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口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立 预览
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作者 王韦华 刘桂梅 +3 位作者 吴奇强 黄鹏波 白鸽 王国超 《西北农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第12期1736-1744,共9页
旨在建立口蹄疫病毒可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。以猪口蹄疫灭活疫苗为材料,设计两对RT-LAMP引物,建立FMDV可视化RT-LAMP检测方法,并与普通PCR检测方法进行比较,同时进行特异性试验和敏感性试验。对从油佐剂... 旨在建立口蹄疫病毒可视化逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法。以猪口蹄疫灭活疫苗为材料,设计两对RT-LAMP引物,建立FMDV可视化RT-LAMP检测方法,并与普通PCR检测方法进行比较,同时进行特异性试验和敏感性试验。对从油佐剂疫苗中提取FMDV核酸方法进行比较结果发现,用商品化试剂盒提取时,3种样品处理方法对病毒RNA提取量没有显著影响;Trizol法提取RNA时,从油佐剂疫苗中直接提取,获得的RNA量最大,与其他2种方法差异极显著(P<0.01)。建立了口蹄疫病毒可视化RT-LAMP方法,该方法检测到模板RNA最低稀释度为10-9,比RT-PCR方法灵敏10倍,特异性好。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 逆转录环介导等温核酸扩增 检测
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口蹄疫病毒real—time RT—RPA检测方法的建立与应用 被引量:4
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作者 杨洋 秦晓东 +3 位作者 宋一鸣 施冲旭 李彦敏 张志东 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2017年第5期172-176,共5页
为了建立口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,试验以FMDV 3D基因作为靶基因设计引物和探针,建立了一种新的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real—time RT—RPA)检测方法,该方法在40℃恒温条件下20min内完成检测,并评估了该方法的... 为了建立口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,试验以FMDV 3D基因作为靶基因设计引物和探针,建立了一种新的实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增(real—time RT—RPA)检测方法,该方法在40℃恒温条件下20min内完成检测,并评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明:该检测方法能特异性检测FMDV,敏感性为500拷贝/反应,而且具有很好的重复性。利用该方法对采集的临床样品进行检测,检测结果与RT—qPCR检测结果具有100%的符合率。说明real—time RT—RPA方法具有简单、快速、特异性强的优点,是一种潜在的FMDV快速检测方法。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增 实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增 口蹄疫病毒(FMDV) 快速检测
壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs免疫豚鼠的免疫增强作用 被引量:1
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作者 朱向涛 孙世琪 +2 位作者 吴颉 郭慧琛 马军武 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2017年第10期1240-1244,共5页
为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍... 为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍免疫豚鼠,免疫后测定被免疫豚鼠的T淋巴细胞增殖情况,检测FMDV特异性抗体水平,观察计算攻毒后保护率。结果,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体,T淋巴细胞增殖效果高于ISA201佐剂。此外,Chitosan B佐剂组优于Chitosan A佐剂组。上述结果说明,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型FMD VLPs具有免疫增强作用,可以诱导VLPs的体液免疫和细胞免疫应答;壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂,可以成为FMDV疫苗的候选佐剂。 展开更多
关键词 壳聚糖季铵盐凝乳胶微球 口蹄疫病毒 病毒样颗粒 佐剂
口蹄疫病毒3C蛋白酶结构与功能及应用研究进展 预览 被引量:3
4
作者 姚怀兵 赵毅 +4 位作者 刘梦丽 朱妍 刘宏 任方 黄炯 《动物医学进展》 北大核心 2017年第3期102-106,共5页
口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一,在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白,降解特定的蛋白质,是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白... 口蹄疫病毒(FMDV)3C蛋白酶是FMDV基因组编码中具有酶学活性的病毒产物之一,在FMDV编码蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内大量扩增中发挥着重要作用。3C蛋白酶能剪切多聚蛋白,降解特定的蛋白质,是宿主细胞中重要的毒力因子。3C蛋白酶能调控蛋白的转录和翻译,使宿主细胞内的干扰素等多种抗病毒基因低水平表达,使FMDV逃避宿主的天然免疫。论文主要综述了FMDV 3C蛋白酶的结构、生物学功能,并介绍了其在研制新型疫苗中的应用,以期为今后FMDV 3C蛋白酶的研究、新型疫苗的研发提供参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3C蛋白酶 结构 功能 应用
