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Characteristics and advantages of adenoassociated virus vector-mediated gene therapy for neurodegenerative diseases 预览
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作者 Yuan Qu Yi Liu +2 位作者 Ahmed Fayyaz Noor Johnathan Tran Rui Li 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第6期931-938,共8页
Common neurodegenerative diseases of the central nervous system are characterized by progressive damage to the function of neurons,even leading to the permanent loss of function.Gene therapy via gene replacement or ge... Common neurodegenerative diseases of the central nervous system are characterized by progressive damage to the function of neurons,even leading to the permanent loss of function.Gene therapy via gene replacement or gene correction provides the potential for transformative therapies to delay or possibly stop further progression of the neurodegenerative disease in affected patients.Adeno-associated virus has been the vector of choice in recent clinical trials of therapies for neurodegenerative diseases due to its safety and efficiency in mediating gene transfer to the central nervous system.This review aims to discuss and summarize the progress and clinical applications of adeno-associated virus in neurodegenerative disease in central nervous system.Results from some clinical trials and successful cases of central neurodegenerative diseases deserve further study and exploration. 展开更多
关键词 nerve REGENERATION central nervous system gene therapy NEURODEGENERATIVE DISEASE viral vector ADENO-ASSOCIATED virus Alzheimer’s DISEASE Parkinson’s DISEASE Huntington’s DISEASE amyotrophic lateral SCLEROSIS spinal muscular atrophy neural REGENERATION
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S6B-4 Roles of the Basal Ganglia in Sleep-Wake Regulation 预览
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作者 HUANG Zhi-li 《神经药理学报》 2018年第4期97-98,共2页
The basal ganglia(BG)act as a cohesive functional unit that regulates motor function,habit formation,and reward/addictive behaviors.However,it is still not well understood how the BG maintains wakefulness and suppress... The basal ganglia(BG)act as a cohesive functional unit that regulates motor function,habit formation,and reward/addictive behaviors.However,it is still not well understood how the BG maintains wakefulness and suppresses sleep to achieve all these fundamental functions until genetically engineered systems developed these years.We focused on the adenosine A2A and dopamine D1 Receptors(R)in the BG and obtained following 4 findings:①Nucleus accumbens(NAc)dopamine D1R-expressing neurons are essential in controlling wakefulness and are involved in physiological arousal via the lateral hypothalamus and midbrain circuits;②The rostromedial tegmental nucleus(RMTg),also called the GABAergic tail of the ventral tegmental area,projects to the midbrain dopaminergic system and other regions.Our findings reveal an essential role of the RMTg in the promotion of non-rapid eye movement(non-REM,NREM)sleep and homeostatic regulation;③Opposite to the D1R in the NAc,A2AR made a prominent contribution to sleep control associated with motivation.