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五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植的术前检测 预览
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作者 白鸽 李霄 +3 位作者 张虹 黄敏 陶开山 窦科峰 《实用器官移植电子杂志》 2018年第5期355-358,共4页
目的本研究为了减少五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植手术的超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)和急性排斥反应(acute rejection,AR)发生率,进行全面术前检测。方法分别利用PCR技术和植物凝集素细胞染色对供体GGTAl基因敲... 目的本研究为了减少五指山小型猪-藏酋猴异种肝移植手术的超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)和急性排斥反应(acute rejection,AR)发生率,进行全面术前检测。方法分别利用PCR技术和植物凝集素细胞染色对供体GGTAl基因敲除类型进行鉴定;30只藏酋猴分别与五指山小型猪进行淋巴细胞毒实验;供受体ABO血型鉴定。结果供体为GGTA1基因敲除猪,GTKO猪外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)植物凝集素细胞染色未检测出荧光,表明GGTA1基因敲除成功,与基因型鉴定结果一致。通过淋巴细胞毒实验选定28#与供体PBMC毒性最小的藏酋猴做为备选受体。血型鉴定显示供受体血型一致。结论通过对GTKO五指山小型猪一藏酋猴异种肝移植的术前检测选定合适的受体,可有效减少异种移植HAR和AR的发生率。 展开更多
关键词 异种肝移植 α-1 3-半乳糖转移酶 五指山小型猪 藏酋猴 淋巴细胞毒实验
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前沿 预览
2
《中国农村科技》 2016年第5期12-13,共2页
<正>科幻成真:NASA试图火星种土豆新浪科技讯在电影《火星救援》中,主角马克·沃特尼用火星土壤成功种出了土豆。而这种太空菜园或许并没有看上去那么遥不可及。近日,据外媒报道,秘鲁的研究人员正在首都利马尝试模拟火星上的... <正>科幻成真:NASA试图火星种土豆新浪科技讯在电影《火星救援》中,主角马克·沃特尼用火星土壤成功种出了土豆。而这种太空菜园或许并没有看上去那么遥不可及。近日,据外媒报道,秘鲁的研究人员正在首都利马尝试模拟火星上的环境,并试图在其中种植土豆。NASA将与利马国际马铃薯研究中心(CIP)合作,共同开展这项具有开创意义的实验。他们计划种植的65种土豆都经过了精挑细选,能够在火星那样的极端环境中生长。 展开更多
关键词 马铃薯研究 新浪科技 首都利马 极端环境 沃特 开创意义 成真 黄酮醇 半乳糖转移酶 家畜品种
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PCR法构建小鼠α-1,3-GT基因沉默载体研究 预览
3
作者 刘中华 谷习文 +3 位作者 郑新民 魏庆信 赵献军 肖红卫 《湖北农业科学》 北大核心 2007年第2期 187-189,共3页
在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列.针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM—T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进... 在已报道的shRNA序列前加上人类H1启动子,设计一段沉默小鼠α-1,3-GT基因的siRNA序列.针对该序列分段设计引物,完全采用PCR法将其连接起来,然后把该序列克隆到pGEM—T载体中,构建出针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础。 展开更多
关键词 小干扰RNA 基因沉默 α-1 3-半乳糖转移酶
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反义RNA对猪α—1,3—半乳糖苷转移酶活性的影响 预览 被引量:1
4
作者 林丛 许克锋 +2 位作者 张文秀 侯宽永 毛泽斌 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期 515-518,共4页
α-1,3-半乳糖表位是猪-人异种移植超急性排斥反应的主要抗原,由α-1,3-半乳糖苷转移酶催化合成.用RT-PCR方法扩增中国实验用小型猪α-1,3-半乳糖苷转移酶cDNA的前582 bp,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN,将其转染入猪主动脉内... α-1,3-半乳糖表位是猪-人异种移植超急性排斥反应的主要抗原,由α-1,3-半乳糖苷转移酶催化合成.用RT-PCR方法扩增中国实验用小型猪α-1,3-半乳糖苷转移酶cDNA的前582 bp,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN,将其转染入猪主动脉内皮细胞.Northern Blotting表明α-1,3-半乳糖苷转移酶mRNA减少.检测α-1,3-半乳糖苷转移酶活性表明,反义RNA可使其活性下降32.2%.研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪-人异种移植超急性排斥反应. 展开更多
关键词 α-1 3-半乳糖转移酶 反义RNA 异种移植 排斥反应 抑制 器官移植
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β—1,4—半乳糖苷转移酶生物学功能的研究进展
5
作者 范玉新 张琪 《国外医学:分子生物学分册》 CSCD 1999年第1期 45-49,共5页
