期刊文献+
共找到340篇文章
< 1 2 17 >
每页显示 20 50 100
核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用
1
作者 朱燕 韩小韦 +4 位作者 牛毅男 郑蓓 李学俊 徐全乐 陈鹏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期827-836,共10页
核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Trun... 核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。 展开更多
关键词 核酸外切酶Ⅷ截短体 表达纯化 体外同源重组
内皮抑素变体蛋白的表达及复性与纯化工艺的优化
2
作者 王博楠 徐根兴 华子春 《药物生物技术》 CAS 2019年第3期199-203,共5页
目前抗血管新生已经成为一种有效的癌症治疗手段。内皮抑素(Endostatin)可以抑制血管新生和形成,已经作为抑癌药物上市并作为辅助用药已起到较好的治疗效果。课题组构建了将内皮抑素与穿膜肽九聚精氨酸融合的内皮抑素变体,拟促进内皮抑... 目前抗血管新生已经成为一种有效的癌症治疗手段。内皮抑素(Endostatin)可以抑制血管新生和形成,已经作为抑癌药物上市并作为辅助用药已起到较好的治疗效果。课题组构建了将内皮抑素与穿膜肽九聚精氨酸融合的内皮抑素变体,拟促进内皮抑素进入细胞膜以期达到更好的治疗效果。该研究以原核表达质粒p BV222为载体,构建了带有His标签的内皮抑素变体(9R-Endo-9R),内皮抑素变体蛋白的相对分子质量约21 k。在1 L的发酵体系下,蛋白以包涵体形式表达,为了深入探究该内皮抑素变体的生物学性能,该研究探索以变复性的方法获得可溶性内皮抑素变体,并对纯化方法进行优化以获得较高回收率。CCK-8实验结果表明该内皮抑素变体对血管内皮细胞具有增殖抑制作用,显示优化后的复性和纯化的内皮抑素变体具有较好的生物学活性。该研究为内皮抑素变体的进一步药学性质的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 内皮抑素 变体 包涵体 变复性 表达纯化 方法优化
屋尘螨第21类过敏原原核表达和过敏原性鉴定
3
作者 陈德盛 胡天城 +5 位作者 关丽 何俊贤 关律昕 罗新萍 刘志刚 刘晓宇 《中国热带医学》 CAS 2019年第2期103-106,共4页
目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋... 目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD,Western blotting结果显示有明显条带。结论成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。 展开更多
关键词 屋尘螨 derp21 表达纯化 免疫学鉴定
苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响
4
作者 樊鑫桐 杜立新 +3 位作者 高坦坦 彭琦 张杰 宋福平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期258-268,共11页
【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方... 【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 SIGMA H 表达纯化 spo0A基因 芽胞形成
八肋游仆虫组织蛋白酶B-1的克隆、表达和性质分析
5
作者 刘婧妮 王软林 梁爱华 《山西大学学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第2期427-434,共8页
为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp... 为研究八肋游仆虫中组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)的生物学功能,选用组织蛋白酶B-1(EoCTSB-1)为研究对象,通过PCR扩增获得EoCTSB-1的基因。利用生物信息学软件分析表明八肋游仆虫CTSB-1基因全长为980bp,不含有内含子,开放阅读框为862bp,编码286个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示八肋游仆虫中组织蛋白酶B-1具有保守的催化活性位点,但缺少信号肽和封闭环结构。构建重组表达质粒pET30a-EoCTSB-1,并转入原核细胞中表达,经镍柱亲和层析以及变复性处理后获得较高纯度的EoCTSB-1蛋白,表达产物利用His-Tag的抗体进行western印迹检测,结果显示阳性。利用底物Z-Phe-Arg-AMC测得EoCTSB-1的最适温度为35℃,最适pH是5.0。 展开更多
关键词 八肋游仆虫 组织蛋白酶B-1 基因克隆 表达纯化
人血清淀粉样蛋白A的原核表达及抑菌研究 预览
6
作者 徐世东 刘飞 +1 位作者 阚云超 吴峻 《信阳师范学院学报:自然科学版》 CAS 北大核心 2019年第2期196-200,共5页
