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单链抗体对Cry1A类毒素的检测方法建立及识别差异初步研究
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作者 曲婷婷 张霄 +5 位作者 董飒 刘贝贝 李盼 王耘 张存政 刘贤金 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期516-525,共10页
为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(... 为建立一种针对Cry1类毒素的经济高效的检测方法,本研究以杂交瘤细胞株2D10 cDNA为模板,通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR, SOE-PCR)技术构建单链抗体(single-chain variable fragment, scFv)基因,转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)表达并建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定(double antibody sandwich ELISA, DAS-ELISA)检测方法,通过分子对接模拟分析影响scFv与Cry1A类毒素结合的关键因素。结果成功构建了scFv基因,表达纯化出具有较高识别活性的scFv抗体(约28 kD),所建立的DAS-ELISA方法对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的最低检测限(limits of determination, LOD)为20 ng/mL,分子对接结果显示,毒素的三维结构决定了其结合活性,氢键和疏水作用力在scFv与毒素结合过程中起重要作用。本研究利用基因工程抗体技术构建并表达获得了scFv抗体,建立了针对Cry1Ab/Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,初步分析研究了scFv与Cry1Ac/Cry1Ab和Cry1Aa的识别差异机制,为进一步改造、研究开发新型广谱scFv提供了理论依据。 展开更多
关键词 CRY1AB CRY1AC SCFV DAS-ELISA 分子对接
基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定
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作者 杨羊 梁成真 +4 位作者 孟志刚 陈全家 罗淑萍 张锐 郭三堆 《中国农业科技导报》 CSCD 北大核心 2018年第11期22-28,共7页
虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringi... 虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt) Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体(Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS)将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。 展开更多
关键词 Bt CRY1AC GR79 EPSPS 烟草 抗虫 抗草甘膦
转基因抗虫蛋白Cry1Ac与表面活性剂作用的芘探针光谱分析 预览
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作者 梁运姗 黄致君 +3 位作者 柳亦松 钱子妍 颜碧玥 王智 《高等学校化学学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期883-888,共6页
以芘作为外源荧光探针,采用牛血清蛋白作为参照,考察了转基因抗虫蛋白Cry1Ac与4种表面活性剂相互作用的荧光光谱特征.结果表明,鼠李糖脂和Tween 80体系的芘荧光行为有相似的变化规律,可与蛋白质发生稳定的缔合过程.Cry1Ac蛋白的亲水性... 以芘作为外源荧光探针,采用牛血清蛋白作为参照,考察了转基因抗虫蛋白Cry1Ac与4种表面活性剂相互作用的荧光光谱特征.结果表明,鼠李糖脂和Tween 80体系的芘荧光行为有相似的变化规律,可与蛋白质发生稳定的缔合过程.Cry1Ac蛋白的亲水性和分子极性较强,在表面活性剂浓度低时,可导致芘的I1/I3值较高.在阴离子、非离子表面活性剂胶团形成后,2种蛋白质的存在均不改变芘与表面活性剂的结合位点.十六烷基三甲基溴化铵对芘的荧光有一定猝灭作用,且在Cry1Ac蛋白介入下不能形成稳定的胶束. 展开更多
关键词 荧光 表面活性剂 CRY1AC 牛血清蛋白 微环境
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转Cry1Ac青花菜回交后代鉴定方法研究 被引量:2