β1,4-半乳糖苷转移酶是糖基转移酶的家族成员之一,近年来随着编码该家族成员基因的分离与克隆,进一步探求其重要生物学功能已成为国际酶学界的研究热点,目前的研究结果表明该酶具有与受精过程,神经元细胞迁移,癌细胞转移,表... β1,4-半乳糖苷转移酶是糖基转移酶的家族成员之一,近年来随着编码该家族成员基因的分离与克隆,进一步探求其重要生物学功能已成为国际酶学界的研究热点,目前的研究结果表明该酶具有与受精过程,神经元细胞迁移,癌细胞转移,表皮细胞增殖及自体免疫性疾病等相关的重要生物学功能。 展开更多
关键词 半乳糖转移酶 生物学功能 研究进展
GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马小型猪PFFs细胞系的建立 预览
6
作者 厉小雪 李楚 +3 位作者 任雪洋 王盈 杨海元 戴一凡 《实用器官移植电子杂志》 2019年第4期277-282,共6页
目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransfera... 目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)α-1,3-半乳糖基转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶(β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2)双基因敲除细胞系,为构建α-1,3-半乳糖(α-1,3-galactose,α-Gal)和SD(a)抗原缺失的巴马小型猪模型奠定基础。方法分别选取猪GGTA1基因的第三外显子和β4GalNT2基因的第八外显子为敲除靶点,利用在线工具(http://crispr.mit.edu)设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以含有Cas9基因的pX330质粒为骨架构建打靶载体,转染野生巴马小型猪的PFFs,用T7EN1酶切验证打靶载体敲除效率。将打靶载体与G418抗性质粒(tdTomato)共转染巴马小型猪PFFs,经药物筛选获得阳性单细胞克隆后测序鉴定基因型。结果成功构建靶向GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染PFFs后用药物筛选得到31个单克隆细胞系,其中5个为GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的细胞系。结论Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFFs的GGTA1/β4GalNT2基因并获得了双基因敲除的单细胞克隆,为构建GGTA1/β4GalNT2敲除的巴马小型猪提供必需的实验材料。 展开更多
关键词 巴马小型猪 CRISPR/Cas9 猪胚胎成纤维细胞 α-1 3-半乳糖转移酶/β-1 4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶基因
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异种心脏移植的研究进展 预览
7
作者 江行配 田海 +3 位作者 孙露 郭睿霖 刘开宇 蒋树林 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期599-602,共4页
心脏移植是治疗终末期心脏病的一种有效方法,但由于供体的缺乏使其开展受到限制。近年来异种心脏移植(CXTx)的研究取得了显著的进展,为心脏移植供体短缺提供了一个可行的方案。但由于存在跨物种免疫排斥反应、移植术后无法长期维持心脏... 心脏移植是治疗终末期心脏病的一种有效方法,但由于供体的缺乏使其开展受到限制。近年来异种心脏移植(CXTx)的研究取得了显著的进展,为心脏移植供体短缺提供了一个可行的方案。但由于存在跨物种免疫排斥反应、移植术后无法长期维持心脏生理功能及移植物状态监测欠佳等问题,CXTx仍面临着许多挑战。本文就CXTx在免疫排斥反应、移植方法、异种移植物状态监测等方面的研究进展做一综述并讨论CXTx的临床应用前景及面临的挑战。 展开更多
关键词 异种心脏移植 免疫排斥反应 基因修饰 免疫调节 移植方法 生物标志物 α-1 3-半乳糖转移酶基因敲除猪
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流式细胞术检测供体猪α-1,3-Gal和人源CD46的表达 预览
8
作者 杜敏杰 魏静 +1 位作者 臧荣鑫 潘登科 《实用器官移植电子杂志》 2018年第5期375-379,共5页
目的检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46(hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集500μl野生型(wild type,WT)、α—1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、hCD46和GTK... 目的检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46(hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集500μl野生型(wild type,WT)、α—1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、hCD46和GTKO/hCD46巴马小型猪血液,分离外周血单核细胞(peripheral blood inononuclear cell,PBMCo异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(FITC—GSIB4)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测α-Gal抗原敲除情况,异硫氰酸荧光素标记的hCD46膜辅蛋白抗体(anti—CD46-FITC)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测hCD46蛋白表达情况。结果GTKO和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面α—Gal检测呈阴性,WT和hCD46巴马猪检测呈阳性,与测序结果一致;hCD46和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面hCD46蛋白检测呈阳性,WT和GTKO巴马猪检测呈阴性,与PCR鉴定结果一致。结论建立了微量血液流式细胞术直观检测供体猪α-Gal抗原和人源CD46蛋白表达的方法。 展开更多