④Striatal adenosine A2AR neurons control active-period sleep via parvalbumin neurons in external globus pallidus.Taken together,we proposed a plausible model in which the caudate-putamen and NAc integrate behavioral processes with sleep/wakefulness through adenosine and dopamine receptors.The impacts of the BG in physiological sleep and insomnia will be discussed. 展开更多
关键词 ADENO-ASSOCIATED virus OPTOGENETICS DREADD BASAL GANGLIA SLEEP-WAKE REGULATION
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Gene editing for corneal disease management 预览
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作者 Sudhanshu P Raikwar Apoorva S Raikwar +1 位作者 Shyam S Chaurasia Rajiv R Mohan 《世界转化医学杂志》 2016年第1期1-13,共13页
Gene editing has recently emerged as a promising technology to engineer genetic modifications precisely in the genome to achieve long-term relief from corneal disorders.Recent advances in the molecular biology leading... Gene editing has recently emerged as a promising technology to engineer genetic modifications precisely in the genome to achieve long-term relief from corneal disorders.Recent advances in the molecular biology leading to the development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)and CRISPR-associated systems,zinc finger nucleases and transcription activator like effector nucleases have ushered in a new era for high throughput in vitro and in vivo genome engineering.Genome editing can be successfully used to decipher complex molecular mechanisms underlying disease pathophysiology,develop innovative next generation gene therapy,stem cell-based regenerative therapy,and personalized medicine for corneal and other ocular diseases.In this review we describe latest developments in the field of genome editing,current challenges,and future prospects for the development of personalized genebased medicine for corneal diseases.The gene editing approach is expected to revolutionize current diagnostic and treatment practices for curing blindness. 展开更多
关键词 ADENO-ASSOCIATED virus Clustered Regularly-Interspaced SHORT Palindromic Repeats associated protein 9 Cornea Clustered regularly interspaced SHORT palindromic repeat Double strand breaks GENE EDITING sgRNA GENE targeting Homology directed repair Homologous recombination INDELS Lentiviral vector Protospacer-adjacent motif Transcription activator like effector NUCLEASES Zinc finger NUCLEASES
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MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy 预览
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作者 Anja Geisler Henry Fechner 《世界实验医学杂志》 2016年第2期37-54,共18页
