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猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白在昆虫细胞中的分泌表达与免疫特性研究
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作者 高莹 白娟 +1 位作者 宋中宝 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期983-989,共7页
以猪瘟病毒石门株E2囊膜糖蛋白基因序列为基础,构建了3种重组杆状病毒rAc-E2、rAc-E2oKm和rAc-HE2oKm。Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示,这3种重组杆状病毒均可正确表达重组E2蛋白,与E2蛋白和His的单克隆抗体均有良好的抗原反... 以猪瘟病毒石门株E2囊膜糖蛋白基因序列为基础,构建了3种重组杆状病毒rAc-E2、rAc-E2oKm和rAc-HE2oKm。Western-blot和间接免疫荧光试验结果显示,这3种重组杆状病毒均可正确表达重组E2蛋白,与E2蛋白和His的单克隆抗体均有良好的抗原反应特性,其中rAc-HE2oKm可分泌表达重组E2蛋白,可形成病毒样颗粒,可诱导免疫仔猪产生高水平抗体和中和抗体,免疫效果与猪瘟活疫苗相当,为猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗研究奠定了重要基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 亚单位疫苗
基于猪非典型瘟病毒E2蛋白的间接ELISA检测方法的建立
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作者 黎振标 许古明 +5 位作者 刘健新 任旭皎 鲁荣 李慧子 张彭涛 宁章勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期1-6,共6页
猪非典型瘟病(APPV)是新近发现能引起仔猪先天震颤的病原体,血清学检测方法亟待构建。本研究制备了APPV原核表达的E2重组蛋白,以其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果表明,最佳抗原包被浓度为10μg/mL,最佳血清稀释度为1:40,... 猪非典型瘟病(APPV)是新近发现能引起仔猪先天震颤的病原体,血清学检测方法亟待构建。本研究制备了APPV原核表达的E2重组蛋白,以其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果表明,最佳抗原包被浓度为10μg/mL,最佳血清稀释度为1:40,阴阳性临界值D450=0.243,灵敏度达到1:64;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪流感及圆环病毒病的阳性血清均不发生交叉反应,特异性好;批内变异系数最大值为3.797%,批间变异系数最大值为5.425%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对50份猪临床血清样本进行检测,阳性率为12%。本研究基于E2蛋白建立的间接ELISA方法为猪非典型瘟病毒感染的检测提供了可靠的工具,也为开展APPV相关的研究工作提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪非典型瘟病毒 E2蛋白 原核表达 间接ELISA
CSFV E2蛋白主要抗原区域在马克斯克鲁维酵母中的表达及小鼠免疫 预览
3
作者 朱培霞 陈蕾 +5 位作者 段进坤 刘洋 莫文娟 周峻岗 余垚 吕红 《复旦学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期43-51,共9页
猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已... 猪瘟是一种由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度接触传染性和致死性疾病.疫苗预防接种是控制猪瘟病毒传播的重要措施,目前我国使用的弱毒疫苗均为1.1亚型猪瘟病毒兔化弱毒株.随着病毒的不断变异,2.1亚型猪瘟病毒已经逐渐成为我国的主要流行毒株.本研究利用马克斯克鲁维酵母研究了2.1b型CSFV E2蛋白及其截短体mE2(690-916aa)在马克斯克鲁维酵母中的重组表达,发现去除E2蛋白跨膜区域可以显著提高E2蛋白表达水平,mE2的表达量在5L发酵罐中达1.25~2.5g/L.经分子筛纯化,mE2蛋白纯度达90%.纯化的mE2作为抗原蛋白,注射免疫小鼠28d后,可诱导小鼠产生抗CSFV的IgG特异性抗体,表明马克斯克鲁维酵母重组表达的mE2蛋白具有较好的免疫原性. 展开更多
关键词 猪瘟病毒 2.1b亚型 马克斯克鲁维酵母 E2蛋白 重组表达
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丙型肝炎病毒E2蛋白的生物信息学分析
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作者 李滚 张甜甜 +2 位作者 李蓓 张涛 卢香香 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第5期511-514,共4页
目的探讨研究丙型肝炎病毒E2蛋白的生物学特征。方法从NCBI数据库中获取丙型肝炎病毒E2蛋白氨基酸序列,利用在线分析软件分析其生物学特征,包括分子式、半衰期、疏水性、跨膜区、信号肽,磷酸化位点、二级结构特征等,通过综合分析丙型肝... 目的探讨研究丙型肝炎病毒E2蛋白的生物学特征。方法从NCBI数据库中获取丙型肝炎病毒E2蛋白氨基酸序列,利用在线分析软件分析其生物学特征,包括分子式、半衰期、疏水性、跨膜区、信号肽,磷酸化位点、二级结构特征等,通过综合分析丙型肝炎病毒E2蛋白的各类性质,得到最佳抗原表位区域,并对丙型肝炎病毒E2蛋白氨基酸序列预测结果进行了比对分析。结果丙肝病毒E2蛋白由344个氨基酸组成,分子式为C1696H2543N463O490S21,不稳定系数为35.6,理论等电点为7.2,总体平均亲水性为-0.131,为稳定性亲水蛋白质,E2蛋白二级结构中主要成分为无规则卷曲(占比43.6%)。该蛋白无信号肽且无跨膜区,约存在50个磷酸化位点,最佳抗原区域位于95-100氨基酸位置。结论生物信息学方法预测丙型肝炎病毒E2蛋白属于稳定性亲水蛋白,含有抗原表位区域,可为丙型肝炎表位疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 E2蛋白 抗原表位 生物信息学
抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定 预览
5
作者 刘运超 陈玉梅 +4 位作者 冯丽丽 汪磊 王聚财 陆东峰 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2019年第12期114-120,共7页
为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获... 为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10^5~1.02×10^6;IPMA效价分别为6.40×10^4、1.28×10^5、2.56×10^5、1.28×10^5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10^4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 中和性单克隆抗体 抗体中和效价 免疫过氧化物酶单层细胞试验
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猪瘟病毒E2蛋白配体表位的筛选与鉴定
6
作者 银梅 李鹏 +6 位作者 岳锋 张秋雨 胡东方 宁红梅 孔令芸 姜金庆 王选年 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1045-1051,共7页
为进一步精确定位猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白配体表位信息,利用DNASIS(Ver.2.5)软件分析设计合成7条多肽,主要覆盖E2蛋白,分别命名为SE21、SE22、SE231、SE232、SE241、SE242、SE03,同时设计合成1条无关多肽CP,均标记FITC。将PK-15细胞作为... 为进一步精确定位猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白配体表位信息,利用DNASIS(Ver.2.5)软件分析设计合成7条多肽,主要覆盖E2蛋白,分别命名为SE21、SE22、SE231、SE232、SE241、SE242、SE03,同时设计合成1条无关多肽CP,均标记FITC。将PK-15细胞作为靶细胞,通过多肽与PK-15细胞结合试验、多肽抑制CSFV感染PK-15细胞试验和CSFV阻断多肽与PK-15细胞结合试验,筛选和鉴定E2蛋白配体表位。结果表明,多肽SE241、SE242与PK-15细胞结合的平均荧光强度分别为74.43±4.59和83.60±3.11,显著高于其他多肽,抑制CSFV感染PK-15细胞的感染抑制率也显著高于其他多肽,同时这2条多肽与PK-15细胞的结合被CSFV有效阻断。证实SE241、SE242多肽为CSFV与靶细胞PK-15细胞结合的配体表位,并能抑制CSFV感染PK-15细胞。本试验为CSFV新型多肽疫苗或免疫佐剂的研制提供依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 配体表位
猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析 预览
7
作者 王冬雨 魏蔷 +4 位作者 刘运超 刘畅 杨棋 崔颖磊 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第3期128-133,143共7页
为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Wester... 为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性E2蛋白。对IPTG浓度及诱导温度和时间进行优化,结果显示,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,18℃条件下诱导表达16 h,E2蛋白的可溶性表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白,其终质量浓度为0.5 g/L。Western blot分析和间接ELISA结果显示,纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下都能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2蛋白活性良好。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行病毒中和试验,结果显示,免疫后56 d产生较高水平的中和抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。综上,成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白,且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 蛋白质纯化 血清学分析 免疫原性
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针对猪瘟病毒E2蛋白的实时荧光定量PCR方法的建立及应用 预览
8
作者 高飞 姜一峰 +6 位作者 李国新 张玉娇 李丽薇 虞凌雪 周艳君 郑海红 童光志 《中国动物传染病学报》 北大核心 2018年第5期23-28,共6页
根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101~108范围内线性相关系... 根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101~108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%~0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 荧光定量PCR E2蛋白
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E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化 预览
9
作者 尹彩霞 于少雄 +3 位作者 宋琨 李素 杨玉莹 仇华吉 《中国农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第10期1995-2003,共9页
