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An improved protein expression system for T3SS genes regulation analysis in Xanthomonas oryzae pv.oryzae 预览
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作者 XU Jin-bo ZHANG Cui-ping +5 位作者 WUNIERBIEKE Mei-li YANG Xiao-fei LI Yi-lang CHEN Xiao-bin CHEN Gong-you ZOU Li-fang 《农业科学学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第6期1189-1198,共10页
Xanthomonas oryzea pv.oryzae(Xoo)is the causal agent of bacterial blight of rice,which is a significant threat to many of rice-growing regions.The type Ⅲ secretion system(T3SS)is an essential virulence factor in Xoo.... Xanthomonas oryzea pv.oryzae(Xoo)is the causal agent of bacterial blight of rice,which is a significant threat to many of rice-growing regions.The type Ⅲ secretion system(T3SS)is an essential virulence factor in Xoo.Expression of the T3SS is often induced in the host environment or in hrp-inducing medium but is repressed in nutrient-rich medium.The elucidation of molecular mechanism underlying induction of T3SS genes expression is a very important step to lift the veil on global virulence regulation network in Xoo.Thus,an efficient and reliable genetic tool system is required for detection of the T3SS proteins.In this study,we constructed a protein expression vector pH3-flag based on the backbone of pHM1,a most widely used vector in Xoo strains,especially a model strain PXO99A.This vector contains a synthesized MCS-FLAG cassette that consists of a multiple cloning site(MCS),containing a modified pUC18 polylinker,and Flag as a C-terminal tag.The cassette is flanked by transcriptional terminators to eliminate interference of external transcription enabling detection of accurate protein expression.We evaluated the potential of this expression vector as T3SS proteins detection system and demonstrated it is applicable in the study of T3SS genes expression regulation in Xoo.This improved expression system could be very effectively used as a molecular tool in understanding some virulence genes expression and regulation in Xoo and other Xanthomonas spp. 展开更多
关键词 XANTHOMONAS ORYZAE pv.oryzae broad-host range VECTOR expression VECTOR T3SS GENES
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猫爪草酰基-Δ9脱氢酶基因植物表达载体的构建及瞬时表达 预览
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作者 岳敏 宋亚楠 +5 位作者 安茜 赵熙宁 薛金爱 季春丽 崔红利 李润植 《山西农业科学》 2019年第5期738-741,747共5页
猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检... 猫爪草种子能高水平积累棕榈油酸(C16∶1Δ9)和顺式-11-十八碳烯酸(C18∶1Δ11)等具有食品、医药和工业应用价值的ω-7脂肪酸(ω-7FA)。酰基-Δ9脱氢酶(acyl-Δ9 desaturase,Δ9D)底物特异性决定着植物细胞合成单烯脂肪酸的种类。为检测来自猫爪草的酰基-ACP-Δ9脱氢酶(MucACP-Δ9D)是否可异源表达用于在其他植物合成ω-7FA,文章构建了MucACP-Δ9D基因植物表达载体,并通过农杆菌介导在本氏烟草叶组织瞬时表达。用气相色谱(GC)检测烟叶脂肪酸成分,结果显示,野生型及空载体对照的ω-7FA总含量仅为0.4%;然而,MucACP-Δ9D瞬时表达的烟叶组织ω-7FA总含量提高到14.2%,其中,C16∶1Δ9和C18∶1Δ11含量分别达8.8%和5.4%。研究表明,MucACP-Δ9D可在异源组织催化棕榈油酸合成,可进一步用于其他油料作物的油脂遗传改良,以富集ω-7FA。 展开更多
