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重组腺病毒Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖 预览
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作者 杨怀才 谌崇峰 余文洁 《临床医学工程》 2018年第6期736-738,共3页
目的观察重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用。方法构建重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA,鉴定后将质粒转染HEK293A细胞,得到Nucleoli-SiRNA重组腺病毒。病毒体外转染MCF-7细胞,采用Weste... 目的观察重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用。方法构建重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA,鉴定后将质粒转染HEK293A细胞,得到Nucleoli-SiRNA重组腺病毒。病毒体外转染MCF-7细胞,采用Western Blot检测Nucleolin蛋白的表达情况。将细胞分正常细胞、表柔比星、Ad-SiRN-、Ad-NucleolinSiRNA、表柔比星+Ad-SiRN-、表柔比星+Ad-Nucleolin-SiRNA共6组,MTT法检测6组细胞的增殖能力。结果酶切和测序鉴定均证实重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA构建成功,插入序列正确无误。Western Blot检测结果显示,转染NucleolinSiRNA的MCF-7细胞核仁素表达明显受到抑制。与其他各组比较,应用Ad-Nucleolin-SiRNA联合表柔比星能明显抑制MCF-7细胞的增殖(P〈0.01)。结论重组腺病毒载体Ad-Nucleolin-SiRNA能增强表柔比星抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖的能力。 展开更多
关键词 核仁素 重组腺病毒载体 表柔比星 增殖
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携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装 预览
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作者 张本斯 李庄 +4 位作者 卞思源 杨桂 李艳娇 张覃 黄煜 《解剖学杂志》 CSCD 2018年第4期382-387,共6页
目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、... 目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。 展开更多
关键词 EPHRINA1 CASPASE-3 重组腺病毒载体 构建 包装
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Bak1腺病毒表达载体的构建及对人成骨肉瘤细胞的影响 预览
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作者 柴爽 黄红 +3 位作者 万雷 王吉利 王伟 黄宏兴 《广东医学》 2018年第9期1332-1336,共5页
目的构建人Bcl2拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响。方法利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER-Bak1,... 目的构建人Bcl2拮抗1(Bak1)基因重组表达腺病毒pAd-Bak1,并感染人成骨肉瘤细胞MG63建立过表达Bak1的细胞模型,检测其对细胞活性的影响。方法利用qPCR扩增Bak1全长cDNA,利用穿梭质粒pENTER构建载有Bak1基因的重组穿梭质粒pENTER-Bak1,通过基因测序鉴定载体序列。将重组载体PmeⅠ线性化、脱磷酸化后,转入含有腺病毒骨架质粒pAd-Amp的感受态BJ5183细胞中进行基因同源重组。将重组腺病毒质粒pAD-Bak1经PacⅠ酶切线性化后,用Lipofectamine 2000脂质体转染到HEK-293细胞中进行包装扩繁,荧光定量PCR法测定病毒滴度。感染MG63细胞,qPCR和Western blot检测Bak1的表达,MTT检测细胞活性。结果测序及酶切验证pENTER-Bak1构建成功。pAD-Bak1感染MG63细胞,qPCR检测到细胞中Bak1基因过表达(与NC对照组和空白对照组相比P〈0.01、P〈0.01),Western blot检测到细胞中Bak1蛋白过表达。MTT检测显示与NC对照组相比,细胞活性减弱(P〈0.05)。结论成功构建了Bak1重组表达腺病毒,验证了其能够感染MG63细胞表达Bak1蛋白,证明了过表达Bak1可以减弱细胞的活性。为进一步研究Bak1的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 人Bcl2拮抗1(Bak1)蛋白 重组腺病毒载体 人成骨肉瘤细胞MG63
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大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定 预览
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作者 林慕之 刘兴德 +3 位作者 张璐 刘姿麟 刘志琴 况春燕 《重庆医学》 2018年第20期2709-2713,共5页
目的构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序... 目的构建大鼠shRNA-TRPC4重组腺病毒载体并观察其在大鼠内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法针对大鼠TRPC4序列设计4个RNA干扰靶点序列并合成双链DNA oligo,连接入干扰载体后转入大肠杆菌感受态细胞,培养后挑取转化子进行PCR鉴定及测序比对。利用Admax包装系统获得重组腺病毒Ad-shRNA-TRPC4小量扩增并测定病毒滴度,检测重组腺病毒对TRPC4表达的影响,最后将获得的重组腺病毒转染EPCs,在荧光显微镜下观察并用流式细胞仪测定其转染效率。结果4组干扰质粒经培养后的转化子中均有阳性克隆,且阳性克隆与设计的干扰靶点序列一致;4组目的质粒均可抑制TRPC4蛋白的表达,合成的Ad-shRNA-TRPC4病毒滴度为5×10 10 ifu/mL;倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒在大鼠EPCs的转染效率分别为(85.47±2.05)%和(67.27±2.94)%。结论本实验成功构建Ad-shRNA-TRPC4载体,其在EPCs的转染效率高。 展开更多
