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分子排阻色谱(SEC)分离纯化口蹄疫病毒及其病毒样颗粒的比较
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作者 卢渊录 董虎 +4 位作者 李璐莹 郭慧琛 顾玉芳 孙世琪 杨玉莹 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期694-699,共6页
口蹄疫(FMD)是一种世界范围内的烈性偶蹄动物传染病。传统口蹄疫灭活疫苗可以降低疾病发病率,是目前预防口蹄疫的重要手段之一,但灭活疫苗存在病毒逃逸等生物安全问题,已经不适应我国重大疫病逐步净化的方针政策。口蹄疫病毒样颗粒(viru... 口蹄疫(FMD)是一种世界范围内的烈性偶蹄动物传染病。传统口蹄疫灭活疫苗可以降低疾病发病率,是目前预防口蹄疫的重要手段之一,但灭活疫苗存在病毒逃逸等生物安全问题,已经不适应我国重大疫病逐步净化的方针政策。口蹄疫病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)仅由病毒结构蛋白组成,不含遗传物质,是一种与天然病毒形态最为接近的抗原,其免疫原性与天然病毒相似,被视为安全性更高的疫苗。因此,FMDV-VLPs疫苗的纯化尤为重要。本文通过分子排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)系统对大肠杆菌组装的FMDV-VLPs进行纯化条件摸索。以FMDV为对照,对纯化后的FMDV-VLPs进行表征,结果显示,大肠杆菌组装的FMDV-VLPs与对照样品出峰位置基本一致,且粒径均在20~30 nm,同时初步计算出大肠杆菌组装效率大概为31.4%。该纯化过程具有操作简单、易于放大并且能够检测粒子大小等优点,可以使FMDV-VLPs疫苗更适合产业化生产以及更接近临床应用。 展开更多
关键词 口蹄疫 口蹄疫病毒 分子排阻色谱 病毒样颗粒 纯化
反转录环介导等温扩增技术快速检测猪水疱病毒方法的建立
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作者 丁小龙 程芳珍 +1 位作者 李茜 李国秀 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第21期73-75,178,共4页
为了建立一种针对猪水泡病毒(SVDV)的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),用于减少猪水泡病与口蹄疫因临床症状相似而造成的误诊,试验针对SVDV VP1基因序列设计4个LAMP引物,其中外侧引物用于SVDV PCR检测,并利用RT-LAMP和RT-PCR方法进... 为了建立一种针对猪水泡病毒(SVDV)的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),用于减少猪水泡病与口蹄疫因临床症状相似而造成的误诊,试验针对SVDV VP1基因序列设计4个LAMP引物,其中外侧引物用于SVDV PCR检测,并利用RT-LAMP和RT-PCR方法进行敏感性试验、特异性试验以及临床样品检测。结果表明:针对SVDV的RT-LAMP检测方法的敏感性是RT-PCR的10倍;RT-LAMP方法的特异性良好,与口蹄疫病毒无交叉反应;两种方法对临床样品检测的符合率为100%。说明试验建立的RT-LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速等特点,适合实验室和临床对SVDV的快速诊断。 展开更多
关键词 猪水泡病病毒 环介导等温扩增技术 敏感性 特异性 口蹄疫病毒
O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达 预览
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作者 李淑萍 孙世琪 +2 位作者 莫亚霞 胡永浩 郭慧琛 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期1-6,共6页
为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3... 为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增后进行酶切,用T4连接酶连接得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3。对重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3进行PCR鉴定并测序。用脂质体将重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)及Westernblot检测重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中得到表达。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 重组真核表达载体 pVAX-VP0VP1VP3构建和表达 病毒样颗粒
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广东地区猪群新发塞内卡病毒流行株的分离鉴定及遗传进化分析 预览
4
作者 林秀银 温肖会 +5 位作者 吕殿红 翟少伦 霍玮 翟颀 魏文康 杨彩娟 《广东农业科学》 CAS 2019年第6期125-132,共8页
【目的】检测广东两猪场新发的鼻镜与蹄冠水疱病病原,获得新发塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行株,为后续研究提供材料。【方法】应用SVA RT-PCR、荧光PCR等方法对采集的病料进行初步筛查,再将水泡皮进行处理接种于ST细胞、BHK-21细胞... 【目的】检测广东两猪场新发的鼻镜与蹄冠水疱病病原,获得新发塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)流行株,为后续研究提供材料。【方法】应用SVA RT-PCR、荧光PCR等方法对采集的病料进行初步筛查,再将水泡皮进行处理接种于ST细胞、BHK-21细胞上,用SVA特异性引物对细胞上清液进行扩增,测序并分析序列,采用蔗糖浓度梯度方法纯化病毒进行电子显微镜形态观察,并对病毒分离株的TCID50进行测定。【结果】经SVA RT-PCR与荧光PCR方法初步诊断该猪群为SVA感染;细胞接毒培养发现,自第6代起,细胞出现典型CPE,电镜观察可见25 nm左右的病毒颗粒,扩增序列提交NCBI Blastn比对鉴定为SVA;测得毒株SVA CH-GDBL1-2016的TCID50为106.8,毒株SVA CH-GDBL2-2016的TCID50为106.7。【结论】SVACH-GDBL1-2016和SVA CH-GDBL2-2016可为后续塞内卡病毒病的诊断和疫苗研制提供材料基础。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 口蹄疫 猪原发性水疱病 分离鉴定 序列分析
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口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定
