动子的克隆及瞬时表达分析 预览
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作者 刘立盘 钟永达 +2 位作者 杨爱红 李彦强 余发新 《江西科学》 2019年第4期513-518,共6页
生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5'端上游2637bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现... 生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)参与调控植物生长发育的多个途径。本研究利用Tail-PCR技术从杂交鹅掌楸中克隆LhARF2基因5'端上游2637bp序列,即pLhARF2启动子,并利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的调控元件,发现其含有启动子必需元件TATA-box和CAAT-box,以及压力响应、激素响应、光信号转导和代谢循环过程元件。构建pLhARF2-pCAMBIA1300:GUS植物表达载体并瞬时浸染本氏烟草叶片,利用GUS组织化学染色法鉴定烟草叶片中瞬时表达活性,发现在烟草叶片中有蓝色斑块,但颜色较浅。实验结果推测杂交鹅掌楸pLhARF2启动子可以调控GUS基因活性,为下一步研究启动子遗传转化的组织表达活性奠定了基础。 展开更多
关键词 杂交鹅掌楸 pLhARF2启动子 克隆 瞬时表达
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猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及瞬时表达 预览
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作者 岳敏 宋亚楠 +5 位作者 安茜 赵熙宁 薛金爱 季春丽 崔红利 李润植 《山西农业科学》 2019年第5期738-741,747共5页
猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检... 猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检测来自猫爪草的酰基-ACP-Δ9脱氢酶(MucACP-Δ9D)是否可异源表达用于在其他植物合成ω-7FA,文章构建了MucACP-Δ9D基因植物表达载体,并通过农杆菌介导在本氏烟草叶组织瞬时表达。用气相色谱(GC)检测烟叶脂肪酸成分,结果显示,野生型及空载体对照的ω-7FA总含量仅为0.4%;然而,MucACP-Δ9D瞬时表达的烟叶组织ω-7FA总含量提高到14.2%,其中,C16∶1Δ9和C18∶1Δ11含量分别达8.8%和5.4%。研究表明,MucACP-Δ9D可在异源组织催化棕榈油酸合成,可进一步用于其他油料作物的油脂遗传改良,以富集ω-7FA。 展开更多
关键词 酰基-Δ9脱氢酶 表达载体 本氏烟草 瞬时表达
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水葫芦EcGS1b基因启动子的克隆及表达分析
3
作者 卢晓丹 傅明辉 钟燕珊 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期2692-2698,共7页
利用染色体步移技术从水葫芦基因组DNA中扩增得到谷氨酰胺合成酶EcGS1b基因5’端上游约1.7 kb的一段序列,经PlantCARE序列分析表明,该序列中除了包括TATA-box和CAAT-box等基本元件外,还含有TATC-box、HSE、LTR和多种光反应相关的元件,... 利用染色体步移技术从水葫芦基因组DNA中扩增得到谷氨酰胺合成酶EcGS1b基因5’端上游约1.7 kb的一段序列,经PlantCARE序列分析表明,该序列中除了包括TATA-box和CAAT-box等基本元件外,还含有TATC-box、HSE、LTR和多种光反应相关的元件,初步推测其为EcGS1b基因启动子,命名为pEcGS1b。进一步通过PCR扩增了4个5’缺失的pEcGS1b片段,命名为p1200、p900、p600、p400。以pBI121为基础,构建了4个以GUS为报告基因的植物表达载体,命名为p1200::GUS、p900::GUS、p600::GUS、p400::GUS。利用农杆菌介导的叶盘法将4个植物表达载体转化烟草叶片,进行瞬时表达。结果表明4个缺失片段均具有启动功能,但弱于组成型表达的花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子,其中p1200的启动活性最强。 展开更多
关键词 水葫芦(Eichhornia crassipes) EcGS1b基因 启动子 GUS 瞬时表达
红色荧光蛋白融合表达载体的构建和蛋白质细胞内定位研究 预览
4
作者 王文旭 郁飞 《江苏农业科学》 2019年第8期52-55,共4页
为进一步研究目的蛋白质在细胞内的定位,构建融合了红色荧光蛋白mCherry或mScarlet的表达载体。选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4个定位基因来构建红色荧光蛋白融合表达载体。根据TAIR数据库中相关蛋白质的基因序列设计引物,通过PC... 为进一步研究目的蛋白质在细胞内的定位,构建融合了红色荧光蛋白mCherry或mScarlet的表达载体。选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4个定位基因来构建红色荧光蛋白融合表达载体。根据TAIR数据库中相关蛋白质的基因序列设计引物,通过PCR技术扩增序列并将其分别连接到已制备好的红色荧光蛋白融合表达载体上,制备得到质粒后转化入原生质体进行瞬时表达。结果表明,成功构建了pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarletNT-ARA7以及pUC18-mScarletNT-SYP61等4个红色荧光蛋白融合表达载体,并且成功在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时表达。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 融合表达载体 亚细胞定位 瞬时表达