关键词 酰基-Δ9脱氢酶 表达载体 本氏烟草 瞬时表达
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牛大力漆酶基因CsLAC17的克隆与载体构建
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作者 罗冬梅 赵亚文 +2 位作者 荆永琳 徐立 李志英 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1906-1912,共7页
为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋... 为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋白质。结构域分析表明,Cs LAC17蛋白的保守结构域具有漆酶典型结构域的特征--铜离子结合域(Cu-oxidase和Cu-oxidase-2)。同源序列分析表明,Cs LAC17蛋白序列与绿豆(Vigna radiata var. radiata)和野生大豆(Glycine soja)同源性为88%、藜豆(Mucuna pruriens)87%、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 85%。组织特异性表达分析显示,CsLAC17在茎中表达量最高,叶中表达量次之,根中较少。此外,进一步构建了pBI121-CsLAC17过表达载体并转入农杆菌。本研究为日后CsLAC17基因的功能验证以及为牛大力开展分子生物学研究提供帮助。 展开更多
关键词 牛大力 CsLAC 17 基因克隆 组织表达特异性 表达载体
乳酸菌用作口服疫苗表达载体的应用研究进展 预览
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作者 亓秀晔 刘乃芝 +2 位作者 程福亮 徐海燕 谷巍 《中国酿造》 CAS 北大核心 2019年第6期18-23,共6页
乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,被公认为绿色安全级微生物,可以在机体内粘附、定植和复制,益生作用和免疫原性使其成为最有前景的活菌载体。利用基因工程手段插入外源基因制备重组乳酸菌口服疫苗,能够持续刺激机体分泌特异性... 乳酸菌是人和大多数动物肠道内的常见细菌,被公认为绿色安全级微生物,可以在机体内粘附、定植和复制,益生作用和免疫原性使其成为最有前景的活菌载体。利用基因工程手段插入外源基因制备重组乳酸菌口服疫苗,能够持续刺激机体分泌特异性抗原蛋白,多个基因的插入甚至能达到一免治多病的目的。口服免疫效果优于注射免疫,治疗成本也大大降低。该文论述了乳酸菌活载体疫苗的优势,对乳酸菌表达载体在动物疫病防控及代谢产物调控上的应用等方面的研究进行综述,并对其应用前景进行分析和展望。 展开更多
关键词 乳酸菌 口服疫苗 表达载体 动物疫病
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红花檵木LcFLS1基因的克隆及其表达与转化研究 预览
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作者 荣朵艳 张翔 +3 位作者 潘婷 王菊凤 杨港 张邦跃 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期404-412,共9页
该研究以红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)为材料,根据转录组测序结果和PCR方法克隆到1个黄酮醇合成酶(FLS)同源基因,命名为LcFLS1。生物信息学分析显示,LcFLS1的开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸。氨基酸序列分析显示,LcF... 该研究以红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)为材料,根据转录组测序结果和PCR方法克隆到1个黄酮醇合成酶(FLS)同源基因,命名为LcFLS1。生物信息学分析显示,LcFLS1的开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸。氨基酸序列分析显示,LcFLS1具有典型的2-酮戊二酸和铁依赖性双加氧酶结构域;蛋白结构预测表明,球形蛋白结构的核心区域存在10个与2-酮戊二酸配体互作的位点。进化树分析结果表明,LcFLS1与茶树(Camellia sinensis)等木本植物的亲缘关系较近,而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)等草本植物的亲缘关系较远。荧光定量PCR检测显示,LcFLS1在红花檵木的花中相对表达量最高,而在茎中最少。成功构建了LcFLS1基因的过表达载体pLcFLS1-SUPER1300,经农杆菌侵染花序法将pLcFLS1-SUPER1300质粒转入拟南芥中获得转基因植株,PCR鉴定表明获得了转LcFLS1基因拟南芥阳性植株。该研究结果为红花檵木黄酮醇的生物合成机制研究,以及药用价值的开发利用奠定了基础。 展开更多
关键词 红花檵木 黄酮醇合成酶 生物信息学 表达载体
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马铃薯StmiR166b靶基因的鉴定及其表达分析
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作者 武亮亮 张宁 +4 位作者 朱熙 马瑞 唐勋 杨江伟 司怀军 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1333-1343,共11页