5
作者 王省 李坤 +11 位作者 卢曾军 刘在新 李冬 包慧芳 李平花 孙普 白兴文 陈应理 付元芳 张婧 马雪青 曹轶梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期939-946,共8页
为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区... 为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 单个B细胞抗体技术 单克隆工程抗体 衣壳蛋白VP2
羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白3A-3B1-3B2抗体ELISA检测方法的建立
6
作者 孙雨 宋晓晖 +8 位作者 肖颖 王旭 董浩 王睿男 毕一鸣 蒋菲 李晓霞 杨林 王传彬 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第10期92-98,共7页
为建立检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法,通过优化抗原表达条件,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。该方... 为建立检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的间接ELISA方法,通过优化抗原表达条件,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。该方法对其他相关的羊类病毒病原无交叉反应,其重复性组内与组间变异系数均低于10%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,与国内市售的口蹄疫非结构蛋白抗体检测试剂盒进行比较,阳性样品符合率为96.67%,阴性样品符合率为94%,总符合率为95.33%。本研究建立的羊血清中口蹄疫病毒3A-3B1-3B2蛋白抗体间接ELISA检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单快速,具有较高的应用推广价值。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3A-3B1-3B2蛋白 可溶性表达 ELISA
凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒感染情况考察
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作者 王文晞 汪杨 《中国药师》 CAS 2019年第7期1375-1377,共3页
目的:评价来源于12个不同厂家的52批凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒感染情况。方法:采用逆转录PCR法检测凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒核酸残留;以地鼠肾细胞(BHK-21)作为宿主细胞,用待检样品感染宿主细胞,连续传代(5代)培养,显微观察病毒致细胞... 目的:评价来源于12个不同厂家的52批凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒感染情况。方法:采用逆转录PCR法检测凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒核酸残留;以地鼠肾细胞(BHK-21)作为宿主细胞,用待检样品感染宿主细胞,连续传代(5代)培养,显微观察病毒致细胞病变(CPE)程度评估口蹄疫病毒活性。结果:28批样品检测出口蹄疫病毒核酸残留,占样品总数的53.8%,未检测出有活性的口蹄疫病毒。结论:凝血酶冻干粉中口蹄疫病毒核酸残留检出率较高,提示该产品有一定的安全隐患,生产企业应在工艺中增加病毒灭活步骤,降低产品风险。 展开更多
关键词 凝血酶冻干粉 口蹄疫病毒 病毒活性
口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立 预览
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作者 刘立兵 王金凤 +5 位作者 张若曦 石蕊寒 韩庆安 李睿文 王建昌 袁万哲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期168-173,共6页
为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie ... 为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min~16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min~51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D基因 exo探针 实时荧光RT-RPA
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猪源DDX56对口蹄疫病毒的复制及其对病毒诱导的RLR通路调节的研究 预览
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作者 付绍祖 李露露 +2 位作者 张敬 李丹 郑海学 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1651-1658,共8页
DEAD框解旋酶56(DDX56)是一种RNA解旋酶,能参与RNA代谢和核糖体的合成。为研究猪源DDX56对口蹄疫病毒(FMDV)复制和对病毒诱导的RLR通路的影响,首先通过免疫共沉淀试验筛选与猪源DDX56互作的FMDV蛋白;接着利用Q-PCR和Western blot检测过... DEAD框解旋酶56(DDX56)是一种RNA解旋酶,能参与RNA代谢和核糖体的合成。为研究猪源DDX56对口蹄疫病毒(FMDV)复制和对病毒诱导的RLR通路的影响,首先通过免疫共沉淀试验筛选与猪源DDX56互作的FMDV蛋白;接着利用Q-PCR和Western blot检测过表达猪源DDX56对FMDV在PK-15细胞中复制的影响;然后利用双荧光素酶报告基因和Q-PCR检测猪源DDX56对病毒诱导的RLR通路的影响。结果显示,猪源DDX56能与FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A发生相互作用;过表达猪源DDX56能够促进FMDV的复制;过表达猪源DDX56能抑制仙台病毒(SeV)诱导的RLR通路的激活;猪源DDX56可以协同FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A抑制病毒诱导的Ⅰ型干扰素的产生。总之,猪源DDX56能与FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A互作而协同抑制Ⅰ型干扰素的产生,从而促进FMDV的复制。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 天然免疫 猪源DEAD框解旋酶56 干扰素 复制
