期刊文献+
共找到203篇文章
< 1 2 11 >
每页显示 20 50 100
293T细胞模型中整合素β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响
1
作者 李东亚 毛建华 +7 位作者 张威 陈欣洁 肖兵 阮铮 王韵 蒋国雄 施小凤 奚晓东 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期227-232,共6页
目的:建立含有Calpain切割相关的β3胞浆尾段突变体的293T细胞模型,研究β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响。方法:利用293T细胞模型建立共表达人类野生型整合素αⅡb和野生型β3或突变型β3(β3ΔNITY(β3胞浆... 目的:建立含有Calpain切割相关的β3胞浆尾段突变体的293T细胞模型,研究β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响。方法:利用293T细胞模型建立共表达人类野生型整合素αⅡb和野生型β3或突变型β3(β3ΔNITY(β3胞浆段截去NITY基序)、β3Δ754(β3胞浆段截去羧基末端最后8个氨基酸TNITYRGT)、β3Δ759(β3胞浆段截去羧基末端最后3个氨基酸RGT)的稳转细胞株,通过细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展试验检测各稳转细胞株的黏附及伸展功能。结果:成功建立了293T-αⅡbβ3ΔNITY、293T-αⅡbβ3Δ754、293T-αⅡbβ3Δ759、293T-αⅡbβ3细胞株,稳定表达野生型整合素β3全长的293T--αⅡbβ3细胞株较293T细胞具有良好的在固相化纤维蛋白原上的黏附和伸展能力,可以作为血小板的替代模型,而293T-αⅡbβ3ΔNITY稳转细胞株的黏附和伸展能力稍低于293T-αⅡbβ3稳转细胞株,但293T-αⅡbβ3Δ754细胞、293T-αⅡbβ3Δ759细胞株的黏附和伸展能力均明显受损。结论:对整合素β3介导的细胞伸展功能,RGT基序至关重要,而NITY并非必不可少,同时所建β3胞浆尾段不同突变体的293T细胞株也为进一步的质谱分析数据库比对奠定了基础。 展开更多
关键词 整合素αⅡbβ3 293T细胞 整合素β3胞浆尾端 伸展 粘附 细胞功能
应用固定床式生物反应器大规模制备慢病毒 被引量:1
2
作者 徐文涛 解国放 解正刚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期73-76,共4页
目的研究应用固定床式生物反应器制备慢病毒的工艺。方法分别在2个1.5 L固定床式生物反应器中,加入50 g片状载体,接种293T细胞,当细胞生长3 d,细胞密度达1.0-1.5×10^7个/m L时,使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为转染介... 目的研究应用固定床式生物反应器制备慢病毒的工艺。方法分别在2个1.5 L固定床式生物反应器中,加入50 g片状载体,接种293T细胞,当细胞生长3 d,细胞密度达1.0-1.5×10^7个/m L时,使用聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为转染介质转染质粒制备慢病毒;分别根据葡萄糖消耗进行换液培养收获和连续灌流收获病毒原液,采用逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。结果换液培养共收获6 L慢病毒原液,收获时间持续5 d,病毒滴度最高可达5.13×10^7 TU/m L;连续灌流培养共收获9 L慢病毒原液,收获时间持续8 d,病毒滴度最高可达2.62×10^8 TU/m L。结论用固定床式生物反应器连续灌流培养可用于临床级别的慢病毒制备。 展开更多
关键词 生物反应器 固定床式 慢病毒 293T细胞
AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定 预览 被引量:1
3
作者 汪新建 樊爽爽 +3 位作者 翁少亭 杨国宇 褚贝贝 王江 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第1期118-121,共4页
为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-... 为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。 展开更多
关键词 肌肉生长抑制素基因 CRISPR-Cas9 腺相关病毒载体 293T细胞
在线阅读 下载PDF
小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响
4
作者 王玉晶 温丽敏 +3 位作者 白欣艳 曹睿 王海龙 郭睿 《解剖学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期41-48,共8页