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293... 【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 悬浮细胞系 吸附 内化
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牛病毒性腹泻病毒研究进展 预览 被引量:3
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作者 邵红 倪宏波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2017年第6期20-23,共4页
牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)是一个影响养牛业经济发展的重要病原,它能够引发牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhoea,BVD)。BVD是急性和繁殖障碍型传染病,使牛发生病毒性腹泻、发热、黏膜溃疡和白细胞数... 牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)是一个影响养牛业经济发展的重要病原,它能够引发牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhoea,BVD)。BVD是急性和繁殖障碍型传染病,使牛发生病毒性腹泻、发热、黏膜溃疡和白细胞数量减少等症状。文章重点对病毒的分型、E2蛋白结构功能、临床感染类型和防控措施等进行了综述,为该病的深入研究提供参考。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 分型 E2蛋白 临床类型 防控
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的可溶性表达
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作者 杨婷铄 王宇婷 +6 位作者 辛慧颖 张金悦 于迪 于泓漪 闻晓波 冉旭华 倪宏波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第11期1135-1139,共5页
目的可溶性表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白。方法参考BVDV NADL株序列设计1对特异性引物,PCR扩增BVDV NADL株E2全长编码区片段,目的片段经限制性内切酶克隆入质粒p ET28a,经双酶切及测序鉴定后,阳性... 目的可溶性表达牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白。方法参考BVDV NADL株序列设计1对特异性引物,PCR扩增BVDV NADL株E2全长编码区片段,目的片段经限制性内切酶克隆入质粒p ET28a,经双酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3)宿主菌,37℃IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;表达的重组蛋白经Ni-NTA Purification System纯化后进行SDS-PAGE鉴定。结果表达的重组E2蛋白相对分子质量约45 000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的38.9%,可与BVDV阳性血清发生特异性反应,纯度达95%以上,浓度约3.8 mg/ml,产量可达4.96 mg/L细菌培养物。结论实现了可溶性重组BVDV E2蛋白在原核表达系统中的表达,并具有较好的生物学活性。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 可溶性表达
猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达 预览
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作者 唐亚兰 吴思敏 +10 位作者 王钊哲 许瑞 林矫矫 洪炀 陈兆国 陆珂 李浩 石耀军 江嘉欣 李嘉静 朱传刚 《中国动物传染病学报》 北大核心 2017年第5期32-36,共5页
为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与pET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电... 为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与pET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23kDa;Westernblot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2基因 原核表达 蛋白纯化
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牙周病与早产及低体质量儿关系的临床研究 预览 被引量:3
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作者 郑德春 陈小玲 +2 位作者 骆凯 方丽珊 闫福华 《福建医科大学学报》 北大核心 2017年第2期117-120,共4页
目的 探讨孕妇牙周状况与早产及低体质量儿的关系.方法 收集出现先兆早产的孕妇,选择其中出现早产或低体质量新生儿的孕妇50例为早产组,以同期来医院足月待产的孕妇50例为足月产组.所有产妇分娩前均进行全口牙周检查,记录菌斑指数(PLI... 目的 探讨孕妇牙周状况与早产及低体质量儿的关系.方法 收集出现先兆早产的孕妇,选择其中出现早产或低体质量新生儿的孕妇50例为早产组,以同期来医院足月待产的孕妇50例为足月产组.所有产妇分娩前均进行全口牙周检查,记录菌斑指数(PLI)、牙石指数(CI)、牙龈出血指数(BI)、牙周探诊深度(PD)及临床附着丧失(CAL).检测2组孕妇外周血中炎症相关细胞因子肿瘤坏死因子α、前列腺素E2、基质金属蛋白酶-9和C反应蛋白的水平.将分娩孕周及新生儿体质量、牙周状况和外周血细胞因子水平分别做相关性分析.结果 与足月产组比较,早产组孕妇的牙周状况较差,PLI,BI,CI及牙周炎患病率均显著升高(P〈0.05);孕妇的PLI,BI,CI及牙周炎患病率与分娩孕周及新生儿体质量呈负相关.早产组外周血中炎症相关细胞因子水平均显著高于足月产组;孕妇外周血中细胞因子水平与PLI,BI,CI和牙周炎患病率呈正相关,与分娩孕周及新生儿体质量呈负相关.结论 孕妇牙周状况与早产低体质量新生儿间可能存在一定的相关性;牙周状况对早产及低体质量儿的影响可能与外周血中炎症相关细胞因子的改变有关. 展开更多