关键词 α-1 3-半乳糖转移酶 人源蛋白CD46 外周血单核细胞 流式细胞术
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五指山小型猪近交系异种移植产业化研发进展 预览
9
作者 冯书堂 戴一凡 +1 位作者 章金刚 潘志强 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期469-473,共5页
为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-... 为了早日实现五指山小型猪(WZSP)近交系异种移植产业化目标,努力推进近交繁育获得近交系,同时开展克服异种移植免疫排斥和猪内源性逆转录病毒(PERV)传染生物安全性两大难题的研发内容。本文从WZSP近交系双基因敲除克隆猪繁育成功、猪-猴异种角膜内皮移植取得突破性进展、WZSP近交系PERV无传染性群体建立、WZSP近交系是理想的动物模型和异种移植供体等方面,介绍WZSP近交系异种移植产业化的研发进展。 展开更多
关键词 五指山小型猪 近交系猪 异种移植 免疫排斥反应 α-1 3-半乳糖转移酶基因敲除(αGTKO) 猪内源性逆转录病毒(PERV) 非α-1 3-半乳糖(Gal)抗原 CRISPR/Cas9基因编辑技术
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一种新的非Gal异种移植抗原——FAM234A的鉴定 预览
10
作者 谢崇伟 戴文杰 +2 位作者 张军方 蔡志明 牟丽莎 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期354-359,共6页
目的 探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法 用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的... 目的 探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法 用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原。采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量。利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原。结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体。在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少。结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原。 展开更多
关键词 异种移植 非Gal抗原 主动脉内皮细胞(PAEC) FAM234A 食蟹猴 α-1 3-半乳糖转移酶基因敲除(GTKO) 流式细胞术 短发夹核糖核酸(shRNA) 基因敲减 巴马小型猪 五指山小型猪 慢病毒
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异种肝移植术后组织因子激活介导受体凝血功能障碍的机制 预览
11
作者 吴恩昊 李霄 陶开山 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期174-180,共7页
目的探讨异种肝移植术后导致受体凝血功能障碍的组织因子(TF)激活机制。方法实施3例α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪-藏酋猴异种脾窝异位辅助性肝移植术。观察受体术后凝血功能变化情况。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PC... 目的探讨异种肝移植术后导致受体凝血功能障碍的组织因子(TF)激活机制。方法实施3例α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪-藏酋猴异种脾窝异位辅助性肝移植术。观察受体术后凝血功能变化情况。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学染色检测移植术前及术后不同时间点受体原肝和移植肝组织的猴TF及猪TF信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达情况。检测正常对照猴、移植术前受体猴及移植术后2 h受体猴的外周血单核细胞(PBMC)的复钙时间以评价受体凝血状态。结果 3例受体在术后均出现了不同程度的凝血功能障碍,表现为纤维蛋白原水平降低、血小板计数减少。猴TF蛋白在术后受体原肝中呈阳性表达,在术前及术后的移植肝中呈阴性表达;而猪TF蛋白在原肝和移植肝中始终为阴性表达。术后2 h,猴TF mRNA在原肝中较术前上调(2.10±0.24)倍,而猪TF在移植肝中较术前上调(1.42±0.15)倍,两者比较差异有统计学意义(P=0.014)。与正常对照猴PBMC和移植术前受体猴PBMC比较,术后2 h受体猴PBMC复钙时间明显缩短,差异均有统计学意义(均为P〈0.001)。结论在异种肝移植术后凝血功能障碍发生时,受体原肝TF激活程度显著高于移植肝TF。受体原肝TF激活是导致异种肝移植术后凝血功能障碍的主要原因。 展开更多