目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spa... 目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。 展开更多
关键词 精子发生相关蛋白3基因 HEK 293T细胞 细胞转染 自噬 免疫印迹法 小鼠
不同转染试剂对制备CAR-T细胞的病毒包装效果比较 预览
5
作者 徐丹丹 金国良 +1 位作者 宋晶园 郑骏年 《徐州医科大学学报》 CAS 2018年第3期186-190,共5页
目的为提高制备嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcell,CAR—T)的病毒包装滴度,比较并确定有效的病毒包装转染试剂。方法应用氯化钙(CaCl2)、Transintro EL、脂质体Lip2000三种质粒转染试剂对逆转录病毒载体质粒MSCV—I... 目的为提高制备嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcell,CAR—T)的病毒包装滴度,比较并确定有效的病毒包装转染试剂。方法应用氯化钙(CaCl2)、Transintro EL、脂质体Lip2000三种质粒转染试剂对逆转录病毒载体质粒MSCV—IRES—GFP(MIGl)、含嵌合抗原受体(CAR)及HA标签的逆转录病毒载体质粒MSCV—IRES(MIG2)、真核表达质粒pIRES2EGFP—DDRl(PDDRl)进行转染,荧光显微镜观察、流式细胞检测上述试剂的转染效率。结果Transintro EL均获得相对较高的转染效率,对MIGl为(43.90±0.57)%,对MIG2为(42.80±0.57)%,对PDDRl为(58.90±0.71)%。而脂质体Lip2000的转染效率均相对较低,对MIGl为(5.20±0.42)%,对MIG2为(9.75±0.07)%,对PDDR1为(22.4±0.28)%。CaCl2在同一转染体系下对不同质粒转染效果不同。结论对于制备CAR—T细胞的病毒包装,Transintro EL试剂能够稳定获得较高的转染效率。 展开更多
关键词 病毒包装 转染试剂 293T细胞
在线阅读 免费下载
成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9敲除Ku80基因提高HEK293T细胞对阿霉素的敏感性
6
作者 赖永平 曾金华 +2 位作者 谭雄红 柯坤 赵必星 《中华实验外科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第8期1437-1440,共4页
目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术将293T细胞中的Ku80基因敲除,建立Ku80敲除的293T细胞株,并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先,设计识别针对靶位点... 目的利用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术将293T细胞中的Ku80基因敲除,建立Ku80敲除的293T细胞株,并验证Ku80缺失对DNA损伤修复的影响以及对293T细胞阿霉素耐药性的影响。方法首先,设计识别针对靶位点的1对DNA Oligos,利用pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)质粒构建表达导向RNA(sgRNA)载体。载体转染293T细胞。通过定点聚合酶链式反应(PCR)和T7E1内切酶酶切鉴定,确认所设计的sgRNA的有效性。进一步通过细胞有限稀释法和嘌呤霉素筛选,挑选单细胞克隆进行Western blot检测筛选出稳定敲除Ku80基因的293T细胞株。最后通过定点测序确认Ku80编码基因是否发生突变。使用阿霉素处理诱导DNA损伤,以磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)为指标检测DNA损伤,同时用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测Ku80敲除的293T细胞对阿霉素的药物敏感性。结果成功构建Ku80基因敲除的293T细胞,用阿霉素处理诱导DNA损伤并经过修复之后,对照组和Ku80敲除组γ-H2AX染色的阳性率分别为(30.67±2.49)%和(88.00±1.63)%(P=0.000),表明Ku80敲除的293T细胞的DNA损伤修复功能显著受到抑制。同时Ku80敲除显著提高293T细胞对阿霉素的敏感性,阿霉素对Ku80敲除组细胞和对照组细胞的生长抑制率分别为(53.99±1.29)%和(32.42±1.20)%(P=0.000)。结论293T细胞中敲除Ku80抑制了DNA损伤的修复和提高了细胞对阿霉素的敏感性。 展开更多
关键词 成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术 293T细胞 Ku80基因 阿霉素
lncRNA HIT对骨肉瘤组织和细胞U2OS顺铂抵抗的影响及其机制
7