Safe and effective gene therapy approaches require targeted tissue-specific transfer of a therapeutic transgene.Besides traditional approaches,such as transcriptional and transductional targeting,microRNA-dependent po... Safe and effective gene therapy approaches require targeted tissue-specific transfer of a therapeutic transgene.Besides traditional approaches,such as transcriptional and transductional targeting,microRNA-dependent posttranscriptional suppression of transgene expression has been emerging as powerful new technology to increase the specificity of vector-mediated transgene expression.MicroRNAs are small non-coding RNAs and often expressed in a tissue-,lineage-,activation-or differentiation-specific pattern.They typically regulate gene expression by binding to imperfectly complementary sequences in the 3’untranslated region(UTR)of the mRNA.To control exogenous transgene expression,tandem repeats of artificial microRNA target sites are usually incorporated into the 3’UTR of the transgene expression cassette,leading to subsequent degradation of transgene mRNA in cells expressing the corresponding microRNA.This targeting strategy,first shown for lentiviral vectors in antigen presenting cells,has now been used for tissue-specific expression of vector-encoded therapeutic transgenes,to reduce immune response against the transgene,to control virus tropism for oncolytic virotherapy,to increase safety of live attenuated virus vaccines and to identify and select cell subsets for pluripotent stem cell therapies,respectively.This review provides an introduction into the technical mechanism underlying microRNA-regulation,highlights new developments in this field and gives an overview of applications of microRNA-regulated viral vectors for cardiac,suicide gene cancer and hematopoietic stem cell therapy,as well as for treatment of neurological and eye diseases. 展开更多
关键词 MICRORNA MICRORNA regulation MICRORNA target SITES VIRAL VECTORS ADENO-ASSOCIATED virus RNA interference Gene therapy Vector targeting
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腺相关病毒介导的小鼠发育期大脑中的特定细胞和特定脑区的基因编辑及潜在应用探索 预览
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作者 周斌 胡镐申 +2 位作者 陈玲敏 王婷 蒋若天 《临床和实验医学杂志》 2019年第3期225-229,共5页
目的探索腺相关病毒(AAV)用于发育期星形胶质细胞的高分辨稀疏标记以及在皮质和海马中的区域性标记的可能性。方法 在成年小鼠海马立体定位注射携带有绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV5、AAV8和AAV9,比较感染效率。然后,立体定位注射AAV5和AAV9... 目的探索腺相关病毒(AAV)用于发育期星形胶质细胞的高分辨稀疏标记以及在皮质和海马中的区域性标记的可能性。方法 在成年小鼠海马立体定位注射携带有绿色荧光蛋白(EGFP)的AAV5、AAV8和AAV9,比较感染效率。然后,立体定位注射AAV5和AAV9至新生小鼠大脑皮质和海马,观察稀疏细胞标记和区域性标记的标记效果。结果 三种血清型AAV的感染效率依次为AAV8 >AAV9 >AAV5,AAV5及AAV8分别对星形胶质细胞和神经元具有较高亲嗜性。AAV5注射至P0小鼠皮质,在P9时即可实现稀疏标记,且标记信号强度高,高分辨激光共聚焦显微镜下3D扫描后适用于星形胶质细胞的形态3D重建和量化分析。通过对P0小鼠的立体定位注射,还实现了发育期小鼠皮质和海马的区域性基因转导。结论 根据感染效率和细胞亲嗜性选择AAV血清型,通过立体定位注射,能够实现发育期小鼠特定细胞类型和脑区的高效基因转导。上述结果有助于扩展AAV在中枢系统发育和相关疾病中的应用范畴。 展开更多
关键词 小鼠 发育期大脑 腺相关病毒 亲嗜性 稀疏标记 区域性
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腺相关病毒的生产方式及其在基因治疗中的应用 预览