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口蹄疫病毒P1结构蛋白和3A非结构蛋白研究进展 预览
5
作者 姚怀兵 赵毅 +3 位作者 李金娜 刘宏 任方 黄炯 《动物医学进展》 北大核心 2017年第6期66-70,共5页
口蹄疫病毒(FMDV)P1基因所编码的结构蛋白是FMDV衣壳的主要蛋白,是其主要抗原位点所在的区域,决定着FMDV的抗原性,3A非结构蛋白能与宿主细胞结合,其特征性变化与病毒的表型变化密切相关,影响着宿主嗜性和致病力,P1和3A基因都是F... 口蹄疫病毒(FMDV)P1基因所编码的结构蛋白是FMDV衣壳的主要蛋白,是其主要抗原位点所在的区域,决定着FMDV的抗原性,3A非结构蛋白能与宿主细胞结合,其特征性变化与病毒的表型变化密切相关,影响着宿主嗜性和致病力,P1和3A基因都是FMDV研究的热点。论文综述了FMDVP1和3A基因及其所编码蛋白的结构、抗原特性及其生物学功能的研究现状,为后续FMDV研究提供参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 P1结构蛋白 3A非结构蛋白 抗原特性
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Th表位肽与聚肌胞苷酸对猪O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用 预览 被引量:1
6
作者 魏冰 陈文娟 +5 位作者 朱琳 李建军 吕传忠 任东兴 陈庚 付旭彬 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期163-168,共6页
[目的]本文旨在研究Th表位肽和聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]2种免疫增强剂对猪O型口蹄疫合成肽抗原细胞免疫和体液免疫的增强作用。[方法]将上述2种免疫增强剂分别与O型口蹄疫病毒(FMDV)合成肽抗原混合乳化,分组免疫Balb/c小鼠,分别... [目的]本文旨在研究Th表位肽和聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]2种免疫增强剂对猪O型口蹄疫合成肽抗原细胞免疫和体液免疫的增强作用。[方法]将上述2种免疫增强剂分别与O型口蹄疫病毒(FMDV)合成肽抗原混合乳化,分组免疫Balb/c小鼠,分别在免疫后7、14、21和28d检测小鼠血清中的VP1抗体、IL-4和IFN-γ水平,以及脾脏中T淋巴细胞转化率及脾脏组织形态变化。[结果]免疫后14dTh表位肽疫苗组和Poly(I:C)疫苗组血清VP1抗体水平显著高于普通疫苗组(P〈0.05),免疫后28dTh表位肽疫苗组显著高于Poly(I:C)疫苗组和普通疫苗组(P〈0.05)。细胞因子检测结果显示.免疫后14、21d Th表位肽与Poly(I:C)疫苗组IL-4含量显著高于普通疫苗组(P〈0.05),免疫后14dTh表位肽疫苗组IFN-γ含量明显高于其他组(P〈0.05),免疫后21dTh表位肽与Poly(I:C)疫苗组IFN-γ含量显著高于普通疫苗组(P〈0.05)。Th表位肽与Poly(I:C)均可使试验小鼠脾脏白髓区增大,着色加深,动脉周围淋巴鞘胀大,Poly(I:C)疫苗组淋巴细胞增殖系数显著高于其他各试验组(P〈0.05)。[结论]Th表位肽和Poly(I:C)对猪O型口蹄疫合成肽抗原均有显著免疫增强作用,而Th表位肽可延长体液免疫持续时间。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 Th表位肽 聚肌胞苷酸 疫苗免疫增强剂 合成肽疫苗
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口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重组腺病毒质粒的构建 预览
7
作者 贾俊涛 郭凤英 +2 位作者 乌伦吉如嘎 张小宇 陈金顶 《湖北农业科学》 2017年第16期3152-3154,共3页
根据si RNA设计原则,分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点,设计了2个si RNAs,并将si RNAs克隆到p SIREN-Shuttle中,获得2个si RNA重组表达载体p Shuttle-L和p Shuttle-2B。用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切si... 根据si RNA设计原则,分别选择O型FMDV的L和2B基因上保守序列作为可能的干扰位点,设计了2个si RNAs,并将si RNAs克隆到p SIREN-Shuttle中,获得2个si RNA重组表达载体p Shuttle-L和p Shuttle-2B。用限制性内切酶I-Ceu I和PI-Sce I双酶切si RNA重组表达载体和腺病毒质粒载体p Adeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组腺病毒质粒p Adeno-L和p Adeno-2B。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 RNA干扰 重组腺病毒质粒
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A型口蹄疫VP1基因的原核表达及纯化
8
作者 刘清源 向华 +4 位作者 黄元 陈晶 向蓉 郑海学 刘宇 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第5期173-176,共4页