关键词 牙周病 婴儿 早产 肿瘤坏死因子Α 前列腺素E2 基质金属蛋白酶 C反应蛋白
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不同抗原对猪瘟病毒抗体ELISA检测效果的影响 预览 被引量:1
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作者 曾小宇 苗银萍 +2 位作者 赵冰琳 魏卓 赵林萍 《中国兽药杂志》 北大核心 2017年第6期19-26,共8页
为研究不同抗原对猪瘟病毒抗体ELISA检测效果的影响,通过原核表达获取猪瘟病毒重组E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白,大小分别约为35、42、16和80kD。经Ni-NTA亲和层析柱纯化并利用BandScan软件进行计算,纯度均在90%以上,满足ELIS... 为研究不同抗原对猪瘟病毒抗体ELISA检测效果的影响,通过原核表达获取猪瘟病毒重组E2蛋白、E0蛋白、C蛋白和NS5B蛋白,大小分别约为35、42、16和80kD。经Ni-NTA亲和层析柱纯化并利用BandScan软件进行计算,纯度均在90%以上,满足ELISA检测包被用原料纯度的要求。将上述4种蛋白作为包被抗原进行ELISA.以10份企业阳性质控品血清和10份企业阴性质控品血清为检验指标比较不同抗原对猪瘟病毒抗体ELISA检测效果的影响。结果以E2蛋白为原料的包被板检测质控血清时,灵敏度和特异性均达到80%以上,能够满足猪瘟病毒抗体ELISA检测的要求,故选择E2蛋白作为包被抗原并进行相关检测试剂的研制。用研制的试剂与国际知名度高、产品质量好的美国IDEXX同类试剂对432份临床猪血清进行符合性检测.结果与美国IDEXX试剂的阳性符合率为95.53%,阴性符合率为86.56%,总符合率为91.67%,两种试剂检测结果具有较高的一致性。试验表明,用E2蛋白为包被抗原对猪瘟病毒抗体进行ELISA检测的效果最好,制备的检测试剂可用于临床猪瘟病毒血清抗体的检测。为今后猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂的进一步研制奠定了基础。 展开更多
关键词 ELISA 检测效果 原核表达 E2蛋白
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风疹病毒糖蛋白2-核蛋白优势抗原表位原核可溶性融合表达与血清学诊断研究 被引量:3
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作者 孙卫国 杨栗坤 +2 位作者 刘艳华 熊志红 张灵霞 《中国卫生检验杂志》 CAS 2016年第16期2351-2354,共4页
目的利用原核系统对风疹病毒E2-C(糖蛋白2-核蛋白)融合蛋白优势抗原表位肽段进行表达和纯化,开发用于临床检测风疹病毒特异性抗体的抗原。方法通过生物信息学预测E2-C优势抗原表位,根据原核系统表达特点进行序列优化,全基因合成获得... 目的利用原核系统对风疹病毒E2-C(糖蛋白2-核蛋白)融合蛋白优势抗原表位肽段进行表达和纯化,开发用于临床检测风疹病毒特异性抗体的抗原。方法通过生物信息学预测E2-C优势抗原表位,根据原核系统表达特点进行序列优化,全基因合成获得风疹病毒E2-C优势片段核酸序列,构建pET-DsbC(二硫键异构酶)-E2-C融合表达载体,在原核系统内进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的抗原性。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-E2-C经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测80份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-E2-C蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达75%(60/80),阴性检出率为100%,初步验证DsbC-E2-C优势抗原表位融合蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论获得融合蛋白DsbC-E2-C在大肠杆菌中高表达,高纯度重组蛋白抗原性和特异性比较强,利用其建立的Ig M捕获ELISA方法,可开发试剂盒用于检测风疹病毒的早期感染。 展开更多
关键词 风疹病毒 E2蛋白 C蛋白 融合表达
猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及优化 预览 被引量:2
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作者 冯春花 朱艳平 +1 位作者 郭东光 岳锋 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第3期608-614,共7页
以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0μg/mL和1∶200;最佳抗原包被... 以原核表达、纯化的猪瘟病毒(CSFV)E2主要抗原区蛋白为目标检测物,通过对各反应条件的筛选和优化,建立了检测CSFV抗体的间接ELISA检测方法。结果表明,本研究的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度分别为1.0μg/mL和1∶200;最佳抗原包被条件和最佳封闭时间均为37℃1h;最佳酶标二抗稀释度和作用时间分别为1∶10 000和37℃45min;阴性临界值判断标准为当D450nm〈0.30时猪血清样品为CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为4.8%和6.9%,表明该检测方法具有较高的稳定性;特异性试验结果表明,间接ELISA方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清均无交叉反应;应用该间接ELISA方法随机检测80份猪血清样品,与进口阻断ELISA试剂盒相比其阳性符合率为83.58%,阴性符合率为76.92%,总体符合率为80.25%。结果表明本试验建立的间接ELISA方法具有很好的临床应用价值。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 间接ELISA 抗体检测
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牛病毒性腹泻病毒E2抗原表位表达及验证 被引量:2