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作者 杜梦潭 刘兴健 +2 位作者 胡小元 张志芳 李轶女 《生物技术进展》 2019年第4期326-331,共6页
随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相... 随着基因治疗产品不断得到批准用于临床研究,基因治疗相关的病毒载体也受到广泛关注,其中腺相关病毒载体因其低致病性、低免疫原性、宿主范围广泛且稳定表达等独特优势成为最有前景的病毒载体,广泛应用于临床研究,目前已有2种重组腺相关病毒载体的药品得到批准且效果显著,但由于大规模生产技术的缺乏限制了重组腺相关病毒载体的研究和广泛应用。就腺相关病毒的结构和功能、载体的生产方式及其现阶段在基因治疗中的应用进行了综述,以期为今后以腺相关病毒为载体的基因治疗大规模应用于市场提供参考。 展开更多
关键词 腺相关病毒 基因治疗 杆状病毒表达系统 脂蛋白脂肪酶缺乏症 人类视网膜疾病
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AAV介导的EPO基因下调对CNV的抑制作用
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作者 王艺晓 姚腾腾 +3 位作者 童尧 周雅丽 杨源 汪朝阳 《中华眼视光学与视觉科学杂志》 CAS CSCD 2019年第9期641-647,共7页
目的:研究腺相关病毒(AAV)介导的促红细胞生成素(EPO)shRNA靶向视网膜色素上皮(RPE)的EPO表达水平下调对脉络膜新生血管(CNV)进展的影响,以期发现潜在的湿性年龄相关性黄斑变性(nAMD)的治疗靶点。方法:实验研究。在HEK293T细胞内对包含E... 目的:研究腺相关病毒(AAV)介导的促红细胞生成素(EPO)shRNA靶向视网膜色素上皮(RPE)的EPO表达水平下调对脉络膜新生血管(CNV)进展的影响,以期发现潜在的湿性年龄相关性黄斑变性(nAMD)的治疗靶点。方法:实验研究。在HEK293T细胞内对包含EPOshRNA片段的AAV质粒进行验证(采用Student'st检验)。选用2个月龄C57/B6J小鼠10只,右眼作为实验组,视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP-EPO-shRNA;左眼作为对照组,视网膜下注射AAV1-sCBA-GFP。注射后3周,进行激光诱导的CNV造模,造模后拍摄眼底照片确认病毒转染及造模情况,造模后15dRPE铺片以测算CNV面积大小,并用Student'st检验方法进行组间比较。结果:EPOshRNA在HEK293T细胞内对EPO表达的下调效率为69.6%,且与对照组相比差异具有统计学意义(t=6.080,P=0.022)。眼底照片显示,注射了AAV的小鼠造模成功;视网膜有点状的绿色荧光蛋白表达,证实病毒转染成功。造模后15d,RPE铺片显示实验组的平均CNV面积与对照组相比小44.7%(t=4.279,P=0.001)。结论:AAV介导的EPOshRNA对CNV的发生和发展起到显著的抑制作用,在未来可能作为nAMD的新治疗方法。 展开更多
关键词 腺相关病毒 脉络膜新生血管 促红细胞生成素 年龄相关性黄斑变性
Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶提高静脉桥血管腺相关病毒感染效率的研究 预览
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作者 李送 钟昌明 +5 位作者 王小文 张诚 冯波 谢晓 黄春 向小勇 《上海交通大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期730-736,共7页
目的·探讨应用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶是否可以有效提高静脉桥血管中腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的感染效率。方法·构建大鼠静脉桥血管再狭窄模型。用编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescen... 目的·探讨应用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶是否可以有效提高静脉桥血管中腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的感染效率。方法·构建大鼠静脉桥血管再狭窄模型。用编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,Egfp)报告基因的重组AAV(AAV1、AAV6、AAV8、AAV9血清型)感染静脉桥血管,并使用pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶增加病毒接触时间和改善血管壁通透性。分别在术后21d采集标本,应用冰冻切片、免疫组织化学染色和定量反转录PCR检测静脉桥血管中EGFP的表达以明确感染效率。通过测量组织拉伸强度来评估组织的结构完整性。结果·Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶能够显著提高静脉桥血管中AAV的感染效率,但并不影响静脉桥血管的组织抗拉性,且AAV6血清型相比AAV1、AAV8、AAV9血清型感染静脉桥血管的效率更高。结论·Pluronic F-127-胰蛋白酶混合凝胶涂染是一种提高静脉桥血管AAV感染效率安全有效的方法,可用于静脉桥血管再狭窄的防治研究。 展开更多
关键词 基因治疗 腺相关病毒 PLURONIC F-127 静脉桥血管 再狭窄
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可见光起搏心脏的在体实验研究
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作者 饶盼盼 王晞 +2 位作者 程玥 姜婵 黄从新 《中国心脏起搏与心电生理杂志》 2019年第2期133-137,共5页