为了研究A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的免疫原性,试验采用PCR方法从口蹄疫阳性质粒p MD-18-P1中扩增得到目的基因VP1,与原核表达载体p ET-28a连接,构建重组质粒p ET-28a-VP1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,筛选的阳性菌落用I... 为了研究A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的免疫原性,试验采用PCR方法从口蹄疫阳性质粒p MD-18-P1中扩增得到目的基因VP1,与原核表达载体p ET-28a连接,构建重组质粒p ET-28a-VP1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,筛选的阳性菌落用IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,通过Western-blot分析蛋白的免疫原性,并用镍亲和树脂纯化鉴定后的重组蛋白。结果表明:重组质粒p ET-28a-VP1经PCR及酶切鉴定证明构建正确;重组质粒能够在大肠杆菌中大量表达,表达产物的分子质量大小约为26 ku,且能被口蹄疫阳性血清识别;镍亲和树脂纯化的蛋白条带单一。说明该蛋白具有免疫学活性,且纯度较高。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒(FMDV) VP1基因 克隆表达 鉴定 纯化
重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌表达质粒的构建及表达 被引量:1
9
作者 李婧静 潘丽 +2 位作者 张中旺 张永光 吴润 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期678-683,共6页
本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达... 本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达载体p YA3341之中构建重组质粒p YA3341-VP1。然后,将构建的重组质粒p YA3341-VP 1采用化学法转入大肠杆菌X6212中,筛选阳性克隆。经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后,将重组质粒p YA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中,在转入X4550后第3.5小时加入IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western-blot分析。结果表明,成功构建了重组减毒沙门菌X4550-VP1载体,且表达产物大小为23 ku,与预期目的蛋白大小相符。上述结果表明,FMDV VP1基因在减毒鼠伤寒沙门菌中得到了成功表达。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 减毒鼠伤寒沙门菌
A型口蹄疫病毒抗体金标检测试纸条的研制 被引量:2
10
作者 孙燕燕 马米玲 +3 位作者 周广青 林密 曾巧英 蒋韬 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1123-1127,共5页
为快速、便捷地检测A型口蹄疫病毒(FMDV)抗体,将胶体金颗粒与口蹄疫A型疫苗株146S病毒粒子(FMDV-146S)结合,作为金标抗原(g FMDV-146S),与其抗体(FMDV-146S-Ab)分别作为检测带(T带)与质控带(C带)组装试纸条,通过检测已知各... 为快速、便捷地检测A型口蹄疫病毒(FMDV)抗体,将胶体金颗粒与口蹄疫A型疫苗株146S病毒粒子(FMDV-146S)结合,作为金标抗原(g FMDV-146S),与其抗体(FMDV-146S-Ab)分别作为检测带(T带)与质控带(C带)组装试纸条,通过检测已知各型FMDV阴性、阳性血清,水疱性口炎(VS)、猪水泡病(SVD)和羊传染性脓疱(CE)的阳性血清,验证其敏感性、特异性与稳定性;同时平行用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法进行对比检验。结果显示,该试纸条检测抗体效价最低达1∶128;SVD、VS、CE阳性血清及FMDV阴性血清的检测结果均为阴性,A型FMDV阳性血清100%显阳性,O型和Asia 1型的FMDV阳性血清仅出现10%的阳性率;该试纸条于4℃保存10个月,不同批次间、同一批次内的重复性检测结果差异不显著(P〉0.01);与LPB-ELISA检测结果的相关性良好,以此建立该试纸条的半定量比色卡。本试验制备的A型口蹄疫抗体金标检测试纸条具有较好的灵敏度、特异性、稳定性,能够准确评价A型口蹄疫疫苗的免疫效果。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 胶体金 免疫层析试纸
口蹄疫病毒研究进展 预览 被引量:8
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作者 李夏莹 郑鹭飞 +4 位作者 张秀杰 杨坤 汪其怀 周荣 吴添文 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第7期1910-1916,共7页
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由VI蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病,是全球范围内家畜及其产品贸易最大的羁绊。FMDV通过逃避宿主的免疫监视建立持续性感染... 口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由VI蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病,是全球范围内家畜及其产品贸易最大的羁绊。FMDV通过逃避宿主的免疫监视建立持续性感染,使患畜持续向外界排毒,成为传染源。作者查阅了近几年FMDV的国内外研究进展,对其流行病学、病原学及致病机理进行了概述。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒(FMDV) 流行病学 病原学 致病机理
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口蹄疫病毒链特异性荧光定量RT-PCR检测方法的建立
12
作者 王洪梅 贾春涛 +4 位作者 胡桂学 夏咸柱 于力 刘文浩 何洪彬 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第11期159-163,共5页