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从江香猪源干扰素γ植物表达载体构建及在生菜中瞬时表达 预览
5
作者 田浪 温贵兰 +5 位作者 张升波 杨佰启 李昌红 徐丽 陈广 张喜懿 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2019年第7期96-100,共5页
为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物... 为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。 展开更多
关键词 从江香猪源干扰素γ 植物表达载体 生菜 瞬时表达 抗病毒活性
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甘薯IbSSI基因启动子序列的克隆及瞬时表达分析
6
作者 王雁楠 杨育峰 +6 位作者 杨国红 张莉 陈献功 徐心志 刘庆昌 翟红 何绍贞 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第20期6604-6610,共7页
植物可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SS)在植物支链淀粉的合成中起着关键作用,其主要负责支链的延伸。前期我们从甘薯中克隆到IbSSI基因并对其进行了表达分析及功能验证,发现该基因在甘薯中的表达受到外源蔗糖的诱导以及昼... 植物可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SS)在植物支链淀粉的合成中起着关键作用,其主要负责支链的延伸。前期我们从甘薯中克隆到IbSSI基因并对其进行了表达分析及功能验证,发现该基因在甘薯中的表达受到外源蔗糖的诱导以及昼夜节律的调控。本研究在此基础上利用染色体步移法克隆到IbSSI基因1 811 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析表明IbSSI启动子序列富含TATA-box和CAAT-box两个基本元件,还含有与昼夜节律、光照、蔗糖、逆境响应及组织特异表达等相关的顺式作用元件。将IbSSI基因全长启动子及其6个启动子5’端缺失片段分别替换植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子并在本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中进行瞬时表达。GUS染色结果表明不同长度片段的启动子驱动β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)表达的能力有所差异,其中-200 bp~-369 bp区段以及-1 015 bp~-1 304 bp区段可能存在着增强转录的重要顺式作用元件。本研究揭示了IbSSI基因受外源蔗糖诱导表达及昼夜节律调控的原因,并为进一步阐明IbSSI基因在甘薯淀粉生物合成中的作用提供了科学依据。 展开更多
关键词 甘薯(Ipomoea BATATAS (L.) Lam.) IbSSI基因 启动子 顺式作用元件 瞬时表达
阳春砂萜类合酶AvTPS1启动子的克隆及其活性分析
7
作者 王虹 李萌 +3 位作者 马东明 叶鹏 詹若挺 杨锦芬 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期2181-2187,共7页
目的获得药用植物阳春砂Amomum villousm的萜类合酶基因AvTPS1的启动子并进行活性分析。方法从阳春砂叶片基因组DNA(gDNA)中克隆获得AvTPS1基因,再通过FPNI-PCR的方法从阳春砂叶片gDNA中克隆AvTPS1的启动子并进行序列分析,构建由该启动... 目的获得药用植物阳春砂Amomum villousm的萜类合酶基因AvTPS1的启动子并进行活性分析。方法从阳春砂叶片基因组DNA(gDNA)中克隆获得AvTPS1基因,再通过FPNI-PCR的方法从阳春砂叶片gDNA中克隆AvTPS1的启动子并进行序列分析,构建由该启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的重组表达载体pCAM-AvTPS1p,利用农杆菌介导法注射侵染烟草Nicotiana benthamiana叶片进行瞬时表达来验证AvTPS1启动子的活性。结果获得AvTPS1的gDNA序列长度为2444bp,经过序列比对发现AvTPS1含有7个外显子和6个内含子;通过FPNI-PCR成功获得568bp的AvTPS1启动子序列,其含有10种顺式作用元件,包括保守元件TATA-box和CAAT-box,以及可被转录因子MYC结合的G-box等;通过GUS染色发现AvTPS1启动子启动了GUS基因的表达,使转基因烟草叶片呈现蓝色。结论 AvTPS1启动子被成功克隆,且通过实验验证其具有启动基因表达的功能,为进一步研究AvTPS1在萜类合成途径的功能及其受转录因子调节的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 AvTPS1 启动子 阳春砂 瞬时表达 FPNI-PCR
甘蓝型油菜SNARE蛋白SYP122叶片瞬时表达体系的建立 预览
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作者 许静 单亚楠 +3 位作者 何豆 陈淞渝 庄炜 王爱荣 《福建农林大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第4期459-465,共7页