目的探究473 nm可见蓝光能否对表达光敏感蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)的大鼠心脏成功实现在体光起搏及光起搏所需的光照功率密度与脉冲波宽的关系。方法将27只SD大鼠随机分为三组:正常组、ChR2组、空载病毒组,每组9只。分别经右侧颈... 目的探究473 nm可见蓝光能否对表达光敏感蛋白channelrhodopsin-2 (ChR2)的大鼠心脏成功实现在体光起搏及光起搏所需的光照功率密度与脉冲波宽的关系。方法将27只SD大鼠随机分为三组:正常组、ChR2组、空载病毒组,每组9只。分别经右侧颈静脉注射60μl PBS,60μl载有ChR2的腺相关病毒[AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry],60μl空载病毒(AAV9-CAG-mCherry)。8周后,大鼠经麻醉开胸充分暴露心脏后,给予473 nm蓝光8 Hz频率的脉冲照射心脏右心室,并同步记录光照输出信号和体表心电图,改变光照功率密度(0.03~1.97 mw/mm~2)和脉冲波宽(2、5、10、20、50 ms),观察光照对心室夺获起搏的情况。结果 8 Hz脉冲光照固定脉冲宽度20 ms时,0.64 mw/mm~2可完全夺获心脏节律。在0.03~0.64 mw/mm~2范围内,心脏夺获率随功率密度增大而增加,夺获率可达100%。改变473 nm蓝光脉冲波宽,完全起搏心脏所需最小光照功率密度(mw/mm~2)依次为0.46±0.33, 0.26±0.10, 0.18±0.04,0.13±0.04,0.16±0.07。2倍功率密度阈值脉冲光照结束后,心电图RR间期、QT间期、QRS波宽与基础心率无显著差异(P均>0.05)。结论颈静脉注射腺相关病毒AAV9-CAG-hChR2 (H134R)-mCherry能够使心脏表达光敏感蛋白ChR2,473 nm蓝光可有效起搏心脏。心脏夺获率与光照的功率密度和脉冲宽度有关。 展开更多
关键词 心血管病学 右心室 起搏 光遗传 光敏蛋白 腺相关病毒
腺相关病毒介导shRNA敲减小鼠海马兴奋性氨基酸转运体3动物模型的构建 预览
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作者 侯爱生 王晓燕 +5 位作者 武屹爽 曹福羊 刘蔷薇 张璇 沈浩 曹江北 《解放军医学院学报》 CAS 2019年第5期473-477,481共6页
目的构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型。方法基于SLC1A1(solute carrierfamil... 目的构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型。方法基于SLC1A1(solute carrierfamily 1 member 1)基因mRNA 序列设计4条shRNA(short hairpin RNA),将其模板DNA与酶切后的AAV-GP-1(pAAV-U6-EGFP)载体质粒连接、转化并测序鉴定得到重组质粒,将重组质粒、pHelper包装质粒和pAAV-DJ辅助质粒共同转染至AAV-293细胞包装得到rAAV;用所得rAAV侵染HT-22细胞,72h后RT-qPCR检测SLC1A1mRNA表达水平;36只成年C57小鼠随机分为6组,每组6只,予海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP病毒液1μL/侧,分别于注射后即刻、24h、7d、14d、21d、28d取双侧海马组织,Westernblot检测EAAT3表达水平。结果经测序重组质粒核苷酸序列正确,包装所得病毒浓缩滴度为1×1013TU/ml;rAAV感染HT-22细胞72h后SLC1A1表达量明显降低且显著低于阴性对照(P<0.01,n=3);小鼠海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP7d后EAAT3相对表达量下降(P<0.01),注射后21d、28d表达进一步降低(P<0.01)。结论成功构建介导shRNA表达的重组腺相关病毒系统,建立了一种有效的小鼠海马EAAT3敲减动物模型。 展开更多
关键词 腺相关病毒 兴奋性氨基酸转运体3 短发卡RNA 小鼠 海马
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经圆窗膜鼓阶显微注射腺相关病毒转染小鼠耳蜗的研究 预览
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作者 陈嘉伟 王卫龙 +4 位作者 丁雪瑞 赵倩倩 安晓刚 王人凤 卢连军 《听力学及言语疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期301-305,共5页
目的 探讨经圆窗膜鼓阶显微注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒AAV2/9-GFP转染小鼠耳蜗的可行性,为应用腺相关病毒治疗遗传性聋提供实验基础。方法 将24只野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组:实验组(12只)和人工外淋巴液组(6只)分... 目的 探讨经圆窗膜鼓阶显微注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒AAV2/9-GFP转染小鼠耳蜗的可行性,为应用腺相关病毒治疗遗传性聋提供实验基础。方法 将24只野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组:实验组(12只)和人工外淋巴液组(6只)分别经耳后径路通过圆窗膜向鼓阶内注射2 μl AAV2/9-GFP或人工外淋巴液;空白对照组(6只)正常饲养,不做任何处理。于术后21 d进行ABR测试,之后取耳蜗基底膜行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果 术后实验组和人工外淋巴液组术侧耳ABR各频率反应阈均不同程度升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义( P < 0.05 ),实验组与人工外淋巴液组比较差异无统计学意义( P > 0.05 )。实验组转染AAV2/9-GFP后可见基底膜底回至顶回均有GFP表达,转染阳性细胞呈逐渐减少的趋势,底回、中回及顶回的内毛细胞平均转染效率分别为 82.7%、 75.0%、 44.7%,底回与顶回、中回与顶回转染效率比较差异均有统计学意义( P < 0.05 ),底回与中回比较差异无统计学意义( P > 0.05 )。AAV2/9-GFP主要转染内毛细胞,外毛细胞未见GFP表达;实验组对侧耳、人工外淋巴液组及空白对照组均未见GFP表达。结论 携带目的基因的腺相关病毒载体可通过经圆窗膜鼓阶显微注射的方法转染至小鼠耳蜗内毛细胞并表达。 展开更多