为了定量检测口蹄疫病毒(FMDV)的正链和负链RNA,揭示FMDV复制的分子机制,试验采用链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)方法提取了FMDV的RNA,在FMDV链特异性反转录引物的5'端引入非病毒基因序列标签进行反转录,再经链特异性ssqRT-PC... 为了定量检测口蹄疫病毒(FMDV)的正链和负链RNA,揭示FMDV复制的分子机制,试验采用链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)方法提取了FMDV的RNA,在FMDV链特异性反转录引物的5'端引入非病毒基因序列标签进行反转录,再经链特异性ssqRT-PCR扩增进行灵敏性、特异性、重复性检测。结果表明:FMDV基因组正链、负链RNA的链特异性ssqRT-PCR方法构建成功,该方法对FMDV正链和负链RNA检测的灵敏度达到1×10^1拷贝,具有较好的重复性和特异性。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒(FMDV) 链特异性 非病毒基因序列标签 荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR) 基因组RNA 检测方法
口蹄疫病毒核酸试纸条检测方法的建立 预览 被引量:1
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作者 龚真莉 蒋韬 +3 位作者 祁淑芸 陈国栋 刘艳红 李勇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第9期2292-2297,共6页
本研究通过核酸探针与免疫层析相结合的方法,建立了一种简单、敏感、特异的检测口蹄疫病毒的方法。试验利用RT-PCR方法获得口蹄疫病毒3D核苷酸片段,在引物中设计了灵敏度高、特异性好的核酸探针——生物素和地高辛,使扩增产物结合探针... 本研究通过核酸探针与免疫层析相结合的方法,建立了一种简单、敏感、特异的检测口蹄疫病毒的方法。试验利用RT-PCR方法获得口蹄疫病毒3D核苷酸片段,在引物中设计了灵敏度高、特异性好的核酸探针——生物素和地高辛,使扩增产物结合探针。利用胶体金的放大原理将链霉亲和素与金颗粒形成胶体金混合物,从而与RT-PCR产物中的生物素探针结合。硝酸纤维素膜上端标记生物素化山羊抗兔IgG作为指控条带,下端标记抗地高辛抗体以捕获RT-PCR产物中的地高辛探针。组装金标试纸条,检测RT-PCR产物,结果表明该核酸试纸条可以检测到0.3×10^-3-3×10^-3μg/μL,敏感性高于琼脂糖凝胶电泳,两种方法的符合率高,核酸试纸条检测方法是一种敏感性高、成本低且费时短的新型检测方法。该方法为口蹄疫病毒检测提供了一种新的思路。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D基因 核酸试纸条 生物素探针 地高辛探针
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Effect of amino acid mutation at position 127 in 3A of a rabbitattenuated foot-and-mouth disease virus serotype Asia1 on viral replication and infection 预览
14
作者 Aiguo Xin Mingwang Zhu +5 位作者 Qi Hu Haisheng Miao Zhenqi Peng Yuwen He Lin Gao Huachun Li 《中国病毒学:英文版》 CAS CSCD 2014年第5期291-298,共8页
An amino acid mutation(R127→I) in the 3A non-structural protein of an FMDV serotype Asia1 rabbit-attenuated ZB strain was previously found after attenuation of the virus. To explore the effects of this mutation on vi... An amino acid mutation(R127→I) in the 3A non-structural protein of an FMDV serotype Asia1 rabbit-attenuated ZB strain was previously found after attenuation of the virus. To explore the effects of this mutation on viral replication and infection, the amino acid residue isoleucine(I) was changed to arginine(R) in the infectious cDNA clone of the rabbit-attenuated ZB strain by sitedirected mutagenesis, and the R127-mutated virus was rescued. BHK monolayer cells and suckling mice were inoculated with the R127-mutated virus to test its growth property and pathogenicity, respectively. The effects of the R127 mutation on viral replication and virulence were analyzed. The data showed that there was a slight difference in plaque morphology between the R127-mutated and wild-type viruses. The growth rate of the mutated virus was lower in BHK-21 cells and its virulence in suckling mice was also attenuated. This study indicates that the R127 mutation in 3A may play an important role in FMDV replication in vitro and in pathogenicity in suckling mice. 展开更多
关键词 foot-and-mouth disease virus(FMDV) 3A protein MUTATION REPLICATION ability VIRULENCE
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清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP1-VP4抗原中的作用 预览