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口蹄疫病毒衣壳蛋白氨基酸突变对病毒热稳定性的影响 预览
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作者 高雅 李平花 +7 位作者 马雪青 寻广谨 白兴文 孙普 袁红 卢曾军 刘在新 李冬 《动物医学进展》 北大核心 2019年第7期1-8,共8页
口蹄疫是世界范围内广泛流行的一种偶蹄动物的烈性传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV),它对热比较敏感,当温度高于30℃时,病毒衣壳容易解离为五聚体亚单位而影响疫苗的免疫保护效果。因此,改善病毒的热稳定性,制备热稳定优良的口蹄疫疫苗... 口蹄疫是世界范围内广泛流行的一种偶蹄动物的烈性传染病,其病原为口蹄疫病毒(FMDV),它对热比较敏感,当温度高于30℃时,病毒衣壳容易解离为五聚体亚单位而影响疫苗的免疫保护效果。因此,改善病毒的热稳定性,制备热稳定优良的口蹄疫疫苗具有重大的应用价值。在实验室建立的口蹄疫病毒型内嵌和全长感染性克隆的基础上,在结构蛋白引入1个或2个氨基酸突变,分别构建了2种基因修饰的口蹄疫病毒全长重组质粒。全长质粒经NotⅠ线化后分别转染表达T7RNA聚合酶的BSR/T7细胞以拯救重组病毒。间接免疫荧光和电镜分析表明,成功拯救到2株口蹄疫重组病毒。重组病毒经RT-PCR和序列测定证实只有1株重组病毒所含的耐热突变可以稳定遗传。热失活试验显示,拯救病毒与亲本病毒的耐热特性基本一致。结果表明在结构蛋白上引入V2090A-S2093F-H30568R的突变,并对口蹄疫病毒的热稳定性并没有明显的影响,为未来发展热稳定的口蹄疫疫苗提供了一定的参考。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 热稳定性 疫苗
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VP3 G-H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响
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作者 陈冬冬 白兴文 +12 位作者 宫晓华 包慧芳 李平花 李冬 付元芳 白启峰 袁红 孙普 马雪青 曹轶梅 陈应理 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1285-1294,共10页
【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP3 G-H环 定点突变体 生物学特性 内吞作用
牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立 预览
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作者 王旭 孙雨 +8 位作者 王睿男 肖颖 蒋菲 毕一鸣 李硕 杨林 董虹 宋晓晖 王传彬 《中国草食动物科学》 CAS 2019年第3期33-39,共7页
为研究快速定量检测牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,试验通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的3A-3B融合蛋白,并基于纯化的可溶性融合蛋白建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测... 为研究快速定量检测牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,试验通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的3A-3B融合蛋白,并基于纯化的可溶性融合蛋白建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。结果表明:建立的方法能够检测牛血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的牛类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床牛血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率96%,阴性样品符合率93.3%,总的符合率95.7%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。文章首次建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法,同传统的ELISA方法相比,该检测方法特异性相当、敏感性更高,操作更简单、快速,具有较高的应用推广价值。 展开更多
关键词 牛血清 口蹄疫病毒 非结构蛋白 可溶性表达与纯化 时间分辨荧光免疫分析
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口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立 被引量:1
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作者 孙雨 宋晓晖 +7 位作者 肖颖 毕一鸣 王睿男 蒋菲 张存瑞 王旭 杨林 王传彬 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期812-820,共9页
为建立快速定量检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,本研究通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免... 为建立快速定量检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,本研究通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。该方法能够检测羊血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率为98%,阴性样品符合率为92%,总符合率为95%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法同传统的ELISA方法相比,特异性相当、敏感性更高,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 非结构蛋白 可溶性表达与纯化 时间分辨荧光免疫分析
基于单个B细胞抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的研制
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作者 张雨 秦晓东 +3 位作者 朱学亮 殷相平 李彦敏 张志东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1082-1089,共8页