作者 康宇翔 任志鹏 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CSCD 北大核心 2018年第12期1296-1302,共7页
目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HIT与骨肉瘤细胞顺铂(cisplatin,DDP)抵抗的关系及其上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的相关机制。方法:选择天津医院骨科2017年6月至2018年6月42例骨肉瘤组... 目的:探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HIT与骨肉瘤细胞顺铂(cisplatin,DDP)抵抗的关系及其上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的相关机制。方法:选择天津医院骨科2017年6月至2018年6月42例骨肉瘤组织及相应癌旁组织(距癌变边缘>5cm)标本,采用qRT-qPCR检测骨肉瘤组织及相应癌旁组织中HIT及EMT标志物Snail、E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA的表达水平。构建DDP抵抗的人骨肉瘤U2OS细胞株及人肾上腺293T细胞株作为抵抗组及对照组,采用慢病毒转染两组表达靶向HIT的siRNA载体于抵抗组细胞中作为干扰A组及B组,同时转染HIT过表达载体及空白载体构建HIT过表达的U2OS细胞株及空白U2OS细胞株分别作为过表达组及空白组。MTT实验检测各组细胞DDP半抑制浓度(IC50),qRT-PCR实验检测各组细胞中HIT、Snail及E-cadherinmRNA的表达水平,Western blotting检测各组细胞Snail及Ecadherin的表达水平,RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-IP)实验检测U2OS及293T细胞中HIT与Snail蛋白分子的结合情况。结果:骨肉瘤组织中HIT及SnailmRNA表达显著高于癌旁组织、E-cadherin mRNA表达显著低于癌旁组织,且骨肉瘤组织中HIT与E-cadherin mRNA表达呈显著负相关(均P<0.01);抵抗组细胞DDPIC50显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组DDPIC50显著高于空白组(均P<0.01);抵抗组细胞HIT表达显著高于对照组,干扰A组及B组细胞HIT表达显著低于抵抗组及对照组,过表达组HIT表达显著高于空白组(均P<0.05或P<0.01);抵抗组细胞Snail、E-cadherin mRNA表达水平显著高于或低于对照组、干扰A组及干扰B组,过表达组E-cadherin mRNA显著低于空白组;抵抗组细胞Snail蛋白表达水平显著高于对照组、干扰A组及B组细胞,E-cadherin蛋白表达水平则显著低于对照组、干扰A组及B组细胞,过表达组Snail蛋白表达水平显著高于空白组(P<0.05或P<0.01);在U2OS及293T细胞中,免疫磁珠介导Anti-snail抗� 展开更多
关键词 骨肉瘤 U2OS细胞 293T细胞 长链非编码RNAHIT 顺铂抵抗 上皮间充质转化
TREM2基因过表达慢病毒载体的构建及其表达的研究 预览
8
作者 冉江霞 石胜良 王成志 《广西医科大学学报》 CAS 2018年第4期436-440,共5页
目的:构建小鼠编码2型髓样细胞触发受体(TREM2)基因过表达慢病毒载体,并且对其体外表达目的基因的水平进行检测。方法:采用PCR扩增TREM2基因片段,将扩增产物连接至经AgeI酶切后的线性化GV358载体;经PCR方法鉴定及DNA测序比对分析后,将... 目的:构建小鼠编码2型髓样细胞触发受体(TREM2)基因过表达慢病毒载体,并且对其体外表达目的基因的水平进行检测。方法:采用PCR扩增TREM2基因片段,将扩增产物连接至经AgeI酶切后的线性化GV358载体;经PCR方法鉴定及DNA测序比对分析后,将其和包装质粒共转染至293T细胞并用药筛法行滴度测定。然后用重组慢病毒感染293T细胞,观察GFP表达并用实时定量PCR检测TREM2的表达水平。结果:通过PCR成功获得TREM2基因片段并连接到GV358病毒载体上,通过PCR及DNA测序鉴定均证实TREM2-GV358携带有正确的TREM2基因;在293T细胞中包装获得病毒并用药筛法测定病毒滴度为2.0×10 8 TU/mL。感染293T细胞后可观察到大量明显的荧光细胞;实时定量PCR检测结果显示,TREM2过表达慢病毒感染293T细胞后TREM2的表达水平明显增加(P<0.05)。结论:成功构建TREM2-GV358慢病毒载体,为TREM2基因的后期研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 TREM2 慢病毒 载体构建 过表达 293T细胞
在线阅读 免费下载
人NSD2基因特异性shRNA慢病毒载体构建及沉默效果评价 预览
9
作者 王红红 潘云 李艳 《现代养生》 2018年第8期38-40,共3页