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作者 高云欢 李娜 +3 位作者 董昌海 唐然肖 李丽敏 王家鑫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期129-135,共7页
为研究清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP-VP4融合蛋白中的作用,构建了pET一32a-VP1-VP4原核表达系统,以此获得VP1-VP4融合蛋白。制备骨髓源树突状细胞(BMDCs)和淋巴结T细胞,首先用清道夫受体抑制剂poly(I)处理.BMDCs,然后再将VP... 为研究清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP-VP4融合蛋白中的作用,构建了pET一32a-VP1-VP4原核表达系统,以此获得VP1-VP4融合蛋白。制备骨髓源树突状细胞(BMDCs)和淋巴结T细胞,首先用清道夫受体抑制剂poly(I)处理.BMDCs,然后再将VPl-VP4.融合蛋白负载经poly(I)处理后的BMDCs,并与淋巴结T细胞共培养,收集不同时间点的共培养上清液,用ELISA检测其中IFN-γ含量。结果显示,经poly(I)处理的试验组在每个时间点产生的IFN-γ含量均明显高于对照组,且差异极显著(P【0.01)。表明清道夫受体可识别口蹄疫病毒VPl-VP4融合蛋白,并在BMDCs提呈VPl-VP4抗原的过程中发挥负调节作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1-VP4融合蛋白 树突状细胞 抗原提呈 T细胞
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O型口蹄疫病毒3D基因荧光定量PCR方法的建立及应用 预览 被引量:3
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作者 曹丽娟 倪伟 +3 位作者 史慧君 马世伟 乔军 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期34-39,共6页
为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因3 D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180bp的基因片段... 为建立快速检测抗FMDV转基因猪中O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的荧光定量PCR方法,本试验选择FMDV结构蛋白基因3 D的核苷酸序列设计特异性引物,经过RNA抽提、反转录成cDNA、PCR扩增,扩增出了大小为180bp的基因片段。将回收的目的片段与pMD18-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为FMDV的阳性重组质粒。将验证正确的重组质粒10倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量PCR试验,建立FMDV 3 D基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度。试验结果显示标准曲线的回归方程为Y=-3.727X+32.04,回归系数R2=0.980,熔解曲线为单一峰。建立的荧光定量PCR方法的灵敏度为1.2×101拷贝/μL,只与FMDV反应。结果表明,建立的荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测FMDV在动物组织细胞中的含量提供了技术方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 荧光定量PCR 重组质粒 标准曲线
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口蹄疫病毒Hankou/99株基因组全序列测定与基因特征分析 预览
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作者 曾江勇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期74-80,共7页
本研究主要对口蹄疫病毒(FMDV)Hankou/99株全基因序列进行测定,通过基因序列分析,确定其基因型,丰富了FMDV基因库,为研究猪源FMDV的分子变异、感染性分子克隆及致病机理奠定基础。从感染FMDV Hankou/99株的细胞液中提取RNA,通过RT-PCR技... 本研究主要对口蹄疫病毒(FMDV)Hankou/99株全基因序列进行测定,通过基因序列分析,确定其基因型,丰富了FMDV基因库,为研究猪源FMDV的分子变异、感染性分子克隆及致病机理奠定基础。从感染FMDV Hankou/99株的细胞液中提取RNA,通过RT-PCR技术,获得猪FMDV Hankou/99分离株覆盖全基因组的5个cDNA片段(S、L、C、D、E),分别对这些片段进行克隆和序列测定。结果显示,FMDV Hankou/99株全基因组长8099bp;5′NCR长1040bp,开放阅读框长6966bp;3′NCR长93bp,其后是30个碱基的连续poly(A)结构。通过与参考株基因组结构比较分析,显示其在分类地位上属于O型FMDV,并与猪源FMDV毒株OLZ、TW/97同源性较高,特别是3A区域上都有30bp的缺失。另外,通过与9个参考株的VP1系统发生树分析,显示其与OLZ、TW/97、O/Akesu/58、O/OMⅢ4个毒株为同一基因型。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 Hankou/99株 全基因组 序列测定 VP1
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A型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力评价 被引量:1
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作者 唐华 刘新生 +7 位作者 方玉珍 蒋守田 潘丽 吕建亮 张中旺 周鹏 张永光 王永录 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期596-607,共12页