通过生物信息学鉴定了油菜中的突触融合蛋白BnSYP122,其由一个N端syntaxin结构域、一个典型的SNARE基序及一个C端跨膜结构域组成,并且N端结构域包含被称为Ha、Hb、Hc基序的3个α-螺旋束.进一步利用Gateway技术成功将目的蛋白构建于植物... 通过生物信息学鉴定了油菜中的突触融合蛋白BnSYP122,其由一个N端syntaxin结构域、一个典型的SNARE基序及一个C端跨膜结构域组成,并且N端结构域包含被称为Ha、Hb、Hc基序的3个α-螺旋束.进一步利用Gateway技术成功将目的蛋白构建于植物表达载体pEarleyGate104上,与带有绿色荧光蛋白的pEGAD分别转化农杆菌GV3101菌株,采用农杆菌介导的真空渗透法在油菜叶片中进行瞬时表达.经激光共聚焦显微镜观察和Westernblot检测表明,农杆菌介导的真空渗透法能够在油菜叶片中成功表达目的蛋白,同时验证了BnSYP122定位在细胞膜上. 展开更多
关键词 油菜 瞬时表达 真空渗透法 BnSYP122 绿色荧光蛋白
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从江香猪源Ⅰ、Ⅱ型干扰素生菜中融合表达及其生物活性
9
作者 田浪 温贵兰 +4 位作者 张升波 杨佰启 李昌红 陈广 张喜懿 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1261-1268,共8页
干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江... 干扰素(interfern,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒活性。从江香猪源Ι型干扰素α2和Ⅱ型干扰素γ于生菜中融合表达及生物活性研究未见报道。本研究应用生菜植物表达系统,将从江香猪源干扰素植物表达载体PBI121-IFNα2、PBI121-IFNα2γ、PBI121-IFNγ、PBI121-Vec转入根癌农杆菌LBA4404中,用真空渗透法将携带干扰素质粒的根癌农杆菌感染生菜叶片;用β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)技术分析从江香猪源干扰素蛋白活性。结果显示:GUS染色和ELISA检测证明从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中实现了表达;Q-PCR检测显示:在Marc-145细胞上从江香猪源干扰素蛋白对PRRSV的复制有明显抑制作用,在PK15细胞上从江香猪源干扰素蛋白对干扰素γ诱导蛋白30(interferon-gamma-inducible protein 30,IFI30)、2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase,OAS)、抗黏液病毒蛋白(myxovirus resistance,MX)基因的mRNA水平的上调有一定的促进作用。本研究成功实现从江香猪源IFNα2、IFNα2γ、IFNγ在生菜中进行表达且表达蛋白具有生物学活性,为从江香猪源Ι型和Ⅱ型干扰素新复合型药物植物蛋白的开发利用提供参考依据。 展开更多
关键词 从江香猪源干扰素 生菜 瞬时表达 生物活性
基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建 预览
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作者 龙欢 赵辉 +6 位作者 王绪朋 贾瑞宗 贺萍萍 孔华 郭运玲 郭安平 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2019年第10期2022-2028,共7页
双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究... 双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术,设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达,48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现,定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。 展开更多
关键词 基因编辑 曲叶病毒 番木瓜 瞬时表达
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从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对PRRSV复制抑制作用的研究 预览
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作者 田浪 温贵兰 +8 位作者 张升波 杨佰启 李昌红 徐丽 陈广 张喜懿 龚新勇 陈彦希 文明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期744-749,共6页
为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-α2β、pUCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β... 为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从pUCm-CJpoIFN-α2、pUCm-CJpoIFN-α2β、pUCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体pBI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用qPCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;qPCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经47、49、47稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID50 PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。 展开更多