目的:构建针对人NSD2基因的shRNA慢病毒载体,并观察其在人肾293T细胞中沉默效果,从而为进一步研究NSD2基因在其他肿瘤细胞系中的表达及影响奠定基础。方法:以NSD2基因为靶标,设计并合成2条互补寡核苷酸序列(NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-... 目的:构建针对人NSD2基因的shRNA慢病毒载体,并观察其在人肾293T细胞中沉默效果,从而为进一步研究NSD2基因在其他肿瘤细胞系中的表达及影响奠定基础。方法:以NSD2基因为靶标,设计并合成2条互补寡核苷酸序列(NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2)克隆至PLKO-puro重组慢病毒载体中,形成新的重组慢病毒载体PLKO-NSD2-puro。然后与包装质粒PMDL、PV5VG、PREV在293T细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒,并进一步感染293T细胞,通过提取蛋白进行Western Blot检测NSD2基因沉默效果。结果:通过PCR鉴定和DNA测序鉴定证明NSD2 shRNA-1,NSD2 shRNA-2重组shRNA慢病毒表达质粒中插入了目的 DNA片段。且通过Western Blot检测NSD2基因沉默效果,证明了NSD2 shRNA构建效果不错,可以进一步运用于与NSD2相关的肿瘤细胞细胞系中。结论:成功构建了人的NSD2基因shRNA真核表达的慢病毒载体,为进一步应用于其他与NSD2相关的癌细胞系,针对NSD2基因的肿瘤治疗研究奠定基础。 展开更多
关键词 NSD2 SHRNA 慢病毒 载体构建 293T细胞
在线阅读 下载PDF
潜伏膜蛋白2A嵌合抗原受体-T细胞的制备及对鼻咽癌细胞杀伤作用的研究
10
作者 陈渊 陈仁杰 +7 位作者 黄骁辰 汤根兄 蒯兴旺 章明炯 张大为 唐奇 朱进 冯振卿 《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第12期925-930,共6页
目的制备靶向潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein2A,LMP2A)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞,观察LMP2ACAR-T细胞体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法2016年9月至2017年12月,本研究以基因工程技术构建抗LMP2A慢... 目的制备靶向潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein2A,LMP2A)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞,观察LMP2ACAR-T细胞体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用。方法2016年9月至2017年12月,本研究以基因工程技术构建抗LMP2A慢病毒表达载体,测序鉴定并通过Western blot法验证抗LMP2ACAR在293T细胞中的表达;通过质粒包装体系制备LMP2ACAR慢病毒,并感染人T细胞,制备LMP2ACAR-T细胞;CCK-8法检测LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测LMP2A抗原激活后的LMP2ACAR-T细胞白细胞介素(IL)-2与干扰素(IFN)-γ的分泌水平。体内实验观察LMP2ACAR-T细胞对鼻咽癌移植瘤的抑瘤作用。SPSS21.0统计学软件用于统计分析。结果PCR结果显示抗LMP2ACAR片段大小约为1500bp,与理论值相一致,测序显示序列正确;Westernblot结果显示抗LMP2A慢病毒表达载体能在293T细胞中表达;CCK-8法结果发现在效靶比为20∶1、10∶1与5∶1时,LMP2ACAR-T细胞对LV-LMP2A-CNE1细胞的杀伤率分别为(72.11±9.75)%、(54.65±5.42)%与(36.68±3.80)%,与CD19CAR-T细胞、T细胞相比差异有统计学意义(P<0.05),而对CNE1细胞的杀伤作用与CD19CAR-T细胞和T细胞相比差异无统计学意义;ELISA法结果发现LMP2ACAR-T细胞与LV-LMP2A-CNE1细胞共培养上清中IL-2与IFN-γ的含量,显著高于与CNE1细胞共培养上清,差异具有统计学意义(P<0.05);体内实验中LMP2ACAR-T细胞组瘤体体积为(80.3±10.0)mm3,显著小于各对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功制备的LMP2ACAR-T细胞对LMP2A阳性的鼻咽癌细胞具有显著靶向杀伤效应。 展开更多
关键词 293T细胞 细胞杀伤作用 潜伏膜蛋白2A 鼻咽癌细胞 抗原受体 制备 WESTERNBLOT 嵌合
耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达