关键词 基因转染 圆窗膜 腺相关病毒 小鼠 绿色荧光蛋白
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miR-133a-3p重组腺相关病毒的构建及抑制LX-2细胞α-SMA基因表达
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作者 李亮 张传山 +4 位作者 毕晓娟 马洋洋 王慧 吐尔干艾力·阿吉 林仁勇 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第6期625-628,共4页
目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,... 目的构建miR-133a-3p重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)过表达载体并转染肝星状细胞,鉴定其转染及干预作用。方法体外培养肝星状细胞株LX-2细胞,试验分为DMEM对照组,AAV8-Scrambled对照组,AAV8-miR-133a-3p组,应用qRT-PCR法检测miR-133a-3p转染表达量,检测胶原蛋白(COL1A1)、-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和TGF-β/Smad信号通路基因的表达量。结果重组腺相关病毒成功构建并转染LX-2细胞,AAV8-miR-133a-3p转染LX-2细胞组的miR-133a-3p相对表达量为11 000±343.10,与DMEM对照组比较差异有统计学意义(t=32.07,P<0.01)。AAV8-miR-133a-3p转染组与DMEM组α-SMA mRNA的相对表达量分别为0.42±0.06 vs 1.00±0.09(t=5.72,P<0.05),COL1A1 mRNA的相对表达量为0.34±0.03 vs 1.00±0.04(t=12.66,P<0.01)。结论重组腺相关病毒成功转染LX-2细胞,且能抑制肝星状细胞纤维化标志物α-SMA的表达,为探讨miR-133a-3p在调控肝星状细胞所致纤维化中的作用奠定了理论基础。 展开更多
关键词 腺相关病毒 肝星状细胞 miR-133a-3p
携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其评价 预览
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作者 郭莉霞 殷钟意 郑旭煦 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期14-17,共4页
构建稳定表达 NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默 NMU2R 表达的高滴度重组腺相关病毒。首先设计合成 NMU2R shRNA,退火形成双链与pAAV-ZsGreen-shRNA质粒 Bam H I和 Hin d III双酶切产物相连接构建形成质粒pAAV-ZsG... 构建稳定表达 NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默 NMU2R 表达的高滴度重组腺相关病毒。首先设计合成 NMU2R shRNA,退火形成双链与pAAV-ZsGreen-shRNA质粒 Bam H I和 Hin d III双酶切产物相连接构建形成质粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,经双酶切和测序鉴定证实,重组质粒克隆正确,将重组质粒转染到AAV-293包装细胞中包装成腺相关病毒载体,成功制备重组腺相关病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,经测定纯化所得rAAV5病毒滴度为1×10^12 vg/mL。最后将rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12,检测 NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒载体pAAV-ZsGreen-shRNA作对照,Real-time PCR及Western Blot方法测得 NMU2R mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著下降。综上,成功构建了高滴度携带 NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。 展开更多
关键词 neuromedin U 2受体 RNA干扰 重组腺相关病毒
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rAAV9-NGF基因转染糖尿病大鼠对心脏损伤的保护作用 预览
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作者 易剑敏 岳维 +1 位作者 高盼 张伟男 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期424-429,共6页
目的探讨通过心肌点注射,重组腺相关病毒9型(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因转染糖尿病大鼠,对心脏损伤的保护作用。方法大鼠糖尿病模型建立后4周,心脏点注射携带... 目的探讨通过心肌点注射,重组腺相关病毒9型(recombinant adeno-associated virus serotype 9,rAAV9)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因转染糖尿病大鼠,对心脏损伤的保护作用。方法大鼠糖尿病模型建立后4周,心脏点注射携带NGF基因的重组腺相关病毒(rAAV9-NGF),使心肌组织过表达NGF。5周后,免疫荧光检测NGF、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)和神经纤维的分布;血流动力学参数评估心脏功能;ELISA法检测心肌组织中NGF、CGRP等蛋白表达水平。结果rAAV9介导的外源基因NGF可稳定转染,且过表达于糖尿病大鼠的心肌组织,LVSP、HR、+dp/dt max明显下降,LVEDP、-dp/dt max明显上升,心功能改善;心肌组织中的NGF、CGRP蛋白上调;免疫荧光结果显示,转染后可部分逆转心肌组织NGF、CGRP和神经纤维的减少。结论心肌点注射rAAV9-NGF基因可有效提高糖尿病大鼠心肌NGF的表达,促进神经纤维的生长,产生对心脏的保护作用。 展开更多