关键词 异种移植 肝移植 辅助性肝移植 α-1 3-半乳糖转移酶基因敲除小型猪 藏酋猴 凝血功能障碍 组织因子 复钙时间
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敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因五指山小型猪的繁育和鉴定 预览 被引量:2
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作者 龙川 高景波 +5 位作者 唐雨婷 杜敏杰 石宁宁 冯冲 鲁琳 潘登科 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期121-126,共6页
目的 总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流... 目的 总结α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定。方法统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GGTA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流式细胞术对人、野生型五指山小型猪、GTKO五指山小型猪外周血单核细胞(PBMC)的α-1,3-半乳糖(αGal)表型进行检测;比较GTKO五指山小型猪与野生型五指山小型猪血常规指标的差异。结果 GGTA1基因型的遗传符合孟德尔定律;GGTA1-/-猪的PBMC流式检测无荧光表达,与基因型鉴定结果一致;GTKO五指山小型猪雌性猪初产窝产仔数为(6.8±1.8)只,经产窝产仔数为(8.3±2.2)只;血常规检测的各项指标与野生型五指山小型猪差异均无统计学意义(均为P〉0.05)。结论 连续2代GTKO五指山小型猪遗传稳定,繁殖力正常。GTKO五指山小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体。 展开更多
关键词 α-1 3-半乳糖转移酶 基因敲除 五指山小型猪 繁殖性能 α-1 3-半乳糖表型 外周血单核细胞
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人血清中非Gal异种抗体检测方法的探讨 预览 被引量:2
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作者 叶学军 卢希彬 +3 位作者 潘登科 蔡志明 牟丽莎 赵成江 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期132-137,共6页
目的 探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的最佳检测条件。方法选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8%、16.7%、100%)和孵育时间... 目的 探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的最佳检测条件。方法选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8%、16.7%、100%)和孵育时间(0.5、1.0、2.0、3.0、6.0 h)条件下,利用流式细胞仪检测GTKO猪的PBMC上结合IgM和IgG的水平。结果 在16.7%血清浓度下,孵育时间从0.5 h延长至3.0 h,能显著提高非Gal IgM结合PBMC的水平(P〈0.01),而IgG水平的提高则差异无统计学意义(P〉0.05)。提高血清浓度也可提高非Gal IgM的结合水平,采用100%的血清浓度孵育3 h,IgM结合PBMC水平最高且有统计学意义(P〈0.01)。采用100%的血清孵育6 h,IgG结合水平升高有统计学意义(P〈0.05)。延长孵育时间和提高血清浓度不会影响PBMC的活力。结论检测人血清中抗非Gal异种抗原抗体的最佳条件为每1×105个猪PBMC,采用100%人血清浓度孵育3 h检测IgM水平,或加100%人血清浓度孵育6 h检测IgG水平。这一条件的优化有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。 展开更多
关键词 异种移植 外周血单核细胞 非Gal抗原 流式细胞术 IgM/IgG α-1 3-半乳糖转移酶 基因敲除 五指山小型猪
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异种肝移植的历史与发展 预览 被引量:5
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作者 陶开山 李霄 窦科峰 《器官移植》 CAS CSCD 2017年第2期85-88,共4页
异种移植是解决同种供体器官短缺的重要途径。以α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、非人灵长类动物为受体的心脏和肾移植,最长存活达945 d和136 d,但肝移植尚无长期存活报道。国内外研究表明,免疫排斥和凝血调节障碍... 异种移植是解决同种供体器官短缺的重要途径。以α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、非人灵长类动物为受体的心脏和肾移植,最长存活达945 d和136 d,但肝移植尚无长期存活报道。国内外研究表明,免疫排斥和凝血调节障碍仍是阻碍移植肝和受体长期存活的主要原因。本文总结异种肝移植的发展历程,分析目前存在的问题,为未来的临床异种移植研究提供参考。 展开更多
关键词 异种移植 肝脏 基因修饰 非人灵长类动物 α-1 3-半乳糖转移酶
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利用体细胞LOH突变制备α1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1)缺失的五指山小型猪 预览 被引量:2