11
作者 何淑雅 杨奇 +5 位作者 王茹静 肖方竹 王五洲 唐艳 蒋雨薇 马云 《国际放射医学核医学杂志》 2017年第2期103-107,共5页
目的 扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C 1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础.方法 以无任何突变的pGEX-6p-1-pp r... 目的 扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C 1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础.方法 以无任何突变的pGEX-6p-1-pp rM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoRI、BamHI双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素(Kan)抗性的Luria-Bertani(LB)固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR I、BamHI双酶切及测序鉴定.通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达.裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达.结果 菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功.荧光拍照结果显示,pEGFP-C 1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×10^3处有融合蛋白表达.结论 笔者成功将所构pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础. 展开更多
关键词 耐辐射奇球菌 辐射 pprM基因 293T细胞
enJSRV囊膜蛋白激活绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号通路的研究 被引量:2
12
作者 冷冉 刘淑英 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第8期1043-1050,共8页
为初步探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(en JSRV)囊膜蛋白(Env)在绵羊绒毛膜滋养层细胞中的作用机制,利用免疫组织化学染色法检测enJSRV-Env在绵羊胎盘中的主要表达区域,继而瞬时转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env到绵羊绒毛膜滋养层细胞... 为初步探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(en JSRV)囊膜蛋白(Env)在绵羊绒毛膜滋养层细胞中的作用机制,利用免疫组织化学染色法检测enJSRV-Env在绵羊胎盘中的主要表达区域,继而瞬时转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env到绵羊绒毛膜滋养层细胞,并加入Erk抑制因子PD 98059、p38抑制因子SB 203580及JN K抑制因子SP600125,同时转染重组质粒至293T细胞中作为对比。利用W estern-blot分别检测2种细胞中Erk1/2、p38和JNK蛋白激酶磷酸化水平的变化。免疫组织化学染色结果显示,enJSRV-Env主要表达于绵羊胎盘中绒毛膜滋养层细胞。Western-blot结果显示,绵羊绒毛膜滋养层细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env组中p-Erk1/2、p-p38和p-JNK的表达量均显著高于对照组和加入抑制因子组(P〈0.05);加入3种抑制因子后,3种蛋白激酶的磷酸化水平较转染组显著降低。293T细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRVenv组中p-p38的表达量显著高于对照组(P〈0.05),p-JNK的表达量极显著高于对照组(P〈0.01)。因此,enJSRV-Env激活了绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号转导通路。再通过与293T细胞的结果对比可知,enJSRV-Env在这2种细胞中的作用机制有所不同。本研究为今后继续深入探究en JSRV-Env的作用机制提供了新的思路和依据。 展开更多
关键词 内源性绵羊肺腺瘤病毒 囊膜蛋白 MAPK信号转导通路 293T细胞 绵羊绒毛膜滋养层细胞
大鼠AEG-1慢病毒表达载体构建及病毒包装 预览
13
作者 刘昆梅 张春 郭乐 《宁夏医科大学学报》 2017年第7期740-743,755,F0004共6页