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作者 李占省 张黎黎 +9 位作者 张小丽 舒金帅 苏彦宾 孙继峰 刘玉梅 方智远 杨丽梅 庄木 张扬勇 吕红豪 《园艺学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期97-108,共12页
转Bt基因青花菜在遗传分离后代中的鉴定方法,对于准确筛选阳性单株和抗虫材料具有重要影响。利用5份青花菜材料、1份阳性对照(转Cry1Ac基因纯合材料)和5份回交父本(阴性对照)为试验对象,在基因水平上对Cry1Ac进行普通PCR扩增,蛋白... 转Bt基因青花菜在遗传分离后代中的鉴定方法,对于准确筛选阳性单株和抗虫材料具有重要影响。利用5份青花菜材料、1份阳性对照(转Cry1Ac基因纯合材料)和5份回交父本(阴性对照)为试验对象,在基因水平上对Cry1Ac进行普通PCR扩增,蛋白水平上采用Bt-Cry1Ab/1Ac转基因检测试纸条测定,表观上采用小菜蛾离体饲虫试验进行抗性鉴定,比较阐明了3种方法的鉴定效果和优缺点。结果表明,3种方法分别从5份青花菜回交材料的159个分离单株中检测到82、77和75份阳性株,经卡方显著性检验,各材料阳性单株与非阳性单株分离后代均符合孟德尔遗传规律。分析表明,小菜蛾离体饲虫试验对于鉴定转Cry1Ac后代抗虫效果准确可靠,但需要很好地控制实验条件;Bt-Cry1Ab/1Ac转基因检测试纸条灵敏度高,可快速观察到Bt毒蛋白的实际表达量,基本不受条件限制,但必须控制人为误差;普通PCR扩增能够鉴定阳性株,但不能反映实际抗虫效果,必须结合小菜蛾饲虫试验或Bt毒蛋白水平上的检测才能实现精准鉴定。 展开更多
关键词 青花菜 转基因 CRY1AC 小菜蛾 遗传
田间棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率
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作者 李国平 高丽娜 +5 位作者 黄建荣 姬婷婕 黄博 田彩红 陆宴辉 封洪强 《应用昆虫学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期49-54,共6页
【目的】系统了解河南省新乡市田间棉铃虫Helicoverpa armigera(Htibner)种群对Cry1Ac蛋白的敏感性变化,可为该虫的抗性治理策略提供重要的科学依据。【方法】采用单雌系F,/F:代并结合诊断剂量法于2013—2016年连续监测了河南省... 【目的】系统了解河南省新乡市田间棉铃虫Helicoverpa armigera(Htibner)种群对Cry1Ac蛋白的敏感性变化,可为该虫的抗性治理策略提供重要的科学依据。【方法】采用单雌系F,/F:代并结合诊断剂量法于2013—2016年连续监测了河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的抗性基因频率以及种群敏感度的变化。【结果】2013-2016年河南省新乡市棉铃虫种群对Cry1Ac的抗性基因频率小于0.00212,抗性基因频率处于较低水平;种群的相对平均发育级别由2013年的0.506分别下降到2015和2016年的0.448和0.442,表明棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感度增加。【结论】河南省新乡市棉铃虫种群对转Cry1Ac基因棉花仍处于较为敏感阶段,转Bt基因棉花的种植面积在河南新乡地区的大面积缩小可能是其抗性发展缓慢的重要原因。 展开更多
关键词 棉铃虫 CRY1AC 抗性基因频率 抗性监测
棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆、亚细胞定位及其与Cry1Ac毒力的关系 预览 被引量:1
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作者 公玲玲 张丹丹 +3 位作者 郑曰英 于佃平 肖玉涛 曲爱军 《昆虫学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期297-308,共12页
【目的】长期种植转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有研究表明小菜蛾Plutella xylostella的white基因表达下调使其产生了Cry1Ac抗性,由于Pxwhite蛋白与ABC转运蛋白ABCG1同属于ABCG亚家族,我们推测棉... 【目的】长期种植转Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有研究表明小菜蛾Plutella xylostella的white基因表达下调使其产生了Cry1Ac抗性,由于Pxwhite蛋白与ABC转运蛋白ABCG1同属于ABCG亚家族,我们推测棉铃虫Helicoverpa armigera ABCG1基因(HaABCG1)的表达下调可能与棉铃虫对Cry1Ac毒素的抗性有关。