关键词 神经生长因子 降钙素基因相关肽 转染 重组腺相关病毒 糖尿病周围神经病变 心脏病
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基因治疗与遗传性耳聋 预览
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作者 顾湘 郭维维 杨仕明 《中国听力语言康复科学杂志》 2019年第4期275-279,共5页
超过60%的语前聋病例是由于遗传因素引起。遗传性耳聋患者的基因突变包括单核苷酸替换、碱基缺失、插入等,当这些突变导致耳聋基因的错义时便可临床上引起遗传性耳聋的症状。对这些突变在基因水平选择性纠正是目前遗传性耳聋生物治疗的... 超过60%的语前聋病例是由于遗传因素引起。遗传性耳聋患者的基因突变包括单核苷酸替换、碱基缺失、插入等,当这些突变导致耳聋基因的错义时便可临床上引起遗传性耳聋的症状。对这些突变在基因水平选择性纠正是目前遗传性耳聋生物治疗的新思路。CRISpR/Cas技术作为第三代的靶向基因组编辑技术系统,具有靶向、高效、易操作等优势,很大程度上推进了耳聋的基因治疗研究。本文对目前国内外耳聋的基因治疗研究现状进行回顾。 展开更多
关键词 基因编辑 遗传性耳聋 CRISpR/Cas 腺相关病毒载体
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脊髓损伤模型大鼠软脊膜下注射2型腺相关病毒免疫荧光染色分析 预览
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作者 柏秋实 苏胜 +4 位作者 王亮佳 郑洋洋 康娟娟 徐金影 池光范 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第31期4979-4985,共7页
背景:经软脊膜下注射腺相关病毒的方法可将病毒局限于以注射点为中心的较小范围内,全身毒副作用小,节省病毒的用量,但目前尚无将此方法应用于脊髓损伤大鼠的相关报道,对损伤部位星形胶质细胞和神经细胞的转染情况尚不明确。目的:探讨通... 背景:经软脊膜下注射腺相关病毒的方法可将病毒局限于以注射点为中心的较小范围内,全身毒副作用小,节省病毒的用量,但目前尚无将此方法应用于脊髓损伤大鼠的相关报道,对损伤部位星形胶质细胞和神经细胞的转染情况尚不明确。目的:探讨通过软脊膜下注射2型腺相关病毒对脊髓损伤部位的星形胶质细胞和神经细胞的转染效果及手术过程的技术要点。方法:实验方案经吉林大学动物实验伦理委员会批准。24只Wistar大鼠随机分为2组:腺相关病毒组和模型组,均使用钳夹法构建脊髓损伤模型。腺相关病毒组经软脊膜下注射60μL病毒溶液;模型组经软脊膜下注射等量5%右旋糖酐溶液。于术后7,14和21d取脊髓标本,进行免疫荧光染色,观察星形胶质细胞分布情况和2型腺相关病毒转染情况。结果与结论:①经软脊膜下注射病毒后,病毒溶液最终均匀分布于损伤部位上下约1 cm的范围内;②术后7,14 d仅有微量绿色荧光蛋白在脊髓损伤区域表达,直至术后21 d,在脊髓损伤空洞周围可见有大量反应性星形胶质细胞,其在脊髓空洞周边部表达最为强烈,出现明显的胶质界膜;同时发现,2型腺相关病毒可稳定转染星形胶质细胞和神经细胞,其中星形胶质细胞集中分布于脊髓空洞周边部,而神经细胞散在分布于病毒转染范围内,注射范围以外正常组织仅见微量2型腺相关病毒转染;③该方法具有能将病毒局限于损伤部位,可靶向性转染星形胶质细胞和神经细胞,具有注射量病毒量低,全身毒副作用小,成本节约等优点。 展开更多
关键词 2型腺相关病毒 钳夹型脊髓损伤 软脊膜下注射 星形胶质细胞 神经细胞 绿色荧光蛋白 神经胶质原纤维酸性蛋白 神经丝蛋白H 免疫组化 免疫荧光 胶质瘢痕
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携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定 预览
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作者 于水澜 姜颖 +1 位作者 于英君 宋高臣 《中国实验诊断学》 2019年第6期1058-1061,共4页
目的构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体;方法设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA(siRNA),构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒,采用磷酸钙共转染法将重组质粒pAKD-shRNACDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染AAV-29... 目的构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体;方法设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA(siRNA),构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒,采用磷酸钙共转染法将重组质粒pAKD-shRNACDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞,采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定;结果三质粒共转染AAV-293细胞48h后,荧光显微镜下检测到GFP绿色荧光,表明共转染成功,测定病毒平均滴度为3.56×1012v.g/ml。结论成功构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2。 展开更多
关键词 重组腺相关病毒(rAAV) 肝癌 CDK2 基因治疗
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携带CAR启动子的重组AAV9病毒在小鼠体内表达分布特性研究
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作者 马文豪 章嫣 +2 位作者 董哲岳 吴小兵 盛望 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期423-430,共8页