目的利用分子克隆技术构建大鼠AEG-1慢病毒表达载体并进行慢病毒包装。方法设计合成全长大鼠AEG-1基因序列(R-AEG-1),在克隆质粒GV367的基础上构建AEG-1基因慢病毒表达载体(R-AEG-1-GV367),测序鉴定构建成功。R-AEG-1-GV367与包装... 目的利用分子克隆技术构建大鼠AEG-1慢病毒表达载体并进行慢病毒包装。方法设计合成全长大鼠AEG-1基因序列(R-AEG-1),在克隆质粒GV367的基础上构建AEG-1基因慢病毒表达载体(R-AEG-1-GV367),测序鉴定构建成功。R-AEG-1-GV367与包装质粒转染293T细胞进行慢病毒包装。结果成功构建大鼠AEG-1慢病毒表达载体并成功包装出高效感染率的慢病毒颗粒,测定病毒滴度为2E+8TU·m^-1。结论 AEG-1慢病毒表达载体的构建及病毒颗粒包装为后续AEG-1过表达在神经细胞行为学和分子生物学的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 星形胶质细胞上调基因-1 慢病毒载体 293T细胞
在线阅读 下载PDF
小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定 被引量:2
14
作者 徐渴 王欣 +1 位作者 曾强 王凤山 《环境与健康杂志》 北大核心 2017年第11期965-968,F0003共5页
目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载... 目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量。结果构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65×10^8 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达。结论成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础。 展开更多
关键词 miR-29c 慢病毒 载体构建 MLE-12细胞 293T细胞
小鼠Prohibitin真核表达质粒的构建及在293T细胞中的表达
15
作者 杨晨 高柳 +1 位作者 冯怡博 吴迪 《解剖科学进展》 2017年第3期266-268,272共4页
目的构建小鼠Prohibitin基因真核表达质粒,在293T细胞中进行表达鉴定,为研究小鼠Prohibitin基因功能奠定基础。方法以小鼠Prohibitin基因cDNA序列为模板,设计特定引物,应用PCR的方法扩增其编码序列全长,并将其克隆到真核表达载体pEFP-C2... 目的构建小鼠Prohibitin基因真核表达质粒,在293T细胞中进行表达鉴定,为研究小鼠Prohibitin基因功能奠定基础。方法以小鼠Prohibitin基因cDNA序列为模板,设计特定引物,应用PCR的方法扩增其编码序列全长,并将其克隆到真核表达载体pEFP-C2中,将获得的重组表达质粒转染293T细胞,应用RTPCR、Western blot方法检测其表达。结果成功构建了pEGFP-Prohibitin真核表达质粒,将其成功转染293T细胞,pEGFP-Prohibitin转染组Prohibitin蛋白和mRNA在293T细胞的表达量比转染空载转染组明显增加。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-Prohibitin,并在真核细胞表达良好,为研究小鼠Prohibitin的基因功能奠定了基础。 展开更多
关键词 PROHIBITIN 重组质粒 转染 小鼠 293T细胞
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测 预览 被引量:1
16
作者 徐岚 肖斌 +2 位作者 陈慧芹 李晓荣 郝文波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期75-81,共7页
旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、W... 旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况,间接免疫荧光进行蛋白定位,通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白,hispulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示,经双酶切及测序鉴定,真核表达载体p ENTER-Csk-his正确没有突变,SDSPAGE及Western blot均可检测到大小约为51 k D的目的蛋白,说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功,间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达,通过磁珠纯化得到Csk蛋白,最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用,说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列,并构建重组p ENTER-Csk-his真核表达质粒,在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。 展开更多