关键词 瞬时感受器电位C离子通道4 SHRNA 重组腺病毒载体 内皮祖细胞
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重组腺病毒rAd-mIL-15的构建及表达 预览
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作者 谭榜云 李莉 刘志武 《检验医学与临床》 CAS 2017年第22期3300-3302,共3页
目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15。在Li... 目的构建并制备鼠白细胞介素-15(mIL-15)重组腺病毒(rAd-mIL-15),感染HEK293细胞,为肝细胞肝癌的免疫治疗奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增mIL-15,将扩增产物连接到穿梭载体pDC316上,构建重组穿梭质粒pDC316-mIL-15。在Lipofectamine2000脂质体介导下将腺病毒骨架载体pBHGlox△E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-mIL-15共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-mIL-15。随后在HEK293细胞中包装扩增病毒并测定病毒滴度。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果重组腺病毒质粒经PCR鉴定,证实含有mIL-15基因,重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25×10^10 PFU/mL。结论采用细胞内同源重组方法可成功构建含mIL-15基因的重组腺病毒,并可获得高滴度病毒,其能高效感染HEK293细胞,能为进一步研究奠定基础。 展开更多
关键词 白细胞介素-15 重组腺病毒载体 包装
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重组腺病毒载体埃博拉疫苗的工艺特点和技术创新 被引量:1
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作者 朱涛 《生物技术通讯》 CAS 2017年第1期12-15,共4页
埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD),是迄今发现的感染性最强的传染性疾病之一。埃博拉病毒属分5个亚种,即埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-莱斯顿型(EBO-Reston)、埃博拉-科特迪瓦型(EBO-t... 埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD),是迄今发现的感染性最强的传染性疾病之一。埃博拉病毒属分5个亚种,即埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-莱斯顿型(EBO-Reston)、埃博拉-科特迪瓦型(EBO-tai forest)和本迪布焦型(EBO-bundibugyoe)。 展开更多
关键词 重组腺病毒载体 技术创新 工艺特点 疫苗 VIRUS 传染性疾病 埃博拉病毒 科特迪瓦
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Antiapoptotic Effect of Gene Therapy with Recombinant Adenovirus Vector Containing Hypoxia-inducible Factor-1α after Cerebral Ischemia and Reperfusion in Rats
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作者 Ming-Lang Yang Tao Tao +2 位作者 Jian Xu Zhi Liu Dan Xu 《中华医学杂志:英文版》 SCIE CAS CSCD 2017年第14期1700-1706,共7页
关键词 重组腺病毒载体 脑缺血再灌注 低氧诱导因子-1Α 抗凋亡作用 基因治疗 大鼠脑 免疫组织化学染色 hif-1α
肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物过表达促进心肌细胞自噬
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作者 王添乐 李振华 +1 位作者 杨晓 王剑 《生物技术通讯》 CAS 2017年第6期737-741,共5页
目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack... 目的:构建和包装携带肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs)全长基因的重组腺病毒,并研究Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。方法:PCR扩增Hgs全长cDNA,将其连接到pMD18-T载体上,测序确认正确后将其克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,该载体线性化后转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-Hgs;将pAd-Hgs线性化后经脂质体转染293A细胞进行Ad-Hgs病毒的包装与扩增;用得到的Ad-Hgs腺病毒感染心肌细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹、real-timePCR确认病毒感染的有效性以及Hgs过表达情况;通过Western印迹检测自噬标志物LC3的转换(LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ),以分析Hgs过表达对心肌细胞自噬的影响。结果:包装了携带Hgs基因的重组腺病毒Ad-Hgs;Ad-Hgs重组腺病毒感染心肌细胞后,荧光显微镜观察到明显的GFP表达;real-timePCR、Western印迹结果显示Hgs在心肌细胞中得到过表达;Western印迹结果证明,Hgs过表达导致心肌细胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明显升高。结论:通过包装携带HgscDNA的重组腺病毒,发现Hgs过表达促进心肌细胞自噬。 展开更多
关键词 肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物(Hgs) 重组腺病毒载体 心肌细胞 自噬
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番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定