为阐明马铃薯(Solanum tuberosum L.)StmiR166b的生物学功能,以栽培品种‘甘农薯2号’试管苗为试验材料,采用定量PCR技术检测StmiR166b及其靶基因StHB14、StHB15在不同组织中的差异表达;利用pRS300质粒为模板,通过over-lapping PCR技术... 为阐明马铃薯(Solanum tuberosum L.)StmiR166b的生物学功能,以栽培品种‘甘农薯2号’试管苗为试验材料,采用定量PCR技术检测StmiR166b及其靶基因StHB14、StHB15在不同组织中的差异表达;利用pRS300质粒为模板,通过over-lapping PCR技术克隆了包含StmiR166b-StmiR166b^*成熟体序列的前体结构,构建了其人工表达载体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化马铃薯获得了转基因植株。结果表明,StmiR166b及其靶基因StHB14和StHB15在马铃薯根、茎和叶中均有表达,在转基因株系L1、L3中靶基因不同程度地下调表达;与非转基因对照相比,转基因株系的株高和根长变短,生长受到抑制。 展开更多
关键词 马铃薯 StmiR166b StHB14 StHB15 表达载体
蓖麻Na^+/H^+逆向转运蛋白基因NhaD克隆与表达载体构建
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作者 张丽雪 王晓宇 +3 位作者 李平 李惠根 丛娇娇 张继星 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期3132-3139,共8页
为发掘耐盐相关基因,以蓖麻叶片为材料,设计特异性引物,克隆蓖麻Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(NhaD),并对该序列进行生物信息学分析。结果表明,NhaD全长1 743 bp,可编码580个氨基酸。将其命名为Rc NhaD。其编码蛋白的分子量为61.821 kD,等... 为发掘耐盐相关基因,以蓖麻叶片为材料,设计特异性引物,克隆蓖麻Na^+/H^+逆向转运蛋白基因(NhaD),并对该序列进行生物信息学分析。结果表明,NhaD全长1 743 bp,可编码580个氨基酸。将其命名为Rc NhaD。其编码蛋白的分子量为61.821 kD,等电点(pI)值6.74。利用DNAMAN软件对该序列与其它植物氨基酸序列进行同源性比对,结果显示与木薯等植物的同源性在85%以上,该蛋白含有ArsB蛋白的功能域,属于ArsB/NhaD转运蛋白家族成员。对其二级结构分析显示该蛋白为疏水性蛋白,该蛋白具有11个跨膜区域,是典型的跨膜蛋白。根据Rc NhaD全长设计带有KpnⅠ与XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长,用KpnⅠ与XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-1301连接,成功构建了Rc NhaD的表达载体。本研究为进一步研究该基因功能提供指导。 展开更多
关键词 蓖麻(Ricinus communis L.) NA^+/H^+逆向转运蛋白 基因克隆 生物信息学分析 表达载体
gga-miRNA-155对MDCC-MSB1细胞增殖的影响 预览
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作者 余祖华 丁轲 +8 位作者 郁川 贾艳艳 何雷 廖成水 李静 张梦珂 邱静静 张春杰 程相朝 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第2期1-6,共6页
【目的】构建gga-miRNA-155前体基因(pre-gga-miRNA-155)真核表达载体,验证gga-miRNA-155在MDCC-MSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCC-MSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增gga-miRNA-155前体基因片段pre-gga... 【目的】构建gga-miRNA-155前体基因(pre-gga-miRNA-155)真核表达载体,验证gga-miRNA-155在MDCC-MSB1细胞中的表达效果,探究其对MDCC-MSB1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增gga-miRNA-155前体基因片段pre-gga-miRNA-155,并将其克隆入pMD-18T载体,构建克隆载体pMD-18T-pre-gga-miRNA-155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA真核表达载体和pMD-18T-pre-gga-miRNA-155,将pre-gga-miRNA-155酶切回收片段与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到MDCC-MSB1细胞中,应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测gga-mi-RNA-155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154 bp的鸡pre-gga-mi-RNA-155基因。成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,瞬时转染MDCC-MSB1细胞后gga-miRNA-155表达水平显著增加,且MDCC-MSB1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体,其可在MDCC-MSB1细胞中过表达gga-miRNA-155,且可促进MDCC-MSB1细胞的体外增殖。 展开更多