【方法】克隆并分析HaABCG1的开放阅读框(open reading frame,ORF),通过构建HaABCG1基因的表达载体检测HaABCG1蛋白在TnH5细胞中的亚细胞定位;通过细胞毒力实验验证HaABCG1蛋白与Cry1Ac毒素的关系;利用RNAi技术验证HaABCG1表达下调是否会降低棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性。【结果】棉铃虫ABCG1基因的开放阅读框长1 896 bp,编码蛋白含631个氨基酸残基,分子质量估计为69.63 k D。离体昆虫细胞表达的HaABCG1蛋白主要定位在细胞的核膜和内质网。通过RNA干扰和生物测定实验发现HaABCG1下调表达不能使棉铃虫在Cry1Ac毒素浓度为0.05μg/m L的人工饲料上正常生长,3 d后处理组和对照组棉铃虫幼虫的体重变化无显著差异。经过细胞毒力实验证明HaABCG1蛋白不介导Cry1Ac毒素对TnH5细胞的毒力,它既不是Cry1Ac毒素的受体,也不是其他3种Bt毒素Cry1Ca,Cry2Aa和Cry1Fa的受体。【结论】HaABCG1基因表达下调与棉铃虫对Cry1Ac的抗性不相关,HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道ABCG1基因不参与棉铃虫的Cry1Ac抗性。 展开更多
关键词 棉铃虫 ABCG1 CRY1AC Bt毒素受体 亚细胞定位 Bt抗性
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改造Cry1Ac蛋白C端对转基因水稻抗二化螟虫的影响
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作者 刘洋 刘相国 +7 位作者 闫玮玉 金永梅 陈子奇 贾伟 肖国红 张艳 林秀峰 尹悦佳 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2017年第4期1312-1319,共8页
二化螟虫的泛滥严重影响水稻的产量,cry1Ac基因是目前世界上应用最广泛和最高效的抗虫基因之一,但二化螟虫通过进化会逐渐对其产生抗性。通过改变蛋白结构来构建新的Cry蛋白是解决这一问题的有效途径之一。为分析改造Cry1Ac蛋白C端能否... 二化螟虫的泛滥严重影响水稻的产量,cry1Ac基因是目前世界上应用最广泛和最高效的抗虫基因之一,但二化螟虫通过进化会逐渐对其产生抗性。通过改变蛋白结构来构建新的Cry蛋白是解决这一问题的有效途径之一。为分析改造Cry1Ac蛋白C端能否对转基因作物抗虫性产生影响,本研究采用Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端,重组获得CryFLAc蛋白。将cry1Ac基因和编码CryFLAc蛋白的cryFLAc基因分别构建到pTF101.1-ubi植物表达载体上,利用农杆菌介导方法转化到吉林省水稻品种吉粳88中;采用PCR、RT-PCR、免疫检测试纸条检测的方法确定cry1Ac、cryFLAc基因整合和表达情况;通过室内和田间抗虫性测试评价CryFLAc和Cry1Ac蛋白对T1代转基因水稻抗虫性的影响。研究发现:cry1Ac、cryFLAc基因均成功整合到水稻基因组中,并稳定表达;转cryFLAc基因水稻抗二化螟水平达到抗性级别,转cry1Ac基因水稻达到高抗级别;转cry1Ac基因水稻二化螟抗性高于转cryFLAc基因水稻。结果表明:Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端不会提高转基因水稻的抗虫性。上述研究为人工设计合理化改造Cry蛋白提供了新的理论依据。 展开更多
关键词 CRY1AC Cry1Ja C端 转基因水稻 抗虫性
棉铃虫中肠钙粘蛋白、氨肽酶N及碱性磷酸酯酶的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响
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作者 王冰洁 袁向东 +3 位作者 赵曼 刘臣 陈琳 梁革梅 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期977-984,共8页
【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了... 【目的】Cry1A和Cry2A类Bt蛋白通过特异性地与昆虫中肠上的受体蛋白结合而发挥杀虫作用,现已广泛应用于转基因抗虫作物。本研究旨在进一步明确Cry2A类蛋白的作用机制和Cry1A受体蛋白在Cry2A发挥毒力中的作用。【方法】本研究首先提取了棉铃虫Helicoverpa armigera的BBMV,制备了钙粘蛋白(CAD)、氨肽酶N(APN)和碱性磷酸酯酶(ALP)3种受体蛋白的抗体和抗血清;然后,利用Western blot检测BBMV上这3种受体蛋白后,利用抗体封闭技术比较了敏感棉铃虫和Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中3种受体蛋白的抗血清对Cry1Ac和Cry2Aa毒力的影响。【结果】对敏感品系棉铃虫,这3种已知的Cry1Ac受体蛋白抗血清显著地降低了Cry1Ac和Cry2Aa的毒力。