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作者 王飞 冯冲 +8 位作者 龙川 岳成鹤 王宁 李西睿 曹随忠 李明洲 储明星 潘登科 帅素容 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期522-527,共6页
制备α1,3-半乳糖基转移酶(αl,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因缺失的五指山小型猪,为我国异种器官移植研究奠定基础。在已经获得的GGTA1单等位基因敲除(GGTA+/-)五指山小型猪基础上,建立GGTA1+/-猪耳成纤维细胞系。利用特... 制备α1,3-半乳糖基转移酶(αl,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因缺失的五指山小型猪,为我国异种器官移植研究奠定基础。在已经获得的GGTA1单等位基因敲除(GGTA+/-)五指山小型猪基础上,建立GGTA1+/-猪耳成纤维细胞系。利用特异性结合α1,3Gal的药物GSI-B4联合免疫磁珠筛选,成功分离出自发杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)的双等位基因敲除(GGTA1-/-)耳成纤维细胞。单细胞克隆培养与PCR鉴定后,以GGTA1-/-细胞为核供体,体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎并移植。先后将3 122枚重构胚移植到13头受体母猪,其中4头怀孕,产仔12头。采用PCR和Southern blotting进行GGTA1基因型检测,11头为GGTA1-/-猪;流式细胞术分析表明,GGTA1-/-仔猪耳成纤维细胞不表达α1,3Gal。获得能克服异种器官超急性排斥反应(HAR)的GGTA1-/-猪,不仅为异种器官供体的进一步基因修饰提供了平台,也为异种移植临床前研究提供了宝贵资源。 展开更多
关键词 Α1 3-半乳糖转移酶 自发杂合性缺失 异种器官移植 体细胞核移植 五指山小型猪
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中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达 被引量:2
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作者 刘美 朱圣明 +6 位作者 郑鸿 王宇 王竹 杨娅君 伍艳霞 曾养志 王艳萍 《四川大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期 145-150,共6页
目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织... 目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P〉0.05)。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。 展开更多
关键词 异种移植 中国近交系版纳微型猪 Α1 3-半乳糖转移酶 α-半乳糖
小鼠α1,3-半乳糖糖基化修饰对人肝癌HuH7细胞生物学特性的影响 预览
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作者 喻凤 喻召才 +4 位作者 刘文超 茹懿 杨静悦 申兴勇 刘新平 《现代肿瘤医学》 CAS 2011年第5期 832-836,共5页
目的:探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性。方法:将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试... 目的:探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性。方法:将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试验分析稳定表达株相关生物学特性变化。结果:转染有α1,3GT的HuH7经RT-PCR法检测到有α1,3GT的表达,免疫荧光镜检测其细胞表面有明显的Galα(1,3)Gal糖表位表达,转染细胞的增殖能力明显降低,同时促进细胞凋亡。结论:转染α1,3-半乳糖基转移酶基因可明显抑制人肝癌细胞HuH7的恶性生物学行为,具有潜在的临床应用价值。 展开更多
关键词 Α1 3-半乳糖转移酶 Galα(1 3)Gal 基因 肝癌
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利用正负筛选打靶载体在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因
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作者 常宏宇 宫锋 +5 位作者 季守平 鲍国强 李素波 章扬培 李芳 聂亚玲 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2010年第3期234-238,共5页