关键词 从江香猪源干扰素 生菜 瞬时表达 猪繁殖与呼吸综合征病毒
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枇杷悬浮细胞AS基因的瞬时表达载体构建与亚细胞定位
12
作者 李惠华 曾碧玉 +2 位作者 王伟 常强 苏明华 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期1923-1932,共10页
枇杷(Eriobotrya japonica)细胞悬浮培养可以产生丰富的五环三萜类化合物。香树素合成酶(amyrine synthase,AS)是三萜合成途径中的关键酶,决定主要代谢和次生代谢的分支点。枇杷AS基因的功能未见报道。本研究以AS基因过表达质粒(pDONR20... 枇杷(Eriobotrya japonica)细胞悬浮培养可以产生丰富的五环三萜类化合物。香树素合成酶(amyrine synthase,AS)是三萜合成途径中的关键酶,决定主要代谢和次生代谢的分支点。枇杷AS基因的功能未见报道。本研究以AS基因过表达质粒(pDONR207-AS)为模板,经PCR扩增获得AS基因的正向开放阅读框,经酶切及与载体的连接,成功构建表达载体pBWA(V)HS-AS-GFP-Tnos。以枇杷悬浮细胞(AS分离的同源系统)为受体材料,在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101的介导下进行瞬时表达,通过共转化的GFP在激光共聚焦显微镜下成像,分析AS蛋白的亚细胞定位;采用气相色谱-质谱联合分析AS催化产物。研究结果显示,AS在枇杷悬浮细胞中定位于内质网;枇杷悬浮细胞中AS的催化产物含α-香树素和β-香树素,AS属于多功能酶。本研究可为明确五环三萜类化合物合成途径以及枇杷悬浮细胞的转基因应用提供参考依据。 展开更多
关键词 香树素合成酶(AS) 枇杷 悬浮细胞 瞬时表达 亚细胞定位
一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析 预览
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作者 宋宪铭 安晨 +3 位作者 张超 熊颖 张祺 陈继军 《微生物学免疫学进展》 2019年第2期17-21,共5页
目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT... 目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280nm比值在2.0~2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37IU/mL,比活达628.21IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 单克隆抗体 快速荧光灶抑制试验(RFFIT) 瞬时表达
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沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位 预览
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作者 楠迪娜 薛敏 +2 位作者 唐宽刚 任美艳 王茅雁 《植物科学学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期562-568,共7页
以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0... 以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。 展开更多
关键词 沙冬青 原生质体 瞬时表达 DREB转录因子 亚细胞定位
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一种家蚕丝腺体外培养和基因瞬时表达分析的方法 预览
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作者 陈艳花 沈兴家 《中国蚕业》 2018年第4期32-34,共3页
家蚕是鳞翅目重要的模式生物,但是目前家蚕培养细胞系少,给家蚕基础研究带来不便,也影响了家蚕作为模式生物的应用。组织体外培养在一定程度上可以代表体内环境,且操作相对简单。我们尝试并建立了一种采用TC-100培养基体外培养丝腺... 家蚕是鳞翅目重要的模式生物,但是目前家蚕培养细胞系少,给家蚕基础研究带来不便,也影响了家蚕作为模式生物的应用。组织体外培养在一定程度上可以代表体内环境,且操作相对简单。我们尝试并建立了一种采用TC-100培养基体外培养丝腺组织的方法,取健康家蚕5龄2 d的幼虫,用75%乙醇进行表面消毒,灭菌水冲洗,剪开腹部表皮固定,用镊子轻轻拉出丝腺组织,用75%乙醇快速漂洗、PBS缓冲液冲洗2-3次,放入含有800 μL TC-100培养基的12孔细胞培养板的培养孔中,每孔4条丝腺组织,27 ℃培养;将0.64 μg增强荧光蛋白基因表达载体pcDNA3.0[ ie1-egfp- SV40]加入到25 μL不完全TC-100培养基中孵育15 min后转染丝腺组织,48 h后用荧光显微镜观察,培养基清澈,丝腺组织外形完好、发出亮绿色荧光,表明 egfp 在丝腺中得到了表达。为进一步验证体外培养丝腺的转染效果,将家蚕miR-0031 的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)各10 μL按照同样方法配成转染液,加入到放有丝腺组织的培养孔中,48 h收集丝腺组织,提取总RNA,荧光定量PCR检测靶基因 BmFib-L 的表达量,结果显示,inhibitor抑制miR-0031 的表达,促使 BmFib-L 的表达量上升,表明用体外培养丝腺进行转染等试验是可行的。该方法的建立为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子。 展开更多