9
作者 林锋强 程晓霞 +4 位作者 王劭 朱小丽 王锦祥 陈仕龙 陈少莺 《福建农业学报》 CAS 北大核心 2016年第10期1015-1019,共5页
应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源... 应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。 展开更多
关键词 番鸭呼肠孤病毒 σC基因 重组腺病毒载体
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大鼠Rars基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定 预览
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作者 沈寅 符荣 +3 位作者 赵洪洋 王海均 王文良 张立志 《中国临床神经外科杂志》 2016年第5期290-293,共4页
目的构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带RarssiRNA序列的重组腺病毒,阴... 目的构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带RarssiRNA序列的重组腺病毒,阴性对照组细胞转染携带Scramble无意义序列的重组腺病毒,空白对照组不转染任何病毒。观察各对照组表达绿色荧光蛋白(GFP)的阳性细胞数,计算转染率,并检测转染前后Rars基因对应产物精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)蛋白的表达量,评价基因沉默效率。结果成功构建包含Rars基因干扰序列及Scramble序列的重组腺病毒,病毒滴度达10^10级。利用重组腺病毒感染大鼠神经元细胞48h后,绝大部分细胞表达GFP,转染率〉95%。含Rats干扰序列的病毒转染细胞可使ArgRS蛋白表达量显著降低(P〈0.01),沉默效率〉60%。含Scramble对照序列的病毒则不能产生明显的基因沉默效应。结论本实验所构建的siRNA重组腺病毒载体可有效沉默大鼠Rars基因,降低ArgRS蛋白表达。 展开更多
关键词 Rars基因 小分子干扰RNA 重组腺病毒载体 精氨酰-TRNA合成酶
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Raf-1基因重组腺病毒siRNA载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响 预览 被引量:1
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作者 郑亚萍 刘春杰 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2016年第4期18-23,共6页
目的构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒p Ad Track CMV中获得p Ad Track-siRaf-1质粒,Pm... 目的构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体,并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列,经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒p Ad Track CMV中获得p Ad Track-siRaf-1质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与p Ad Easy-1骨架质粒进行同源重组获得p Ad-siRaf-1质粒,后转染HEK293细胞,包装获得p Ad-siRaf-1腺病毒颗粒,继而感染原代培养的心肌细胞,通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液体闪烁计数仪测定3H-亮氨酸([3H]-leu)掺入率,用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确,制备的病毒感染效率高,携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了p Ad-siRaf-1重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达,抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。 展开更多
关键词 RAF-1 小干扰RNA 重组腺病毒载体 心肌细胞 大鼠
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人 PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 预览 被引量:1
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作者 李腾 李琼 +5 位作者 严国强 储佳佳 沈小丹 温见炳 黄起壬 钟荣梅 《南昌大学学报:医学版》 CAS 2015年第3期19-22,26共5页
目的:构建人的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的重组腺病毒载体。方法从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中提取并扩增人 PPARγ cDNA 目的片段,将该目的片段经 AgeⅠ/NheⅠ酶切后插入经相同内切酶酶切后表达质粒(CMV-MCS-SV4... 目的:构建人的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)基因的重组腺病毒载体。方法从人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中提取并扩增人 PPARγ cDNA 目的片段,将该目的片段经 AgeⅠ/NheⅠ酶切后插入经相同内切酶酶切后表达质粒(CMV-MCS-SV40-EGFP)得到重组穿梭质粒;再将该重组穿梭质粒与 AdMax 腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHG loxΔE1,3 Cre)经 Cre/loxP 酶切重组,构建重组腺病毒(Ad-PPARγ);最后,将 Ad-PPARγ感染HEK293T 细胞,进行病毒的包装、扩增、纯化及滴度检测。结果通过 PCR 鉴定及基因测序分析,PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功;Western blot 结果显示经包装及纯化的 Ad-PPARγ感染 HUVECs 后,可显著上调 HU-VECs 中 PPARγ基因的表达。结论 PPARγ过表达重组腺病毒载体构建成功,且能有效上调 HUVECs 中PPARγ基因的表达。 展开更多