人血清淀粉样蛋白A1(Serum amyloid A1 protein,SAA1)是由肝脏分泌的一种急性时相反应蛋白,在炎症、创伤或感染后在血浆中迅速上升.利用实验室前期构建的SAA1蛋白表达载体pET28a-SAA1-β,原核表达重组人血清淀粉样蛋白A1的β亚基,纯化... 人血清淀粉样蛋白A1(Serum amyloid A1 protein,SAA1)是由肝脏分泌的一种急性时相反应蛋白,在炎症、创伤或感染后在血浆中迅速上升.利用实验室前期构建的SAA1蛋白表达载体pET28a-SAA1-β,原核表达重组人血清淀粉样蛋白A1的β亚基,纯化获得高纯度的SAA1-β蛋白.同时,将表达的SAA1-β蛋白与白色念珠菌SC5314共培养,检测其对SC5314生长状态的影响.结果显示,在蛋白浓度为0、2、20、200mg/L时,菌落平均个数分别为423、385、262和217个,抑菌率分别是0%、8.98%、38.06%和48.70%,表明SAA1-β蛋白浓度在200mg/L范围内,对白色念珠菌SC5314有较好的抑制作用,且抑制作用与蛋白浓度呈正相关. 展开更多
关键词 血清淀粉样蛋白A1 表达纯化 白色念珠菌SC5314 抑菌作用
在线阅读 免费下载
利用抗原结合多肽嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体
7
作者 彭静 王琼 +3 位作者 程小玲 刘梦雯 王美 辛化伟 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期569-577,共9页
本研究旨在人绒毛膜促性腺激素(hCG)的结合多肽的基础上应用嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体,简化单域抗体制备过程,提高多肽生化稳定性。利用单域抗体通用骨架(cAbBCII10),以hCG结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3,合成cAb BCII10嫁... 本研究旨在人绒毛膜促性腺激素(hCG)的结合多肽的基础上应用嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体,简化单域抗体制备过程,提高多肽生化稳定性。利用单域抗体通用骨架(cAbBCII10),以hCG结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3,合成cAb BCII10嫁接抗体全基因序列并与sfGFP基因序列融合后,插入到带有His标签的原核表达载体pET30a(+)中,成功构建了pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP与pET30a-(His6)-cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP融合蛋白表达质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白,得到高表达量的可溶性融合蛋白。利用Ni-NTA亲和柱纯化得到纯蛋白,应用SDS-PAGE鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。通过抗原抗体结合实验,发现hCG结合多肽嫁接到单域抗体通用骨架的互补决定区CDR1或CDR3后都有抗原结合活性,具有相似的抗体滴度,且嫁接到CDR3后的抗原结合活性比CDR1要高(2–3倍)。嫁接抗体基本保留了所用单域抗体框架较为稳定的生化特性,具有一定的热稳定性和较好的碱耐受性,同时,所接入的hCG结合片段对hCG具有较特异的结合活性,为进一步优化抗原结合多肽嫁接抗体技术制备抗hCG单域抗体提供了可靠的实验基础 展开更多
关键词 hCG 单域抗体 嫁接抗体 CDR1 CDR3 融合蛋白 表达纯化
猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白的原核表达、纯化和鉴定
8
作者 江嘉欣 王钊哲 +10 位作者 许瑞 吴思敏 李嘉静 蔡爱群 林矫矫 洪炀 陆珂 李浩 陈兆国 石耀军 朱传刚 《医学动物防制》 2018年第7期671-675,共5页
目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体... 目的对猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)Cap蛋白的主要B细胞抗原表位进行分析,构建Cap表达多表位的原核表达系统,并对表达的目的蛋白进行分析,为猪圆环病毒诊断试剂开发奠定基础。方法设计并合成PCV2Cap基因,与PET-28a(+)载体连接后并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组质粒PET-28(a)-Cap,对重组质粒进行诱导表达获得重组蛋白,通过His亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果重组质粒在大肠杆菌中成功表达,蛋白质分子量约为17.4 k Da,与预期相符;Western blot结果显示,重组蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清发生特异性结合。结论PCV2 Cap蛋白的表达纯化为圆环病毒血清抗体诊断方法的建立,进而为养殖场有效监控猪圆环病毒的免疫保护情况奠定基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒 CAP蛋白 表达纯化
来源于 Rhinocladiella mackenziei 的玉米赤霉烯酮水解酶的表达纯化与酶学性质
9
作者 胡翔颖 刘文婷 +4 位作者 刘卫东 詹秀倩 郭瑞庭 李华钟 郑迎迎 《微生物学通报》 CSCD 北大核心 2018年第12期2585-2591,共7页