关键词 gga-miRNA-155 表达载体 MDCC-MSB1细胞 细胞增殖
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KPNA2表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞生长的影响 预览
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作者 董文刚 刘锐 +7 位作者 王飞 沈伟伟 黄强 李闯斌 李文波 王伟 薛云 高秋明 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第17期2988-2991,共4页
目的:通过分子克隆构建KPNA2过表达载体,探究其对骨肉瘤细胞143B生长的影响。方法:利用Trizol法提取Hela细胞总RNA,而后通过PCR反应扩增KPNA2基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1^+构建KPNA2过表达质粒。通过qPCR实验和Western blot... 目的:通过分子克隆构建KPNA2过表达载体,探究其对骨肉瘤细胞143B生长的影响。方法:利用Trizol法提取Hela细胞总RNA,而后通过PCR反应扩增KPNA2基因,将扩增产物克隆至表达载体pcDNA3.1^+构建KPNA2过表达质粒。通过qPCR实验和Western blot实验检测KPNA2过表达载体转染143B细胞后的表达效率。利用CCK-8、平板克隆形成实验检测143B细胞的增殖状况,利用流式细胞术检测143B细胞的周期分布。结果:qPCR实验和Western blot实验均表明KPNA2过表达质粒转染后,143B细胞内KPNA2表达水平显著上调。CCK-8、平板克隆形成实验结果证实KPNA2上调能够促进143B细胞增殖。流式细胞术结果表明过表达KPNA2能够加快143B细胞周期进程。结论:KPNA2能够促进骨肉瘤细胞系143B生长,为骨肉瘤早期诊断和靶向治疗提供实验依据和理论基础。 展开更多
关键词 KPNA2 骨肉瘤 表达载体 细胞生长
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利用转移PCR技术构建玉米SnRK2基因家族表达载体 预览
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作者 拓昊苑 路风中 +3 位作者 张元元 于好强 付凤玲 李晚忱 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1282-1290,共9页
在构建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表达载体的过程中,因为表达载体可供选择的多克隆位点较少,且有些还与目的基因同源,所以采用转移PCR(T-PCR)扩增技术替代通常的酶切连接方法。为避免错误连接或未连接的第一轮T-PCR中间... 在构建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表达载体的过程中,因为表达载体可供选择的多克隆位点较少,且有些还与目的基因同源,所以采用转移PCR(T-PCR)扩增技术替代通常的酶切连接方法。为避免错误连接或未连接的第一轮T-PCR中间产物对退火温度不同的第二轮扩增循环产生干扰,本研究对T-PCR接头引物3′-端和5′-端的两段序列及其退火温度、引物、供体质粒和目标质粒模板的浓度,特别是温度循环程序进行设计和筛选,并用扩增构建的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行菌液PCR和测序验证。结果表明,在两条引物3′-端序列理论退火温度相差不大的情况下,T-PCR第一轮扩增的退火温度以低于或接近其中较低的理论退火温度为宜。但在两条引物3′-端序列理论退火温度相差较大的情况下,则应高于其中较低的理论退火温度。T-PCR第二轮扩增的退火温度,适当低于两条引物理论退火温度的平均值。按优化的温度循环程序,从供体质粒pMD19-T扩增ZmSnRK2基因家族8个成员的编码序列,并整合到目标载体pHBT95启动子下游特异位点,重组率达60%以上。综上表明,T-PCR对没有适用多克隆位点的载体构建的实用性较强。本研究通过优化的温度循环程序为表达或诱变载体构建提供了一定的理论参考。 展开更多
关键词 表达载体 玉米 蔗糖非酵解型蛋白激酶 转移PCR(T-PCR)
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重组胰高血糖素样肽-1载体的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达 预览
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作者 袁婧 郭畅 +8 位作者 李昊翔 徐梦娇 丁艺 赵丽 赵志聪 张安驰 周天然 屠志刚 袁国跃 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第3期195-200,共6页
目的:构建及鉴定携带His标签的重组胰高血糖素样肽-1(modified glucagon-like peptide-1,mGLP-1)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌WB800N中的分泌表达。方法:经化学合成得到含有His标签及BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点的mGLP-1基因片段,将其酶切... 目的:构建及鉴定携带His标签的重组胰高血糖素样肽-1(modified glucagon-like peptide-1,mGLP-1)表达载体,实现其在枯草芽孢杆菌WB800N中的分泌表达。