【目的】研制A型口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)新型合成肽疫苗,为畜牧业减少经济损失。【方法】应用两种含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)AF/72株VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35]和3B[29-42]4个抗原... 【目的】研制A型口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)新型合成肽疫苗,为畜牧业减少经济损失。【方法】应用两种含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)AF/72株VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35]和3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合CpG寡聚脱氧核苷酸(5'-TCGCGAACGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3')在豚鼠上进行了免疫效力评价。【结果】2.5μg/只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻击,灭活苗组获得完全保护,其他组的保护效力仅为3/5;保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7%和36.6%,而其他组不超过27.7%,PBS组仅为18.1%。【结论】本研究筛选出一组免疫效力较好的口蹄疫A型合成肽疫苗,可以作为候选疫苗进行进一步评价。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 合成肽 体液免疫 细胞免疫 CPG寡聚脱氧核苷酸 CD4+T淋巴细胞
Generation of Monoclonal Antibodies against Non-structural Protein 3AB of Foot-and-Mouth Disease Virus 预览
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作者 Tong Lin Junjun Shao Huiyun Chang Shandian Gao Guozheng Cong Junzheng Du 《中国病毒学:英文版》 CAS CSCD 2012年第5期316-319,共4页
To identify linear epitopes on the non-structural protein 3AB of foot-and-mouth disease virus (FMDV), BABL/c mice were immunized with the 3AB protein and splenocytes of BALB/c mice were fused with myeloma Sp2/0 cells.... To identify linear epitopes on the non-structural protein 3AB of foot-and-mouth disease virus (FMDV), BABL/c mice were immunized with the 3AB protein and splenocytes of BALB/c mice were fused with myeloma Sp2/0 cells. Two hybridoma monoclonal antibodies (mAbs) cell lines against the 3AB protein of foot-and-mouth disease virus (FMDV) were obtained, named C6 and E7 respectively . The microneutralization titer was 1:1024 for mAb C6, and 1:512 for E7. Both mAbs contain kappa light chains, and were of subclass IgG2b. In order to define the mAbs binding epitopes, the reactivity of these mAbs against FMDV were examined by indirect ELISA. The results showed that both mAbs can react with FMDV, but had no cross-reactivity with Swine Vesicular Disease (SVD) antigens. The titers in abdomen liquor were 1:5×106 for C6 and 1:2×106 for E7. In conclusion, the mAbs obtained from this study are specific for the detection of FMDV, can be used for etiological and immunological researches on FMDV, and have potential use in diagnosis and future vaccine designs. 展开更多
关键词 单克隆抗体 口蹄疫病毒 非结构蛋白 ELISA检测 FMDV 反应性 细胞融合 MABS
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口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析 预览 被引量:3
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作者 骆继怀 杨利恒 +3 位作者 高闪电 独军政 常惠芸 薛慧文 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期7-12,共6页
采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和We... 采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应. 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D基因 非结构蛋白 反应原性分析
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