关键词 家蚕 丝腺 体外培养 转染 瞬时表达
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茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析 预览 被引量:1
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作者 郑世仲 江胜滔 +4 位作者 刘伟 陈美霞 林玉玲 赖钟雄 林金科 《茶叶科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期580-588,共9页
以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1828bp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1038bp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYBgDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录... 以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1828bp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1038bp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYBgDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTRPy-richstretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。 展开更多
关键词 茶树 CsMYB 启动子 顺式作用元件 瞬时表达
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白木香AsFPS1启动子的克隆及功能的初步分析
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作者 梅晶晶 梅文莉 +4 位作者 李辉亮 郭冬 王健 彭世清 戴好富 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2018年第12期5381-5387,共7页
本研究利用白木香(Aquilariasinensis)同属植物Aquilariaagallocha的基因组数据,获得一条具有与白木香法呢基焦磷酸合酶基因(AsFPS1)相似性极高的基因序列,并克隆了该基因的起始密码子(ATG)上游1226bp处的启动子序列。该序列中AT含量为6... 本研究利用白木香(Aquilariasinensis)同属植物Aquilariaagallocha的基因组数据,获得一条具有与白木香法呢基焦磷酸合酶基因(AsFPS1)相似性极高的基因序列,并克隆了该基因的起始密码子(ATG)上游1226bp处的启动子序列。该序列中AT含量为63.03%,与启动子特征相符。预测的转录起始位点位于起始密码子ATG上游73bp处,除了具有CAAT-BOX和TATA-BOX等真核生物启动子核心元件外,还存在ARE,BoxI,G-Box,ACE等厌氧诱导顺式作用元件和光应答元件。该序列能够驱动GUS的表达,具有启动子的活性,茉莉酸甲酯和赤霉素两种激素处理可显著地增强该启动子活性。本实验为进一步研究AsFPS1基因的表达及调控机制研究提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 白木香 法呢基焦磷酸合酶 启动子 瞬时表达 GUS
程序性死亡蛋白1(PD-1)在转染的HEK293T细胞的表达和鉴定
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作者 张梦兰 袁青 +3 位作者 杨杰 徐文峰 邬于川 于红 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期800-805,共6页
目的优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白。方法设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELIS... 目的优化HEK293T细胞转染条件,比较程序性死亡蛋白1(PD-1)在不同真核载体的表达水平以高效获取目标蛋白。方法设计L9(33)正交试验,对细胞转染条件进行优化;扩增人PD-1胞外段基因,构建PD-1重组蛋白表达载体,瞬时转染HEK293T细胞,通过ELISA、Western blot对pCMV3、pcDNA3.1和pMH3三种真核表达载体的蛋白表达水平进行比较。结果PD-1胞外段蛋白编码序列成功构建到pcDNA3.1和pMH3真核表达载体上,目的蛋白成功表达。在最佳转染条件下,PD-1重组蛋白在pMH3中的表达量最高,其次为pCMV3、pcDNA3.1的表达量最低。结论人PD-1胞外段蛋白在pMH3-PD1真核载体转染的HEK293T细胞中表达量最高。 展开更多