关键词 过氧化物酶体增殖物激活受体 重组腺病毒载体 基因重组 AdMax 腺病毒包装系统
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大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 预览 被引量:1
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作者 袁静 葛坚 俞建雄 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2015年第41期6699-6705,共7页
背景:研究表明,神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子,因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰,有可能将成体细胞转分化为神经细胞,为视神经再生治疗提供新策略。目的:构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表... 背景:研究表明,神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子,因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰,有可能将成体细胞转分化为神经细胞,为视神经再生治疗提供新策略。目的:构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体,获得重组腺病毒pA d-rat-ASCL1-EGFP,以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法:用XhoⅠ和EcoRⅠ将目的基因ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体p Yr-adshuttle-4进行双酶切;回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态;提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pA d/PL-DEST腺病毒表达载体,PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度,荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论:通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体pA d-rat-ASCL1-EGFP构建正确,PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带,TCID50法测定病毒滴度为2×1010pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功,获得的病毒具有高滴度,高效感染率,为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 干细胞 腺病毒 绿色荧光蛋白质类 视神经 组织工程 培养 神经母细胞特异性转移因子 重组腺病毒载体 增强型绿色荧光蛋白 病毒滴度 视神经再生 国家自然科学基金
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在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控 预览 被引量:1
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作者 赵婧 岳鹏 +3 位作者 黄家芳 汪玉涛 马婷 陈宝荣 《中国组织工程研究》 北大核心 2015年第2期220-224,共5页
背景:miRNA通过调节特异靶基因的表达,在疾病的发展及预后中起着重要作用。目的:探索miRNA-21在宫颈癌Hela细胞中对TLR4基因的调控关系。方法:通过miR NA靶基因预测网站寻找可能与miR NA-21相互作用的靶基因,利用已构建的携带pri-miR... 背景:miRNA通过调节特异靶基因的表达,在疾病的发展及预后中起着重要作用。目的:探索miRNA-21在宫颈癌Hela细胞中对TLR4基因的调控关系。方法:通过miR NA靶基因预测网站寻找可能与miR NA-21相互作用的靶基因,利用已构建的携带pri-miRNA-21基因重组腺病毒载体,包装并大量扩增病毒感染Hela细胞,检测荧光蛋白的表达水平,提取感染48 h蛋白,通过Western印迹检测TLR4蛋白表达。从蛋白水平验证在Hela细胞中miRNA-21与靶基因TLR4的靶向调控关系。结果与结论:100 MOI的重组腺病毒pAd/pri-miR NA-21、pAd/neg可以成功感染Hela细胞。生物信息学方法显示miRNA-21和TLR4存在可能的结合位点。发现感染pAd/pri-miR NA-21组与对照组pAd/neg及空白组相比,TLR4蛋白的表达量明显降低。证实了miRNA-21可以负调节靶基因TLR4的表达。 展开更多
关键词 组织构建 组织工程 重组腺病毒载体 pri-miRNA-21 TLR4基因 HELA细胞 靶基因
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血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖 预览 被引量:2
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作者 王钰 朱志图 陈峻江 《中国组织工程研究》 北大核心 2015年第28期4485-4492,共8页
背景:目前自体脂肪移植已广泛运用于美容整形和修复创伤导致的软组织缺损的修复,有研究表明,移植后1年移植脂肪存活率为20%-80%,因此,在移植后的早期及时、充分的血供建立,对于移植脂肪的存活是非常重要的。目的:观察血管内皮生... 背景:目前自体脂肪移植已广泛运用于美容整形和修复创伤导致的软组织缺损的修复,有研究表明,移植后1年移植脂肪存活率为20%-80%,因此,在移植后的早期及时、充分的血供建立,对于移植脂肪的存活是非常重要的。目的:观察血管内皮生长因子165转染人脂肪间充质干细胞的增殖情况。 方法:体外传代培养人脂肪间充质干细胞,将重组血管内皮生长因子165基因入腺病毒液和空病毒液转染至脂肪间充质干细胞内,分别设为实验组和对照组,另设正常培养的细胞为空白组。 结果与结论:RT-PCR,Western blot,MTT 检测显示,与对照组和空白组相比,实验组血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白的表达及细胞增殖均增高(P〈0.05)。结果证实,腺病毒承载的血管内皮生长因子165基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达目的蛋白,同时也能显著促进脂肪间充质干细胞的增殖。 展开更多