基因治疗正日益成为罕见病乃至单基因遗传病的首选治疗策略,提升基因药物的体内表达是重要研究领域。本文选择4种短内含子构建了4种嵌合型启动子CAR、CAS、CAP、CAT,通过Gluc报告基因表达活性比较发现,CAR强度明显高于CA,仅次于CAG。选... 基因治疗正日益成为罕见病乃至单基因遗传病的首选治疗策略,提升基因药物的体内表达是重要研究领域。本文选择4种短内含子构建了4种嵌合型启动子CAR、CAS、CAP、CAT,通过Gluc报告基因表达活性比较发现,CAR强度明显高于CA,仅次于CAG。选择CAR启动子构建和制备了携带EGFP报告基因的重组病毒rAAV9-CAR-EGFP,经SDS-PAGE分析可见病毒外壳蛋白条带清晰,表明纯度良好;Southern杂交检测可见基因组以自身互补的双链DNA为主。在新生小鼠和成年小鼠中用静脉注射(IV)和侧脑室注射(ICV)两种途径给药,研究了rAAV9-CAR-EGFP的体内表达分布特性。结果表明,新生鼠ICV注射rAAV9-CAR-EGFP在其脑部和脊髓可以观察到EGFP高转导效率和高强度表达,新生鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在脑组织观察到明确的EGFP绿色荧光,表明该病毒可有效穿越血脑屏障,但IV注射对于中枢神经系统的转导效率和表达强度明显低于ICV注射。无论是IV注射还是ICV注射,神经和肌肉系统中都可观察到EGFP的持续表达;同时还可以观察EGFP蛋白在外周组织中广泛分布,其中以肝脏、骨骼肌和心肌最为显著。另外,成年鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在肝脏观察到EGFP持续表达,而新生鼠IV或ICV注射则肝脏中EGFP的表达会随动物生长而明显衰减。这些研究结果为我们下一步用AAV9携带CAR启动子介导目的基因表达治疗中枢神经系统疾病如脊髓性肌萎缩症的基因药物设计奠定了基础。 展开更多
关键词 9型腺病毒相关病毒(AAV9) 5′UTR 嵌合型启动子 生物分布 基因治疗
利用BmNPV-家蚕表达系统包装重组腺相关病毒2型(rAAV2)研究 预览 被引量:1
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作者 鲁念 刘兴健 +3 位作者 胡小元 李轶女 易咏竹 张志芳 《生物技术进展》 2018年第1期71-77,F0003共8页
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表... 腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗中最常用的病毒载体之一,目前用于基因治疗的AAV多利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒表达系统(AcMNPV-sf9)包装,但较高的包装成本限制了AAV在基因治疗中的广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统与AcMNPV-sf9系统相比,具有包装量更高、成本更低的优势,因此更适用于包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)。首先,将AAV2功能基因cap和rep进行序列优化后合成,克隆到杆状病毒转移载体pVL1393上,将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和荧光素酶(luciferase,Luc)基因分别作为报告基因克隆到含有巨噬细胞病毒IE(cytomegalovirus-IE,CMV-IE)启动子的病毒转移载体pVL1393-ITRs-MCS上。随后,将构建好的转移载体分别与缺陷型家蚕杆状病毒re Bm Bac共转染Bm N细胞系,获得分别重组有cap、rep和报告基因的家蚕杆状病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)。再将纯化的重组病毒(re Bm-Cap2、re Bm-Rep2)与re Bm-EGFP、re Bm-Luc分别混合后感染家蚕,收获其表达产物,纯化得到含有目的基因的rAAV病毒。利用rAAV病毒感染哺乳动物细胞后,通过检测EGFP、Luc的表达状态来验证rAAV包装成功与否。结果显示,利用家蚕杆状病毒系统成功包装了rAAV2,并且在哺乳动物细胞中实现了报告基因的表达。 展开更多
关键词 腺相关病毒 家蚕 杆状病毒表达系统 包装
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耳蜗毛细胞miR-30b对Dynamin基因靶向调控的研究
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作者 李洋 唐小林 +2 位作者 余菲 李华君 袁伟 《四川大学学报:医学版》 CSCD 北大核心 2018年第3期347-351,共5页
目的观察正常成年小鼠耳蜗毛细胞中miR-30b的表达,研究其对靶基因(Dynamin1,DNM1)的调控是否会影响内毛细胞中突触囊泡内吞关键蛋白Dynamin的表达。方法取正常成年C57小鼠耳蜗基底膜行原位杂交,观察耳蜗毛细胞中miR-30b的表达分布;构... 目的观察正常成年小鼠耳蜗毛细胞中miR-30b的表达,研究其对靶基因(Dynamin1,DNM1)的调控是否会影响内毛细胞中突触囊泡内吞关键蛋白Dynamin的表达。方法取正常成年C57小鼠耳蜗基底膜行原位杂交,观察耳蜗毛细胞中miR-30b的表达分布;构建荧光素酶报告基因载体,转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确DNM1是否为miR-30b的靶基因;通过耳蜗圆窗显微注射过表达miR-30b的腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV),14d后通过real time-PCR检测miR-30b和DNM1的mRNA表达,免疫印迹实验(Western blot)检测Dynamin蛋白表达。结果 miR-30b在小鼠耳蜗内、外毛细胞胞质和胞核均有表达;miR-30b可抑制DNM1载体的荧光表达(P〈0.05),而突变型DNM1载体的荧光表达无抑制作用;转染AAV-miR-30b后miR-30b的相对表达量增高,DNM1和Dynamin蛋白表达降低。结论 miR-30b在小鼠耳蜗内、外毛细胞均有表达;miR-30可以靶向下调DNM1基因从而抑制Dynamin蛋白表达。 展开更多
关键词 毛细胞 miR-30b DNM1 DYNAMIN 原位杂交 双荧光素酶报告基因 腺相关病毒
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