[背景]玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是污染最广泛的霉菌毒素之一,对饲料行业和畜牧业造成了巨大的经济损失。目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101因其热稳定性较差,无法满足工业应用上的要求。[目的]为实现玉米赤霉烯酮降解... [背景]玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是污染最广泛的霉菌毒素之一,对饲料行业和畜牧业造成了巨大的经济损失。目前研究最为广泛的玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101因其热稳定性较差,无法满足工业应用上的要求。[目的]为实现玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用,寻找酶学性质更突出的ZEN降解酶。[方法]基于对GenBank数据库的挖掘,发现一个来源于麦氏喙枝孢霉(Rhinocladiella mackenziei CBS650.93)的Rmzhd基因,构建pET-46-Rmzhd质粒。利用大肠杆菌表达体系和亲和层析、离子交换纯化体系对蛋白进行表达和纯化,通过高效液相凝胶色谱分析酶学性质。[结果]发现一个新的ZEN水解酶RmZHD,RmZHD在pH8.6和45℃条件下的活性最高,而且具有较高的耐热性。结构分析表明,较高的盐桥数目和溶剂暴露脯氨酸含量可能是造成其高耐热性的原因。[结论]本研究为促进玉米赤霉烯酮降解酶在工业上的应用打下基础。 展开更多
关键词 玉米赤霉烯酮水解酶 表达纯化 酶学性质 热稳定性
CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定 预览
10
作者 苏敬阳 王蓉蓉 +7 位作者 袁媛 李松霖 朱正南 黄露婷 封瑞 邵冬雪 孙雪菲 郝丽英 《中国医科大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期97-101,共5页
目的 制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法 利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E (GAG)突变为G (GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后... 目的 制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法 利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E (GAG)突变为G (GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,PreScission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaME141G蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性。结果 提取纯化后的CaME141G蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1.2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaME141G蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1.2钙通道结合的能力。结论 成功构建了CaME141G融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaME141G蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1.2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 钙调蛋白 突变体 质粒 表达纯化 pull-down实验
在线阅读 下载PDF
抗重组人肌红蛋白单克隆及多克隆抗体的制备及纯化 预览
11
作者 赵怀璞 周小林 蘧艳峰 《山西医药杂志》 CAS 2017年第2期217-220,共4页
人肌红蛋白(myoglobin,Mb)是目前人肌红蛋白(Mb)是国际公认的早期针对急性心肌梗死(AMI)的生化标志物之一。目前肌红蛋白及其快速诊断试剂已有产品面世,但均为进口产品,且价格较高。为此,本文利用本实验室已经构建好的重组人肌红... 人肌红蛋白(myoglobin,Mb)是目前人肌红蛋白(Mb)是国际公认的早期针对急性心肌梗死(AMI)的生化标志物之一。目前肌红蛋白及其快速诊断试剂已有产品面世,但均为进口产品,且价格较高。为此,本文利用本实验室已经构建好的重组人肌红蛋白表达质粒,表达纯化了重组人肌红蛋白(rhMb);通过杂交瘤技术获得了稳定分泌抗rhMb的杂交瘤细胞株,制备了抗rhMb单克隆抗体。 展开更多
关键词 急性心肌梗死 杂交瘤细胞株 生化标志物 抗体检测 MYOGLOBIN 表达纯化 IgG 羊抗鼠 羊抗兔 表达质粒
在线阅读 下载PDF
家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析
12
作者 何华伟 王叶菁 +4 位作者 宋凯 王姣 位曙光 赵朋 赵萍 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2017年第11期1827-1839,共13页
蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyxmori蛋白酪氨酸磷酸酶h... 蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyxmori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。 展开更多