方法:经化学合成得到含有His标签及BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点的mGLP-1基因片段,将其酶切后插入含信号肽amy Q序列的大肠埃希菌-枯草芽孢杆菌双穿梭载体pHT43中,得到重组载体pHT43-mGLP-1;通过电转化方法将质粒pHT43-mGLP-1转化到枯草芽孢杆菌WB800N中,构建含有目的基因的重组菌株WB800N/pHT43-mGLP-1,利用聚合酶链式反应(PCR)、碱基测序、甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)及蛋白质印迹法鉴定重组的枯草芽孢杆菌。结果:菌落PCR和测序结果表明,阳性克隆质粒pHT43-mGLP-1成功转化进枯草芽孢杆菌WB800N;Tricine-SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测表明,重组菌株WB800N/mGLP-1培养上清液中有mGLP-1蛋白表达,且1 mmol/L IPTG诱导下蛋白表达量明显增加。结论:成功构建了携带mGLP-1基因的表达载体并实现了其蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,为后续动物实验和制备微生态活菌制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 胰高血糖素样肽-1 枯草芽孢杆菌 表达载体
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人铁氧还蛋白表达载体构建 预览
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作者 许兰 陈思航 +1 位作者 田瑞莹 尚书凤 《科技创新导报》 2019年第7期82-84,86共4页
目的为了将人铁氧还蛋白(adrenodoxin,FDX)在293T细胞中表达,扩增FDX的ORF,将FDX的ORF插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA的NotI/KpnI,构建表达载体。方法以GeneBank报道的FDX的mRNA序列(NM004109.5)为模板设计引物,在5’和3’分别引入限... 目的为了将人铁氧还蛋白(adrenodoxin,FDX)在293T细胞中表达,扩增FDX的ORF,将FDX的ORF插入到哺乳动物细胞表达载体pcDNA的NotI/KpnI,构建表达载体。方法以GeneBank报道的FDX的mRNA序列(NM004109.5)为模板设计引物,在5’和3’分别引入限制性酶切位点NotI和KpnI,从HepG2的cDNA中扩增FDX的ORF,将FDX的PCR产物和空载体pcDNA3.1用NotI和KpnI双酶切4 h,酶切产物用DNA回收试剂盒回收。将FDX的PCR酶切产物分别连接到空载体NotI/KpnI,连接产物转化DH5α,培养过夜。挑单克隆,用PCR鉴定阳性克隆并测序。结果经1%琼脂糖凝胶电泳和EB染色,观察到一500 bp条带,阳性克隆的测序结果与GeneBank报道的核酸序列一致。结论应用常规分子克隆方法已成功构建了FDX的真核表达载体pcDNA-FDX。 展开更多
关键词 铁氧还蛋白 细胞色素P450 表达载体
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Construction of plant expression vector of adketo gene driven by a tomato fruit-special promoter
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作者 Xin-Jun Chen Jing Huang +2 位作者 Wei Li Ke-Yan Zhong Xin-Zheng Gao 《海南医科大学学报(英文版)》 2019年第2期11-14,共4页
Objective:To construct the plant expression vector including Adketo gene from Adonis aestivalis and E8 promotor, and provide a new way for astaxanthin production by plant genetic engineering.Methods: The Adketo gene w... Objective:To construct the plant expression vector including Adketo gene from Adonis aestivalis and E8 promotor, and provide a new way for astaxanthin production by plant genetic engineering.Methods: The Adketo gene was clonied from Adonis aestivalis by RT-PCR and the 1.1 kb tomato E8 gene was amplified by PCR. then cloned into T vector.After the preliminary identification by Microbial PCR, the recombinant T- vectors were subjected to sequence analysis. Cut the E8 promoter and Adketo gene and inserted into the plant binary expression vector pBI121to obtain the recombinant expression vector. And then to identify the vector by microbial PCR detection and enzyme digestion.Results: Sequencing results analysis showed the right E8 and Adketo gene sequences, the identification by microbial PCR and digestion with restriction enzymes proved that the recombinant vector had the inserts with expected length of target fragments.Conclusion: The plant expression vector containing Adketo gene driven by fruit specific promoter E8 was successfully constructed. 展开更多