其中APN抗血清对Cry1Ac毒力的影响最大,棉铃虫幼虫的死亡率降低了84.44%;ALP抗血清对Cry2Aa的毒力影响最大,棉铃虫幼虫死亡率比对照降低了71.04%。Cry1Ac对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力显著降低,Cry2Aa的毒性也减弱。在Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)中,3种受体抗血清对Cry1Ac的影响比在敏感棉铃虫中的影响小,尤其是CAD和APN抗血清对Cry1Ac毒力的抑制率显著低于在敏感棉铃虫中的抑制作用;CAD和ALP抗血清对Cry2Aa毒力的影响与在敏感棉铃虫中的影响差异不显著,但APN抗血清可以显著降低Cry2Aa对Cry1Ac抗性棉铃虫(BtR)的毒力。【结论】棉铃虫CAD,APN和ALP不仅参与了Cry1Ac的杀虫过程,也对Cry2Aa毒力有一定的影响,而且这3种蛋白可能与棉铃虫对Cry1Ac和Cry2Aa产生抗性及交互抗性相关。 展开更多
关键词 棉铃虫 受体蛋白 抗血清 CRY1AC Cry2Aa 抗性 交互抗性
小菜蛾钙黏蛋白片段对Cry1Ac蛋白的增效作用 预览
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作者 龚莉君 彭鹏 +2 位作者 袁哲明 柳傲 杨中侠 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期45-51,共7页
根据已报道的昆虫毒素结合区钙黏蛋白片段对Cry1Ac蛋白有增效作用,本文以3龄小菜蛾幼虫为研究对象,选取其钙黏蛋白相同功能区的两个片段,将两个片段进行克隆。通过pGEX-6p-1载体,在大肠杆菌中表达了功能区片段PxCAD1及PxCAD2。使用致死... 根据已报道的昆虫毒素结合区钙黏蛋白片段对Cry1Ac蛋白有增效作用,本文以3龄小菜蛾幼虫为研究对象,选取其钙黏蛋白相同功能区的两个片段,将两个片段进行克隆。通过pGEX-6p-1载体,在大肠杆菌中表达了功能区片段PxCAD1及PxCAD2。使用致死中浓度剂量的CrylAc蛋白(1μg/mL)及较高浓度的PxCAD1(556μg/mL)与PxCAD2(551.25μg/mL)对小菜蛾幼虫进行体外复配生测,结果表明,PxCAD1可使小菜蛾幼虫的致死率上升为85.56%,PxCAD2则不能增强CrylAc蛋白的杀虫活性;而PxCAD1与PxCAD2本身对于小菜蛾幼虫并无毒性。研究结果为筛选有效的协同片段提供了理论依据,对于揭示Bt杀虫蛋白的毒理机制和害虫对Bt杀虫蛋白的抗性机制具有重要意义。 展开更多
关键词 小菜蛾 钙黏蛋白片段 CRY1AC 增效作用 表达
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Characterization and functional analysis ofβ-1,3-galactosyltransferase involved in Cry1Ac resistance from Helicoverpa armigera (H&#252;bner) 预览
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作者 ZHANG Li-li LIANG Ge-mei +2 位作者 GAO Xi-wu CAO Guang-chun GUO Yu-yuan 《农业科学学报:英文版》 SCIE CSCD 2015年第2期337-346,共10页
Carbohydrate chains are the principal antigens by which Bacillus thuringiensis(Bt) identify receptor proteins. The interaction between the antigen and Bt causes a pore in the membrane of midgut epithelial cells of ins... Carbohydrate chains are the principal antigens by which Bacillus thuringiensis(Bt) identify receptor proteins. The interaction between the antigen and Bt causes a pore in the membrane of midgut epithelial cells of insects. Receptor proteins, such as aminopeptidase N and alkaline phosphatase, are glycoproteins. Cadherin is another cell surface receptor protein which has potential glycosylation sites. Glycosyltransferase is very important for the synthesis and modification of