关键词 HEK293T细胞 瞬时表达 真核表达载体 程序性死亡蛋白1(PD-1) 重组蛋白
桂花OfCCD1基因启动子克隆与表达特性 预览 被引量:1
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作者 刘玉成 王艺光 +4 位作者 张超 董彬 付建新 胡绍庆 赵宏波 《浙江农林大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期596-603,共8页
类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)参与植物中多种类胡萝卜素的代谢,在桂花Osmanthus fragrans中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因1(OfCCD1)对花香物质的合成具有重要作用。根据前期获得的桂花‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhong Gui’转录组数... 类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)参与植物中多种类胡萝卜素的代谢,在桂花Osmanthus fragrans中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因1(OfCCD1)对花香物质的合成具有重要作用。根据前期获得的桂花‘堰虹桂’O.fragrans‘Yanhong Gui’转录组数据库中OfCCD1的序列和前人已发表的OfCCD1序列设计引物,利用染色体步移技术从桂花基因组DNA中扩增获得OfCCD1基因2个拷贝的启动子序列OfCCD1P-L和OfCCD1P-S,其长度分别为2 747 bp和981 bp。2个启动子序列中均含有参与光响应的元件,热激响应元件(HSE),脱落酸(ABA)响应元件(ABRE)和乙烯响应元件;此外,2个启动子中均含有4个ACGT序列。将2个启动子序列分别替代p BI121上的35 S启动子,将构建的载体通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化烟草Nicotiana tabacum叶片进行瞬时表达,发现2个启动子都具有驱动GUS报告基因表达的功能。 展开更多
关键词 林木育种学 桂花 类胡萝卜素 类胡萝卜素裂解双加氧酶 启动子 瞬时表达
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瞬时过表达ThCBL4基因提高刚毛柽柳耐盐能力 预览
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作者 邹全程 唐绯绯 +1 位作者 刘中原 高彩球 《林业科学研究》 CSCD 北大核心 2018年第3期60-67,共8页
[目的]本研究拟从刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆获得1个ThCBL4基因,研究该基因的耐盐功能。[方法]以"Calcineurin B-like protein"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThCBL4基因c DNA序列,并通过R... [目的]本研究拟从刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆获得1个ThCBL4基因,研究该基因的耐盐功能。[方法]以"Calcineurin B-like protein"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThCBL4基因c DNA序列,并通过RT-PCR和测序验证克隆获得的ThCBL4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用Real time RT-PCR分析了0.4 mol·L-1NaCl、20%(w/v)PEG6000和100μmol·L-1ABA胁迫处理后ThCBL4基因在刚毛柽柳根和叶中的表达情况。为了进一步分析ThCBL4基因的耐盐功能,构建了植物过表达载体pROKⅡ-ThCBL4,抑制表达载体p FGC5941-ThCBL4,并进行柽柳瞬时转化,同时以pROKII瞬时侵染柽柳作为对照。分析比较NaCl胁迫后瞬时转化柽柳POD、SOD酶活性、MDA含量和DAB、NBT及Evans blue染色情况,以综合评定ThCBL4基因的耐盐功能。[结果]ThCBL4基因c DNA长度为1 432 bp,编码区长度675 bp,编码224个氨基酸,编码蛋白分子量为25.57 k Da,理论等电点为5.0。3种不同环境处理后,ThCBL4基因在刚毛柽柳根中均为上调表达,在刚毛柽柳叶中均为下调表达。对盐胁迫后瞬时表达柽柳ThCBL4基因的表达分析显示,成功获得瞬时过表达(标记为OE)、抑制表达(标记为RNAi)转基因株系。进一步的生理指标和生理染色结果显示,盐胁迫下过表达ThCBL4植株的保护酶类SOD与POD活性明显高于对照和抑制表达株系。NBT和DAB染色结果显示,过表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显低于对照,抑制表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显高于对照;而Evans blue染色和MDA含量测定结果显示,与对照相比,过表达ThCBL4植株着色更浅、MDA含量更低,而抑制表达ThCBL4植株着色更深、MDA含量更高。[结论]ThCBL4基因可能参与了刚毛柽柳的耐盐胁迫应答,瞬时过表达ThCBL4基因通过提高植株的保护酶活性,降低活性氧氧化程度和细胞损伤的程度,从而提高了转基因刚毛柽柳� 展开更多
关键词 刚毛柽柳 ThCBL4基因 耐盐 瞬时表达
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