关键词 家蚕 蛋白酪氨酸磷酸酶 克隆 表达纯化 结构
家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析 被引量:1
13
作者 何华伟 王叶菁 +5 位作者 赵敏健 位曙光 赵朋 蒋文超 刘莉娜 赵萍 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期1109-1123,共15页
精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶... 精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。 展开更多
关键词 家蚕 精氨酸激酶 表达纯化 结构 活性
α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化 预览 被引量:1
14
作者 秦海彬 熊涛 +1 位作者 张博 牛坤 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2017年第8期180-185,共6页
3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活... 3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn~(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。 展开更多
关键词 α-酮戊二酸半醛脱氢酶 定点突变 表达纯化 酶学性质
在线阅读 免费下载
全长SOD2重组蛋白的可溶表达、纯化、稳定性与跨膜效应
15
作者 潘剑茹 陈莉娟 +6 位作者 何火聪 苏颖 王香玲 李娴 陈翠煌 吴伦巧 刘树滔 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2017年第7期1168-1177,共10页
超氧化物歧化酶(SOD)家族是保护细胞免受正常代谢过程中产生的活性氧(ROS)毒性所必需的,含Mn2+离子的超氧化物歧化酶(Mn-SOD,SOD2)是其中最重要的一种。本研究合成了人源SOD2全基因序列,并将其插入带有GST的原核表达载体p GEX-4... 超氧化物歧化酶(SOD)家族是保护细胞免受正常代谢过程中产生的活性氧(ROS)毒性所必需的,含Mn2+离子的超氧化物歧化酶(Mn-SOD,SOD2)是其中最重要的一种。本研究合成了人源SOD2全基因序列,并将其插入带有GST的原核表达载体p GEX-4T-1中,成功构建了GST-SOD2融合蛋白表达质粒。然后,将重组质粒p GEX-4T-1-SOD2转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在25℃下诱导表达融合蛋白,得到可溶性GST-SOD2融合蛋白,经GST亲和树脂纯化得到比活为1 788 U/mg的纯蛋白,分子量约为46 k Da。利用凝血酶切去GST标签后经肝素亲和柱纯化得到了电泳纯的SOD2重组蛋白,该蛋白分子量约为25 k Da,与SOD2全长序列的理论分子量相符,比活为2 000 U/mg。两种重组SOD2蛋白在生理条件下都具有良好的SOD活性,且都具有显著的跨膜能力(P〈0.05)。这些工作为深入研究两种全长重组SOD2蛋白的结构与生物效应建立了基础。 展开更多
关键词 Mn超氧化物歧化酶 构建 融合蛋白 表达纯化 稳定性 跨膜效应
家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析 预览
16
作者 何华伟 王叶菁 +5 位作者 侯丽 李瑜 位曙光 赵朋 蒋文超 赵萍 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第14期2837-2850,共14页
【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【... 【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值 展开更多
关键词 家蚕 碱性磷酸酶 表达纯化 结构 性质
在线阅读 下载PDF
八肋游仆虫ARF1蛋白的表达纯化及其与嘌呤核苷酸的相互作用
17
作者 赵雪梅 宋建英 +3 位作者 王茜 王软林 杨斌盛 梁爱华 《山西大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2017年第2期365-372,共8页
ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成员,调控细胞内囊泡运输,进而影响细胞的生长发育。为了研究单细胞真核生物八肋游仆虫ARF1的功能,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,获得高纯度的八肋游仆虫腺苷... ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成员,调控细胞内囊泡运输,进而影响细胞的生长发育。为了研究单细胞真核生物八肋游仆虫ARF1的功能,构建了重组表达质粒pET28a-ARF1,在大肠杆菌BL21中进行了表达纯化,获得高纯度的八肋游仆虫腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,随后通过荧光光谱法检测了其与嘌呤核苷酸的相互作用。结果表明,表达纯化的EoARF1蛋白能与嘌呤核苷酸发生相互作用,其结合位点数n约等于1,且与鸟嘌呤核苷酸作用强弱顺序为GTP〉GDP〉GMP,与GDP的结合强度明显大于与ADP的结合强度。 展开更多
关键词 ADP核糖基化因子1 八肋游仆虫 表达纯化 荧光光谱法