receptor proteins. It can indirectly influence the function of Bt. The 1 950 bp full-length c DNA encoding β-1,3-galactosyltransferase was cloned from the the midgut of Helicoverpa armigera by degenerative PCR combined with RACE techniques(GAL-Harm, Gen Bank accession no.: GQ904195.1) with two potential N-glycosylation sites(157NNTI160 and 272NKTL275). Protein sequence alignments revealed that H. armigera β-1,3-galactosyltransferase shared high identity with β-1,3-galactosyltransferase in other insect species. The expression level of the β-1,3-galactosyltransferase gene in Cry1Ac-resistant H. armigera larvae was 9.2-fold higher than that in susceptible strain. The function of β-1,3-galactosyltransferase was investigated using RNAi technique. The result showed Cry1 Ac enhanced the toxicity against the si RNA-treated larvae compared with non-si RNA-treated ones, which indicated β-1,3-galactosyltransferase played an important role for the insecticidal toxicity of Cry1 Ac in H. armigera. 展开更多
关键词 棉铃虫幼虫 糖基转移酶 半乳糖 抗性 苏云金杆菌(BT) RNAi技术 N-糖基化 受体蛋白
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一株苏云金芽胞杆菌新菌株的基因型及其杀虫活性 预览
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作者 王立宇 南宫自艳 +2 位作者 张杰 王勤英 宋萍 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期76-79,共4页
苏云金芽胞杆菌Bt WL‐1是本实验室自行分离得到的对鳞翅目多种害虫都具有较高活性的野生菌株。本研究利用扫描电镜观察发现,该菌株产生菱形伴孢晶体蛋白,该晶体蛋白对鳞翅目棉铃虫、二点委夜蛾、小菜蛾和小地老虎等2龄幼虫都具有较... 苏云金芽胞杆菌Bt WL‐1是本实验室自行分离得到的对鳞翅目多种害虫都具有较高活性的野生菌株。本研究利用扫描电镜观察发现,该菌株产生菱形伴孢晶体蛋白,该晶体蛋白对鳞翅目棉铃虫、二点委夜蛾、小菜蛾和小地老虎等2龄幼虫都具有较高的毒力。利用Bt基因通用引物 PCR扩增得到该菌株含有 cry1基因,8% SDS‐PAGE检测得到该菌株只含有分子量为130 kDa的蛋白主带。质谱分析表明,该蛋白主带和 Bt Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1Ea、Cry1Ae、Cry1Db和Cry1Aa蛋白具有较高的同源性。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 CRY1AC 棉铃虫 质谱分析
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亚洲玉米螟中肠Cry1Ac毒素结合蛋白V-ATP酶A亚基的研究 预览 被引量:1
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作者 靳婷婷 李宁 +1 位作者 王振营 何康来 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2015年第2期208-215,共8页