关键词 组织工程 干细胞 细胞增殖 病毒 脂肪干细胞 血管内皮生长因子165 脂肪间充质干细胞 重组腺病毒载体 脂肪移植 病毒包装 血管生成 成活率 增强型绿色荧光蛋白 组织缺损
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靶向大鼠PALM3基因的RNA重组腺病毒载体构建及鉴定 预览
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作者 付玉梅 陈旭昕 韩志海 《西部医学》 2015年第8期1124-1127,共4页
目的构建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短发夹shRNA(RNA)重组腺病毒载体,干扰大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AE2cells)中PALM3的表达。方法设计大鼠靶向PALM3基因的shRNA,插入穿梭质粒pGV120-EGFP,行PCR、测序鉴定;将穿梭质粒和骨架... 目的构建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短发夹shRNA(RNA)重组腺病毒载体,干扰大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AE2cells)中PALM3的表达。方法设计大鼠靶向PALM3基因的shRNA,插入穿梭质粒pGV120-EGFP,行PCR、测序鉴定;将穿梭质粒和骨架质粒共转293细胞,进行重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包装,并采用TCID50法测定病毒感染滴度;用此病毒感染大鼠AE2细胞,Western blot法检测细胞内PALM3蛋白表达。结果穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP经PCR及测序鉴定证实构建成功,进一步构建了表达大鼠PALM3基因shRNA的重组腺病毒载体Ad-palm3-shRNA-EGFP,重组腺病毒感染滴度为3×1010 pfu/mL,感染大鼠AE2细胞后显著抑制目的蛋白表达(P〈0.05)。结论本实验成功构建了针对大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒,显著下调了大鼠AE2细胞中PALM3的表达,为进一步探索PALM3在炎性失控性疾病中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 短发夹RNA paralemmin-3 重组腺病毒载体 RNA干扰 急性肺损伤
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猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒的构建及其免疫原性 被引量:3
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作者 王凯 杨青春 +2 位作者 陈绍红 刘艳芬 刘铀 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1114-1121,共8页
采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出... 采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-P97,用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光试验检测重组P97蛋白在AD-293和PK15细胞中的表达。之后,用Ad-P97抗血清检测Mhp对宿主细胞的黏附作用以及Ad-P97在仔猪体内的免疫应答反应。结果显示,P97基因由3 339个核苷酸组成,共编码1 113个氨基酸,其核苷酸序列高度保守;重组P97蛋白可在Ad-P97感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达,但Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变;Ad-P97具有良好的免疫原性,能抑制Mhp对PK15细胞的黏附作用,诱导免疫仔猪产生Mhp凝集抗体。上述结果为进一步研制安全、高效的Mhp重组疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 黏附因子 重组腺病毒载体 疫苗
人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定
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作者 揭飞龙 吕茂民 +4 位作者 王升尧 颜仁和 何悦 李红卫 章金刚 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期203-205,共3页
目的 构建表达人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ(rh FⅦ)。方法 利用Bam HⅠ和EcoRⅤ双酶切pc DNA 3.1-FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化... 目的 构建表达人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ(rh FⅦ)。方法 利用Bam HⅠ和EcoRⅤ双酶切pc DNA 3.1-FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白(GFP)表达盒的p Ad Track-CMV腺病毒穿梭载体,构建p Ad Track-CMV-FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,p Ad Track-CMV-FⅦ在BJ5183感受态菌内与p Ad Easy-1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒p Ad-FⅦ;经PacⅠ酶切后的p AdFⅦ,使用PEI试剂转染293A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad-FⅦ;利用Western印迹检测重组腺病毒Ad-FⅦ介导293A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果 经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到p Ad Track-CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒p Ad Track-CMV-FⅦ;将其与p Ad Easy-1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒p Ad-FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论 成功构建重组腺病毒Ad-FⅦ,并实现了rh FⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rh FⅦ的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人凝血因子Ⅶ 重组腺病毒载体 哺乳动物细胞 蛋白表达