目的半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)表位是猪到人异种移植中引起排斥反应的主要异种抗原。通过同源重组敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因可从异种移植物表面彻底清除αGal表位。本研究的目的在于利用正负筛选打靶载体定向缺失猪GGTA1基因... 目的半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)表位是猪到人异种移植中引起排斥反应的主要异种抗原。通过同源重组敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因可从异种移植物表面彻底清除αGal表位。本研究的目的在于利用正负筛选打靶载体定向缺失猪GGTA1基因。方法构建猪α1,3-半乳糖基转移酶基因正负筛选打靶载体pSL/GT,载体包含了正负筛选标记基因neo和tk,打靶载体线性化后用脂质体包裹转染猪肾细胞系PK-15细胞,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,挑选抗性克隆进行PCR及Southern杂交鉴定。结果共得到436个抗性细胞克隆,其中31个克隆PCR结果阳性。经Southern杂交鉴定证实,其中1个克隆发生了同源重组,为杂合子。结论本研究构建了有效的猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体pSL/GT,并利用其在猪肾细胞系PK-15细胞中定向缺失GGTA1基因,获得了杂合子GGTA1(+/-)PK-15细胞。 展开更多
关键词 α-Gal表位 Α1 3-半乳糖转移酶 基因打靶 异种移植
中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其真核表达载体的构建 被引量:3
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作者 朱圣明 王艳萍 +5 位作者 郑鸿 程惊秋 陆燕蓉 曾养志 王字 王竹 《生物医学工程学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期360-365,共6页
克隆中国近交系版纳微型猪(Banna minipig inbred-line,BMI)α1,3-半乳糖基转移酶基因(α1,3-galacto-syltransferase α1,3-GT)并构建其真核表达载体。从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GT cDNA全长序列,克隆... 克隆中国近交系版纳微型猪(Banna minipig inbred-line,BMI)α1,3-半乳糖基转移酶基因(α1,3-galacto-syltransferase α1,3-GT)并构建其真核表达载体。从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GT cDNA全长序列,克隆到pMD18-T载体,测序后再克隆到质粒pEGFP-N1中,构建α1,3-GT真核表达载体pEGFP-N1-GT。用脂质体法瞬时转染人肺腺癌细胞A549,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GTmRNA的表达;利用荧光素标记的植物凝集素(FITC-BS-IB4 lectin),直接免疫荧光法检测转染细胞中α1,3-GT合成α-Gal表位的能力。结果显示版纳微型猪α1,3-GT DNA全长1116 bp,其序列与GenBank中小鼠和牛α1,3-GT cDNA具有高度同源性,与猪α1,3-GT DNA全长序列完全一致。酶切和PCR证实重组真核表达载体pEGFP-N1-GT构建成功。转染pEG-FP-N1-GT的A549细胞有α1,3-GTmRNA表达,在其细胞膜检测到α-Gal表位的表达。中国近交系版纳微型猪α1,3-GT cDNA的克隆及其真核表达载体的构建为该基因在异种器官移植和肿瘤免疫治疗中的进一步研究和应用奠定了基础。 展开更多
关键词 中国近交系版纳微型猪 Α1 3-半乳糖转移酶 异种移植
小鼠α1,3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定 预览 被引量:1
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作者 吕承育 谷雅川 +1 位作者 戚峰 朱理玮 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第31期 6089-6092,共4页
背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法。目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA于扰慢病毒载体,有效沉默小鼠... 背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法。目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA于扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007—05在天津医科大学总医院普外研究所完成。材料:慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所。方法:在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段。合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U62-shRNA/α1,3-半乳糖基转移酶。对干扰质粒做测序分析。用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒。用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度。主要观察指标:干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定。结果:小鼠α1.3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×10^8Tu/mL。结论:成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体。 展开更多
关键词 Α1 3-半乳糖转移酶 RNA干扰 质粒 慢病毒 小鼠
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