运用RT-PCR和RACE技术克隆了亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼虫中肠V-ATP酶A亚基基因ofvaa,其c DNA全序列长2535 bp,开放阅读框1854 bp,编码617个氨基酸,预测蛋白分子量68.01 k D,等电点(p I)4.90。序列中包含有V-ATP... 运用RT-PCR和RACE技术克隆了亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)幼虫中肠V-ATP酶A亚基基因ofvaa,其c DNA全序列长2535 bp,开放阅读框1854 bp,编码617个氨基酸,预测蛋白分子量68.01 k D,等电点(p I)4.90。序列中包含有V-ATP酶A亚基特征,即ATP-synt_ab_N结构域ATP-synt_ab_C结构域和可供ATP结合的保守区Walker A(GAFGCGKT),以及天门冬氨酸介导Mg2+反应的保守区Walker B(SMMAD)。原核表达并获得纯化的Of VAA多肽片段,配体杂交试验表明其能够与Cry1Ac毒素结合。生测结果表明,Of VAA多肽片段对亚洲玉米螟有一定的杀虫活性,当其与Cry1Ac毒素混合时杀虫效果呈现加性效应。鉴定的亚洲玉米螟V-ATP酶A亚基基因ofvaa c DNA序列在Gen Bank登录号为HQ434762。 展开更多
关键词 亚洲玉米螟 V-ATP酶A亚基 苏云金芽孢杆菌 CRY1AC 结合蛋白
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芽胞外壁基质组成蛋白的编码基因启动子PexsY指导的cry1Ac基因表达 被引量:1
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作者 郑庆云 王冠男 +5 位作者 张喆 曲宁 彭琦 张杰 高继国 宋福平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1138-1145,共8页
【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达CrylAc晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过B.半乳糖苷酶活性分析了PexsY启... 【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达CrylAc晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过B.半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了crylAc基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的crylAc基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的CrylAc蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达CrylAc蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的CrylAc蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌 PexsY启动子 Cry1Ac蛋白
转Cry1Ac基因抗虫棉与其亲本棉花根际真菌多样性的比较
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作者 潘建刚 焦海华 +4 位作者 白志辉 齐鸿雁 马安周 庄国强 张洪勋 《环境科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期4329-4337,共9页
在温室条件下,利用PCR-DGGE技术和Q-PCR技术分析了两种转Cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉花在不同取样时期的根际真菌多样性和生物量的动态变化情况,以评价其生态安全.结果表明,转Bt基因棉与对照棉根际真菌优势条带组成在不同的取样时期极... 在温室条件下,利用PCR-DGGE技术和Q-PCR技术分析了两种转Cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉花在不同取样时期的根际真菌多样性和生物量的动态变化情况,以评价其生态安全.结果表明,转Bt基因棉与对照棉根际真菌优势条带组成在不同的取样时期极为相似,三者间差异条带多为不清晰的条带.转Bt棉SGK321根际真菌的生物量在苗期明显低于亲本对照,转Bt棉XP188根际真菌的生物量在花铃期较对照有轻微降低,其它时期两种转Bt棉根际真菌生物量没有显著降低,甚至还有增加的趋势.不过根际真菌群落结构的改变和生物量的差异不仅存在于转基因棉和其亲本对照棉之间,它同样存在于对照棉SHIYUAN321和JM20之间以及转基因棉SGK321和XP188之间.可见Bt并不是造成转基因棉和非转基因棉根际真菌群落结构差异、多样性改变和生物量减少的唯一诱因,品种的不同也对它们也有影响. 展开更多
关键词 转基因棉花 CRY1AC 真菌多样性 18S RRNA 根际
低磷胁迫对转基因抗虫玉米苗期生长的影响 被引量:2
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作者 苏贺 牛晓雪 +2 位作者 陈小文 申婷婷 董学会 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期63-72,共10页