GST-SOD1-R9融合蛋白的表达、纯化、稳定性与跨膜效应 被引量:1
18
作者 潘剑茹 吴伦巧 +4 位作者 何火聪 陈莉娟 苏颖 李玲玲 刘树滔 《生物工程学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期828-837,共10页
穿膜肽TAT介导的双效抗氧化酶GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-TAT-SOD1(Cu,Zn超氧化物歧化酶),可有效清除胞内自由基,其预防氧化损伤的效果强于SOD1-TAT,但前者的跨膜能力不如后者。为增强双效抗氧化酶的跨膜效率,本研究融合了SOD1和穿膜... 穿膜肽TAT介导的双效抗氧化酶GST(谷胱甘肽巯基转移酶)-TAT-SOD1(Cu,Zn超氧化物歧化酶),可有效清除胞内自由基,其预防氧化损伤的效果强于SOD1-TAT,但前者的跨膜能力不如后者。为增强双效抗氧化酶的跨膜效率,本研究融合了SOD1和穿膜肽R9,合成SOD1-R9全基因序列,并将其插入带有GST的原核表达载体pGEX-4T-1中,成功构建了GST-SOD1-R9融合蛋白表达质粒。然后,将重组质粒pGEX-4T-1-SOD1-R9转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白,通过改变诱导温度和诱导时间,确定了融合蛋白在25℃下表达11 h,可得到高表达量的可溶性GST-SOD1-R9融合蛋白。利用80%硫酸铵沉淀和GST琼脂糖树脂纯化得到纯蛋白,应用SDS-PAGE和酶活性鉴定纯化的蛋白为正确表达的目标蛋白。GST-SOD1-R9融合蛋白的温度和pH稳定性实验结果证实,该蛋白在生理条件下具有良好的SOD和GST活性。细胞跨膜实验结果证明其跨膜能力与GST-TAT-SOD1融合蛋白相比显著增强(P〈0.05)。这些工作为深入研究GST-SOD1-R9的抗氧化损伤效应建立了基础。 展开更多
关键词 GST-SOD1-R9 构建 融合蛋白 表达纯化 稳定性 跨膜效应
抗病毒蛋白RC28在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及活性比较 被引量:1
19
作者 胡立强 郑文 +3 位作者 钟艺 杜丹 杨浩 龚萌 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期14-20,共7页
RC28蛋白是从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的新型抗病毒蛋白。前期通过3'-RACE方法,从皱盖罗鳞伞总RNA中克隆获得包含RC28编码区的c DNA,并通过TA克隆获得质粒p MD18-T-RC28。以该质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增RC28片段,分别插... RC28蛋白是从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的新型抗病毒蛋白。前期通过3'-RACE方法,从皱盖罗鳞伞总RNA中克隆获得包含RC28编码区的c DNA,并通过TA克隆获得质粒p MD18-T-RC28。以该质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增RC28片段,分别插入大肠杆菌表达载体p ET28a(+)和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,形成在N端表达组氨酸标签的重组RC28表达粒体。将这两种RC28表达质粒转化各自的宿主菌后,筛选阳性克隆,构建稳定表达体系。诱导表达后,用SDS-PAGE电泳和Western blot分析RC28的表达情况。放大表达体系后用Ni-NTA柱纯化获得RC28蛋白,并用MTT法测试重组表达蛋白质的抗病毒活性。在实验条件下,大肠杆菌和毕赤酵母中均能表达可溶性重组RC28,纯化后蛋白质得率分别是3.5mg/L发酵液及0.2mg/L发酵液。但抗病毒活性实验表明,大肠杆菌体系表达的RC28蛋白活性较差,而毕赤酵母系统表达的RC28蛋白的抗病毒活性与天然蛋白接近。 展开更多
关键词 大肠杆菌 毕赤酵母 表达纯化 抗病毒RC28
HER2肿瘤靶向亲合体重组蛋白的构建、表达纯化及功能验证 预览
20
作者 池小琴 《世界复合医学》 2017年第3期21-26,共6页
目的实现重组亲合体的高效表达和纯化,并验证其活性。方法选择2016年1—12月该院收治的56例卵巢癌患者为研究对象,对HER2亲合体编码序列进行优化,增加其与纳米载体的连接位点,提高表达和纯化效率。重组表达产物Z_(HER2:342)经过凝胶... 目的实现重组亲合体的高效表达和纯化,并验证其活性。方法选择2016年1—12月该院收治的56例卵巢癌患者为研究对象,对HER2亲合体编码序列进行优化,增加其与纳米载体的连接位点,提高表达和纯化效率。重组表达产物Z_(HER2:342)经过凝胶亲和层析纯化和质谱检测分子量,并将纯化产物作为靶向分子连接纳米药物,检测其对HER2高表达细胞的靶向能力。结果 Z_(HER2:342)重组亲合体产物纯度约为97.8%,回收效率1.0 mg/mL。纯化产物分子量为7.648 kDa,与理论值7.631 kDa误差0.2%,表明构建的Cys-Z_(HER2:342)-6His重组亲合体正确。细胞实验表明其可显著提高纳米药物对乳腺癌细胞的细胞毒性(P〈0.01),对HER2高表达的肿瘤细胞具有特定的靶向性。结论重组表达产物Z_(HER2:342)构建正确,可实现高效表达纯化并对HER2高表达的肿瘤细胞具有特定的靶向性。 展开更多
关键词 肿瘤 靶向分子 重组亲合体 表达纯化 靶向能力分析
在线阅读 下载PDF
上一页 1 2 17 下一页 到第
使用帮助 返回顶部 意见反馈