关键词 Adketo GENE EXPRESSION VECTOR E8 PROMOTER
甜橙成花关键基因CsFT的克隆分析与表达载体构建
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作者 郭鑫跃 陈伟 +2 位作者 杨小慧 刘勇 杨莉 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期478-486,共9页
FT被认为是汇集各个开花途径的关键因子,其超量表达可促进植物提早开花。本研究通过RT-PCR方法,以纽荷尔脐橙(Citrus sinensis (L.) Osbeck)叶片为材料,成功地克隆到了2个FT基因的cDNA序列,分别为534 bp和537 bp,各自编码177个和178个... FT被认为是汇集各个开花途径的关键因子,其超量表达可促进植物提早开花。本研究通过RT-PCR方法,以纽荷尔脐橙(Citrus sinensis (L.) Osbeck)叶片为材料,成功地克隆到了2个FT基因的cDNA序列,分别为534 bp和537 bp,各自编码177个和178个氨基酸,并对其进行了生物信息学相关分析。荧光定量分析了2个CsFT基因在脐橙不同器官的表达情况,结果表明二者在果皮、果肉、茎、叶、花中均有表达,但CsFT1基因在果肉中的表达量最高,CsFT2基因在叶中的表达量最高;这2个基因在不同花器官中均有表达,CsFT1基因在花瓣中表达最高,CsFT2基因雌蕊中表达最高,并都在开花后第7天的花器官中达到最大,随后下降。将2个基因连接到植物表达载体pCAMBIA1301上,得到了过量表达载体pCAMBIA1301-35S-CsFT1和pCAMBIA1301-35S-CsFT2,并成功转化农杆菌,为下一步转化柑橘获得转基因植株提供了技术参考。 展开更多
关键词 柑橘 FT基因 基因克隆 表达 载体构建
基于Ⅱ型毒素–抗毒素系统构建ε–聚赖氨酸合成酶的链霉菌稳定表达载体 预览
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作者 周奕阳 李鹏 +3 位作者 谭之磊 邓子新 贾士儒 欧竑宇 《湖南农业大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期149-153,共5页
鉴于ε-聚赖氨酸发酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素-抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因 relB2sca与ε-聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,并导入淀... 鉴于ε-聚赖氨酸发酵过程对抗生素压力条件的依赖,尝试基于Ⅱ型毒素-抗毒素系统(relBE2sca)构建无选择压力下稳定表达ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌表达系统:将抗毒素基因 relB2sca与ε-聚赖氨酸合成酶基因pls克隆至表达载体,并导入淀粉酶产色链霉菌pls缺失突变株,将毒素基因relE2sca整合至淀粉酶产色链霉菌的染色体(突变株YY3),获得包含ε-聚赖氨酸稳定表达的突变株YY1。经过多次传代,相比对照组,在不含抗生素压力条件下,突变株YY1依然能够稳定地合成ε-聚赖氨酸。毒素蛋白RelE2sca的表达会导致变铅青链霉菌、阿维链霉菌和链霉菌FR-008等常用链霉菌异源表达宿主的死亡,提示基于Ⅱ型毒素-抗毒素系统(relBE2sca)可作为一种通用的遗传标记。 展开更多
关键词 链霉菌 表达载体 Ⅱ型毒素–抗毒素系统 ε–聚赖氨酸合成酶 质粒稳定性
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马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建 预览
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作者 加尔肯 库来汗·巴依多拉 +3 位作者 冉多良 艾海提·亚森 布力布力汗 刘建华 《草食家畜》 2019年第4期25-29,共5页
马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM... 马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大。最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性。为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30。通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定。结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 EHV-1 ORF30基因 原核表达 载体
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cdh 5-mRNA在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达 预览
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作者 吴西军 姚冬静 +5 位作者 刘庆 杨小燕 王念雪 王一慧 舒莉萍 何志旭 《贵州医科大学学报》 CAS 2019年第11期1241-1246,共6页