为了了解导入Bt基因是否会引起玉米对磷元素利用能力发生改变,本研究采用转基因抗虫玉米Bt 38及其背景材料郑单958(ZD 958)为试验材料,进行水培试验,设置正常供磷(1mmol/L)和低磷(1μmol/L)两个水平。结果表明:在相同磷浓度下,ZD 958与B... 为了了解导入Bt基因是否会引起玉米对磷元素利用能力发生改变,本研究采用转基因抗虫玉米Bt 38及其背景材料郑单958(ZD 958)为试验材料,进行水培试验,设置正常供磷(1mmol/L)和低磷(1μmol/L)两个水平。结果表明:在相同磷浓度下,ZD 958与Bt 38的某些生物性状、生理性状显著地不同,在生物性状上,正常供磷条件下与ZD 958相比,Bt 38根长极显著降低,全展叶叶面积极显著减小,低磷条件下与ZD 958相比,Bt 38株高、根长、茎粗、叶长,叶宽、地上鲜重、地下鲜重均极显著增加,根冠比显著下降;在生理特征上,相同供磷条件下,与ZD 958相比,抗虫玉米心叶、全展叶叶绿素含量及Chla/Chlb均有显著性变化,抗虫玉米不同部位可溶性糖、淀粉含量、激素含量亦有显著性变化。此外,全展叶中可溶性蛋白含量和抗氧化物酶活性也有显著性变化。综上,Bt基因的导入改变了ZD 958苗期对磷元素的利用能力,从而使ZD 958与Bt 38在不同磷环境下表现出不同的生存能力。 展开更多
关键词 玉米 Bt 38 郑单958 抗虫 低磷胁迫 CRYLAC
Cry1Ac和sck双价抗虫基因遗传转化甘蔗的研究 预览 被引量:2
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作者 吴转娣 吴才文 +5 位作者 曾千春 苏火生 刘新龙 姚丽 张敏 刘家勇 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2014年第11期2236-2242,共7页
将双价抗虫基因,即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(Cry1Ac)和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甘蔗优良品种ROC22,获得潮霉素抗性转化植株95株,35株能检测到外源抗虫基因,获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株,斑点杂... 将双价抗虫基因,即修饰的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(Cry1Ac)和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甘蔗优良品种ROC22,获得潮霉素抗性转化植株95株,35株能检测到外源抗虫基因,获得的13株RT-PCR双基因均呈阳性的甘蔗植株,斑点杂交检测有4株呈阳性.结果表明:外源抗虫基因已导入甘蔗基因组中. 展开更多
关键词 甘蔗 根癌农杆菌介导法 CRY1AC sck 遗传转化
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近等基因系Cry1Ac抗性和敏感小菜蛾中肠蛋白酶的测量及部分生物学参数比较 预览
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作者 杨艳菊 朱勋 +5 位作者 向文胜 王少丽 吴青君 徐宝云 谢文 张友军 《广东农业科学》 CSCD 北大核心 2014年第11期89-94,105共7页
比较了近等基因系Cry1Ac抗性(NIL-R)和敏感(DBM1Ac-S)小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫中肠蛋白酶的活性,测量了NIL-R和DBM1Ac-S的卵宽、卵长和蛹重,并对其卵的孵化率、化蛹率、雌雄比等参数进行了统计.结果表明,抗、敏种群中肠... 比较了近等基因系Cry1Ac抗性(NIL-R)和敏感(DBM1Ac-S)小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫中肠蛋白酶的活性,测量了NIL-R和DBM1Ac-S的卵宽、卵长和蛹重,并对其卵的孵化率、化蛹率、雌雄比等参数进行了统计.结果表明,抗、敏种群中肠类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著,而敏感种群中肠的总蛋白酶、类胰蛋白酶的活力显著高于抗性品系.这两个种群卵的大小和孵化率、蛹重和化蛹率、雌雄比在统计上没有显著性差异,说明就以上生物学参数来看,NIL-R对Cry1Ac的抗性并没有引起抗性的适合度代价. 展开更多
关键词 近等基因系 CRY1AC 小菜蛾 中肠蛋白酶
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两类苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白杀玉米螟活性的比较 预览 被引量:2
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作者 田宇曦 刘晓艳 +1 位作者 张志刚 杨自文 《湖北农业科学》 北大核心 2014年第23期5742-5744,5747共4页