突变型低氧诱导因子1α加速骨缺损部位新血管生成的实验观察 预览 被引量:4
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作者 王皓 李谌 郜玉忠 《西安交通大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期455-461,共7页
目的:通过突变低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF1α)基因的3个氨基酸位点研究该基因在常氧条件下骨缺损区域对血管新生效应的影响。方法定点突变 HIF1α编码区(coding sequence,CDS)402、564和803位3个氨基酸后将... 目的:通过突变低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1,HIF1α)基因的3个氨基酸位点研究该基因在常氧条件下骨缺损区域对血管新生效应的影响。方法定点突变 HIF1α编码区(coding sequence,CDS)402、564和803位3个氨基酸后将基因重组入腺病毒 pAdEasy-1系统并测定滴度,同理包装未突变组和空病毒组;以3种病毒液连同空白组共分4组进行后续实验(A 组:含突变 HIF1α基因病毒液,B 组:含未突变 HIF1α基因病毒液,C 组:空病毒液, D 组:空白组);将病毒液转染入兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)内,通过示踪因子人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)观察病毒转染效率,检测各组转染细胞中 HIF1α基因 mRNA 和蛋白表达情况;制作兔桡骨缺损动物模型,将含目的基因的病毒液按上述分组转染 MSCs 后作为种子细胞移植到多孔纳米磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷(apatite-wollastonite magnetic bioactive glass-ceramic,A-W MGC)载体中搭建人工组织工程骨架载体并植入体内,于术后8周处死各组动物,取植入区域组织做新血管生成检测。结果CDS 区第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸;3种腺病毒重组体构建成功并鉴定完毕;A、B 两组 HIF1αmRNA 表达量明显高于 C、D 两组,差异具有统计学意义(P 〈0.05),而 A、B 两组之间及 C、D 两组之间比较,差异无统计学意义(P 〉0.05);A 组 HIF1α蛋白表达量明显高于其他3组,差异具有统计学意义(P 〈0.05),而 B、C、D 3组之间比较差异无统计学意义(P 〉0.05);A 组转染到动物体内后可见明显成血管效果,其他3组未见缺损区域有血管新生。结论①3点突变后 HIF1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达;②3点突变后 HIF1α基因能够在体内局部形成有效的血管网络。 展开更多
关键词 低氧诱导因子lα 基因突变 重组腺病毒载体 骨髓间充质干细胞 血管生成 骨缺损
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BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究 被引量:2
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作者 付维力 陈刚 +2 位作者 唐新 李棋 李箭 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期472-476,共5页
目的探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果。方法取3~4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代。采用Ad Easy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体。将BMP-12重组腺病毒体体外转... 目的探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果。方法取3~4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代。采用Ad Easy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体。将BMP-12重组腺病毒体体外转染第3代外周血MSCs,转染后24 h通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染效率,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,转染后8、24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达;转染后0、7、14 d,采用免疫组织化学染色观察I型胶原表达情况;实时定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平,并设未转染细胞作为对照组。结果转染后24 h,倒置相差显微镜观察示细胞生长增殖缓慢,细胞形态清晰;FCM检测示,转染组转染效率为99.57%,未转染组为2.46%;转染后8 h,荧光显微镜下即可见GFP表达,随培养时间延长GFP表达逐渐增多,24 h时几乎所有细胞均可见GFP表达。免疫组织化学染色示,随转染时间延长,Ι型胶原表达逐渐增强;转染组转染后14 d,肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067,均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024,差异有统计学意义(t=—7.700,P=0.031;t=—5.741,P=0.020;t=—12.998,P=0.000)。结论 BMP-12重组腺病毒载体可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化,并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质产生,为外周血MSCs用于肌腱/韧带再生提供了依据。 展开更多
关键词 外周血MSCs BMP-12 重组腺病毒载体 肌腱/韧带再生 基因工程 细胞治疗
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