目的:探讨cdh 5-mRNA在野生型斑马鱼胚胎期发育过程中的表达模式。方法:收取tuebingen野生型斑马鱼多个发育时间节点的胚胎,提取其总RNA,体外逆转录后RT-PCR扩增cdh 5基因片段,将cdh 5基因片段插入pCS^2+质粒载体中,挑选阳性单克隆菌落... 目的:探讨cdh 5-mRNA在野生型斑马鱼胚胎期发育过程中的表达模式。方法:收取tuebingen野生型斑马鱼多个发育时间节点的胚胎,提取其总RNA,体外逆转录后RT-PCR扩增cdh 5基因片段,将cdh 5基因片段插入pCS^2+质粒载体中,挑选阳性单克隆菌落,通过双酶切、测序等方法鉴定pCS^2+-cdh 5重组质粒;重组质粒单酶切后用T3RNA体外转录体系制备地高辛标记的cdh 5基因的反义mRNA探针,对斑马鱼全胚胎进行原位杂交,显微镜下观察各发育节点胚胎cdh 5-mRNA杂交信号并拍照。结果:构建并鉴定了pCS^2+-cdh 5重组质粒,各发育节点胚胎经全胚胎原位杂交后发现在tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育至3.7~12 hpf时cdh 5-mRNA呈低丰度泛在表达,18~36 hpf时在后脑及血管处表达、在造血系统高表达,48 hpf后仅在脑部和血管处低表达。结论:在野生型斑马鱼胚胎期发育过程中可以检测到cdh 5-mRNA在后脑和血管处有表达,并且在造血组织高表达。 展开更多
关键词 斑马鱼 胚胎发育 cdh 5基因 基因表达 遗传载体 全胚胎原位杂交
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结球甘蓝BoTCTP基因表达载体的构建及转化芥蓝的研究
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作者 王静静 曹必好 +3 位作者 陈国菊 陈长明 陈清华 雷建军 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期23-33,共11页
芥蓝(Brassica alboglabra)是十字花科重要蔬菜之一,在栽培过程中常常会遭受各种逆境的严重影响,给芥蓝的生产造成很大的损失。为提高芥蓝对逆境胁迫的抵抗能力,本研究根据结球甘蓝翻译控制肿瘤蛋白基因(translationally controlled tum... 芥蓝(Brassica alboglabra)是十字花科重要蔬菜之一,在栽培过程中常常会遭受各种逆境的严重影响,给芥蓝的生产造成很大的损失。为提高芥蓝对逆境胁迫的抵抗能力,本研究根据结球甘蓝翻译控制肿瘤蛋白基因(translationally controlled tumor protein cloned from Brassica oleracea, BoTCTP)序列设计特异引物,经PCR扩增得到目的片段,然后构建过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法导入芥蓝中,并对其转基因植株进行了分子生物学鉴定。研究结果显示,4株外源目的基因已经整合到受体基因组中,1株以双拷贝形式存在,另外3株以单拷贝形式存在。转基因植株的长势旺盛,生长速率加快,叶面积较大,在逆境胁迫(高低温,盐碱,干旱,重金属等)下转基因植株对胁迫的耐受性明显优于对照植株,从而表明BoTCTP基因与芥蓝的生长密切相关,并对芥蓝的抗逆性起调控作用。本研究结果为芥蓝抗逆性的进一步研究提供了科学依据。 展开更多
关键词 翻译控制肿瘤蛋白基因(TCTP) 表达载体 芥蓝 遗传转化 生长速度 抗逆性
虾青素合成相关酶基因Adketo果实特异表达载体的构建 预览
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作者 陈新君 黄静 +2 位作者 李伟 钟克焱 高新征 《海南医学院学报》 CAS 2019年第2期90-93,共4页
目的:采用克隆的番茄E8启动子和夏侧金盏花虾青素合成相关酶基因Adketo构建果实特异表达载体,为利用植物基因工程进行虾青素生产提供新途径。方法:采用RT-PCR的方法,从夏侧金盏花中克隆到虾青素合成相关酶基因Adketo,同时以番茄基因组DN... 目的:采用克隆的番茄E8启动子和夏侧金盏花虾青素合成相关酶基因Adketo构建果实特异表达载体,为利用植物基因工程进行虾青素生产提供新途径。方法:采用RT-PCR的方法,从夏侧金盏花中克隆到虾青素合成相关酶基因Adketo,同时以番茄基因组DNA为模板PCR扩增果实特异性启动子E8,克隆进T载体,菌液PCR初步鉴定后测序,序列分析。从T载体切下的E8启动子和Adketo基因经回收后同时插入到植物双元表达载体pBI121上,获得重组载体,然后进行菌液PCR检测和酶切鉴定。结果:测序结果分析显示获得正确的E8和Adketo基因序列。重组质粒经菌液PCR检测及酶切鉴定均获得预期大小条带。结论:该实验成功构建了番茄果实特异性E8启动子驱动虾青素合成相关酶基因Adketo的植物表达载体。 展开更多
关键词 番茄E8启动子 植物双元表达载体 Adketo基因
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表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究
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作者 孙化露 李树纯 +4 位作者 于泽坤 李明义 李思菲 崔现兰 刘阳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期440-452,共13页
为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IB... 为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组 肠炎沙门菌 传染性法氏囊病毒 表达载体
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