通过PCR技术将2种不同来源的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis.简称Bt)cry1AC蛋白基因克隆到大肠杆菌pGEX-6P-1表达载体,并转化到宿主菌BL21,采用IPTG进行诱导表达,并用亲和层析法进行融合蛋白的纯化,纯化后的蛋白质进行... 通过PCR技术将2种不同来源的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis.简称Bt)cry1AC蛋白基因克隆到大肠杆菌pGEX-6P-1表达载体,并转化到宿主菌BL21,采用IPTG进行诱导表达,并用亲和层析法进行融合蛋白的纯化,纯化后的蛋白质进行玉米螟的室内生物测定试验。结果表明,来自Bt菌株NBIN-866的Cry1Ac蛋白杀玉米螟的LG50为665.39μg/mL,来自Bt菌株NBIC-380的Cry1Ac蛋白杀玉米螟的LG50为15.07μg/mL,后者具有更高的杀虫活性。氨基酸序列比对发现来自菌株NBIC-380的Cry1Ac氨基酸序列的71位和393位都为丝氨酸S,而NBIN-866的都为脯氨酸P,推测这两个位点的氨基酸的变化可能是影响毒性大小的重要因素。 展开更多
关键词 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) CRY1AC 融合蛋白 玉米螟 活性比较
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转Bt基因糙米对断奶仔猪潜在致敏性的安全评价 预览
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作者 曹正辉 王占彬 顾宪红 《家畜生态学报》 北大核心 2014年第3期32-37,共6页
试验旨在研究转Bt(bacillusthuringiensis)基因糙米对断奶仔猪的致敏性。选用30头21日龄的“大×白”断奶仔猪,随机分为2组,对照组日粮中添加70%的亲本非转基因糙米,试验组日粮中添加70%的转Bt基因糙米,试验期30d。在试验... 试验旨在研究转Bt(bacillusthuringiensis)基因糙米对断奶仔猪的致敏性。选用30头21日龄的“大×白”断奶仔猪,随机分为2组,对照组日粮中添加70%的亲本非转基因糙米,试验组日粮中添加70%的转Bt基因糙米,试验期30d。在试验第7d和28d采血,试验第25d利用Bt基因在水稻中表达的CrylAc杀虫蛋白的标准品进行仔猪的皮肤试敏试验。结果表明,对两组糙米的氨基酸水平进行了检测和对比分析,发现两组糙米的氨基酸水平差异不显著(P〉0.05);通过对仔猪血清免疫球蛋白E、组织胺含量;血浆中二胺氧化酶活性及I)-乳酸含量;唾液皮质醇含量等的检测,结果显示两组间这五个指标均差异不显著(P〉0.05);利用CrylAc的蛋白标准品对仔猪进行的皮肤试敏试验,结果显示两组均无红斑产生。由试验结果可见,在本试验条件下,转Bt基因的糙米对仔猪无明显的致敏性。 展开更多
关键词 BT基因 糙米 CRY1AC 致敏性
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取食Cry2Ab蛋白后棉铃虫幼虫中肠组织的病理变化 被引量:1
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作者 高珍 梁革梅 +1 位作者 魏纪珍 张丽丽 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期934-944,共11页
为了明确Cry2Ab杀虫蛋白的作用机制,利用透射电镜观察了棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hiibner)3龄末幼虫取食含Cry2Ab蛋白(8μg/g)饲料后中肠的组织病理变化,并与分别取食含CrylAc蛋白(0.97μg/g)饲料和正常饲料的棉铃虫进行了... 为了明确Cry2Ab杀虫蛋白的作用机制,利用透射电镜观察了棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hiibner)3龄末幼虫取食含Cry2Ab蛋白(8μg/g)饲料后中肠的组织病理变化,并与分别取食含CrylAc蛋白(0.97μg/g)饲料和正常饲料的棉铃虫进行了比较。结果表明:棉铃虫取食Cry2Ab蛋白后中肠细胞及其细胞器均发生了明显的病变,主要表现为:中肠杯状细胞的杯腔肿胀或拉长,部分柱状细胞被杯状细胞挤压出来,微绒毛脱落,细胞核皱缩,质膜和核膜不清晰,染色质凝聚,线粒体拉伸变形,内质网肿胀断裂;并且随着取食时间的延长病变越来越明显。与取食CrylAc蛋白的棉铃虫相比,Q72Ab引起棉铃虫中肠组织发生病变的速度较慢。本研究叮为Cry2Ab作为转基因棉花的重要杀虫蛋白在将来更好地发挥作用提供理论依据。 展开更多
关键词 棉铃虫 杀虫蛋白 CRY2AB CRY1AC 中肠组织 病理变化
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