关键词 Csk基因 293T细胞 真核表达 纯化 活性鉴定
在线阅读 免费下载
生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定
17
作者 邹红春 谭桂湘 谭拥军 《生命科学研究》 CAS CSCD 2016年第1期16-20,共5页
建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir ... 建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。 展开更多
关键词 生物素化FOXM1 BirA生物素连接酶 HEK 293T细胞 亲和纯化 蛋白印迹
非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达
18
作者 庄斯慧 郭欣欣 +2 位作者 梁君瑜 吴英松 刘天才 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期18-22,共5页
[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载... [目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 非受体型酪氨酸激酶 JAK1基因 293T细胞 真核表达
人miR-17-92基因簇载体构建及其在293T细胞中的表达验证 预览
19
作者 吴中强 陈红苗 +2 位作者 毛秀丽 席尧 许鹏 《生物技术通讯》 CAS 2016年第6期773-777,共5页
目的:研究人miR-17-92基因簇在肾癌等疾病发生过程中的功能。方法:采用基因重组技术,将miR-17-92基因簇亚克隆至pc DNA4真核细胞表达载体,构建miR-17-92基因簇真核表达载体;通过脂质体转染的方法将miR-17-92的过表达质粒和对照质粒分... 目的:研究人miR-17-92基因簇在肾癌等疾病发生过程中的功能。方法:采用基因重组技术,将miR-17-92基因簇亚克隆至pc DNA4真核细胞表达载体,构建miR-17-92基因簇真核表达载体;通过脂质体转染的方法将miR-17-92的过表达质粒和对照质粒分别转染293T细胞,并用实时定量PCR技术验证转染24和48 h后细胞内pri-miR-17-92和miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b1、miR-20a、miR-92a1等分子的相对过表达比例。结果:miR-17-92基因簇真核表达载体构建成功,并在293T细胞中实现了显著性过表达效果。结论:为进一步研究人miR-17-92基因簇在肾脏发育过程中的功能及其与肾脏癌症发病相关性的研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 miR-17-92基因簇 293T细胞 表达
在线阅读 免费下载
慢病毒包装体系的建立与体外表达 预览
20
作者 王雪晗 贾俊龙 +4 位作者 王维 朱玉博 许诺 白文林 罗光彬 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期432-437,共6页
为筛选出最佳的慢病毒转染处理时间,研究三质粒对慢病毒包装的最佳浓度配比,以及对293T 细胞的细胞转染率和滴度,通过脂质体与Fugw 质粒混合后转染293T 细胞,观察293T 细胞的形态和荧光表达量.结果表明:转染6h 组的细胞形态略好于8h;转... 为筛选出最佳的慢病毒转染处理时间,研究三质粒对慢病毒包装的最佳浓度配比,以及对293T 细胞的细胞转染率和滴度,通过脂质体与Fugw 质粒混合后转染293T 细胞,观察293T 细胞的形态和荧光表达量.结果表明:转染6h 组的细胞形态略好于8h;转染8h 组和6h 组的转染率均极显著高于10h 组(p〈0.01),但彼此间差异不显著(p〉0.05);质粒配比为4:3:2 时,慢病毒滴度最高,达3.795×10^7 TU.mL^-1,经离心后滴度与离心之前相比能提高100 倍.不同浓度的质粒配比对293T 细胞转染率和滴度方面,B组(432)的转染率最高、C组(321)最低、A组(5:4:3)介于二者之间,3 组间彼此差异极显著(p〈0.01);转染后B 组的滴度极显著高于A组和C 组(p〈0.01),而A 组和C 组间差异不显著(p〉0.05).感染293T 靶细胞存在EGFP基因表达.利用10μL脂质体2000 介导4μg 的Fugw 质粒转染293T 细胞的最佳时间为6h;当Fugw:△8.2:Vsvg 为:43:2 时,慢病毒转染293T 细胞的效果最好. 展开更多
关键词 慢病毒 转染 293T细胞 滴度
在线阅读 下载PDF
上一页 1 2 11 下一页 到第
使用帮助 返回顶部 意见反馈