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作者 黄美玲 吴鹏 +4 位作者 李天森 张国奇 杨霞 陈创夫 盛金良 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期152-157,共6页
[目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SD... [目的]获得高效表达的重组牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)E2免疫抗原蛋白。[方法]应用软件分析BVDV-E2蛋白抗原表位,将富含抗原表位基因片段连接表达载体p GEX-4T-1,并转化至大肠杆菌(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot检测诱导表达蛋白,经镍柱分离纯化;以纯化蛋白为包被抗原,用间接ELISA检测抗原对免疫血清的反应性。[结果]成功克隆BVDV-E2抗原表位基因,并在大肠杆菌中高效表达,Western Blot和ELISA证实表达重组蛋白对BVDV阳性血清具有反应原性。[结论]获得大小为49.5 k Da的BVDV-E2抗原表位蛋白,并且该抗原稀释度在1:40,抗体稀释度在1:20时结合效果最佳。可用于后续的纳米抗体筛选的研究。 展开更多
关键词 抗原表位 E2蛋白 Western BLOT 间接ELISA
牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的亚细胞定位研究 预览
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作者 刁乃超 时坤 +5 位作者 李健明 李仲乐 姜园园 刘东旭 王春凤 杜锐 《中国兽药杂志》 北大核心 2016年第4期1-5,共5页
为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组... 为深入研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的生物学功能,了解其在哺乳动物细胞中的亚细胞定位情况,采用RT-PCR扩增牛病毒性腹泻病毒Changchun184株E_2基因,将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1/V5His A中,并进行酶切鉴定和测序分析,将构建的重组质粒pc DNA3.1/V5His A-E_2经脂质体介导转染至MDBK细胞。继续培养48h后,在激光共聚焦显微镜下观察E_2蛋白在细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,E_2蛋白在细胞核与细胞质中均有表达,且绿色荧光呈点状均匀分布。该研究为进一步研究牛病毒性腹泻病毒E_2蛋白的相关功能奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 亚细胞定位
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猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用 预览 被引量:8
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作者 李文良 毛立 +2 位作者 杨蕾蕾 张纹纹 江杰元 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第2期357-361,共5页
为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化。在首免后4周用猪瘟兔... 为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化。在首免后4周用猪瘟兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔,监测其体温变化,并运用RT-PCR检测家兔脾脏中病毒RNA。结果表明,E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体,但两组间差异不显著。攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状,1/5兔脾脏病毒阳性;E2+E0组兔均未出现发热症状,也未检测到C株病毒RNA。E0组不能诱导兔产生中和抗体,但也能提供部分保护(2/5)。可见,基于E2、E0的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,且两者联合使用具有协同作用,有望成为新型亚单位疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 猪瘟 亚单位疫苗 E2蛋白 E0蛋白 协同作用
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Caski细胞内Daxx与HPV16 E2蛋白的结合作用 预览
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作者 刘越 唐双阳 +4 位作者 刘安元 蔡恒玲 安振 刘志敏 万艳平 《微生物学免疫学进展》 2015年第2期4-6,共3页
目的研究人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白在Caski细胞内与Daxx的相互作用,探讨它们在HPV16所致宫颈癌发生发展中的作用。方法利用间接免疫荧光染色技术观察HPV16 E2和Daxx在Caski细胞中的分布或共定位;通过免疫共沉淀试验和免疫印迹分... 目的研究人乳头瘤病毒16型(HPV16)E2蛋白在Caski细胞内与Daxx的相互作用,探讨它们在HPV16所致宫颈癌发生发展中的作用。方法利用间接免疫荧光染色技术观察HPV16 E2和Daxx在Caski细胞中的分布或共定位;通过免疫共沉淀试验和免疫印迹分析HPV16 E2与Daxx在Caski细胞内的相互作用。结果在Caski细胞内,Daxx和HPV16 E2主要分布于胞浆,少数分布于胞核,且两种信号在细胞浆内有一定的共存;抗E2抗体能沉淀Daxx,反之抗Daxx抗体同样能够沉淀HPV16 E2。结论 HPV16 E2与Daxx在Caski细胞存在直接的相互作用。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒16型 CASKI细胞 E2蛋白 死亡结构域相关蛋白 结合作用
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