为了建立基于单个B细胞制备抗体技术,本研究以O型灭活FMDV为抗原,采集健康C57/BL小鼠脾细胞,经过磁珠富集、流式B220+/CD38+/Ig G1+/抗原+分选,获得单个抗原特异性的B细胞。经单细胞巢式PCR反应扩增获得抗体完整轻、重链可变区序列后,... 为了建立基于单个B细胞制备抗体技术,本研究以O型灭活FMDV为抗原,采集健康C57/BL小鼠脾细胞,经过磁珠富集、流式B220+/CD38+/Ig G1+/抗原+分选,获得单个抗原特异性的B细胞。经单细胞巢式PCR反应扩增获得抗体完整轻、重链可变区序列后,分别构建轻/重链表达质粒,然后共转染HEK-293细胞后,成功获得3株特异性单克隆抗体,且证明均属于Ig G1型抗体;ELISA结果显示,获得的3株抗体均能与O型FMDV抗原结合;免疫荧光试验证明,3株抗体能够特异性结合细胞内复制的O型FMDV。本研究成功建立了基于单个B细胞直接制备抗FMDV单抗的方法,为后期开发特异性单克隆抗体打下了坚实的基础。 展开更多
关键词 单个B细胞 口蹄疫病毒 抗体 流式分选技术 单细胞巢式PCR
不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较 预览
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作者 王文莉 刘华南 +6 位作者 卢炳州 赵俊皓 徐守兴 胡永浩 郑海学 张克山 刘湘涛 《动物医学进展》 北大核心 2019年第2期39-44,共6页
为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗... 为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3ABC抗体 酶联免疫吸附试验
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3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建
16
作者 李平花 马雪青 +5 位作者 袁红 袁子文 孙普 白兴文 卢曾军 刘在新 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期907-915,共9页
【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构... 【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。 展开更多
关键词 3A蛋白 104-115位氨基酸缺失 口蹄疫A型 标记病毒 构建
应用病毒计数仪定量检测口蹄疫灭活抗原方法的建立 预览
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作者 杨小蓉 严石 +1 位作者 许磊 马良 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期111-112,118共3页
目前国内对口蹄疫(FMD)疫苗抗原的生产质量控制检测,主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S检测。但该方法操作过程繁琐,操作时间太长,1次能检测样品数量有限,检测效率不高。本研究采用病毒计数仪对FMDV完整粒子进行定量检测,同时与蔗糖... 目前国内对口蹄疫(FMD)疫苗抗原的生产质量控制检测,主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S检测。但该方法操作过程繁琐,操作时间太长,1次能检测样品数量有限,检测效率不高。本研究采用病毒计数仪对FMDV完整粒子进行定量检测,同时与蔗糖密度梯度法定量病毒146S检测结果进行对比,本研究方法检测时间只需10min,有耗时短、受干扰因素少、准确性较高的显著特点,为FMD疫苗的生产质量控制提供了一种可用的方法。 展开更多
关键词 口蹄疫灭活抗原 病毒计数仪 定量检测
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二重荧光RT-LAMP方法鉴别检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒 预览
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作者 范晴 谢芝勋 +8 位作者 谢志勤 谢丽基 黄娇玲 张艳芳 曾婷婷 王盛 罗思思 邓显文 刘加波 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期996-1004,共9页
口蹄疫和水泡性口炎是牛常见高度急性病毒传染病,在全球范围内广泛存在。本研究旨在建立一种可同时鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,... 口蹄疫和水泡性口炎是牛常见高度急性病毒传染病,在全球范围内广泛存在。本研究旨在建立一种可同时鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每条内引物的5′端标记荧光基团,通过扩增产物颜色判断检测结果。优化反应条件,建立了可同时检测口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光RT-LAMP方法。结果显示,该方法灵敏性高,每个反应最低能够检测到100个拷贝混合模板;特异性好,能在同一个反应管里检测到两种病毒,对其他牛病原体无扩增;干扰性小,扩增效率不受模板浓度影响。本研究建立的口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重荧光RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 水泡性口炎病毒 二重荧光RT-LAMP 检测
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口蹄疫病毒O型OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建 预览 被引量:1
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作者 苗书魁 魏玉荣 +7 位作者 魏婕 米晓云 汪萍 马文戈 王延 薛英 易忠 黄炯 《动物医学进展》 北大核心 2018年第1期1-6,共6页
为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重叠的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,... 为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)的感染性克隆,采用RT-PCR将O型FMDV OHM/02株全长基因组分为5个重叠的片段进行扩增,克隆至载体pUC57中,获得全长cDNA克隆pPO-1。将线性化的pPO-1与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,出现致细胞病变效应(CPE)。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切、测序,表明人工设计的分子标记Bam HⅠ酶切位点消失,排除了亲本毒株污染的可能性。间接免疫荧光试验可以检测到绿色荧光,电镜观察可观察到病毒粒子,表明构建了具有感染性的OHM/02毒株全长cDNA克隆。病毒生长曲线表明,拯救病毒与亲本病毒的复制能力和增殖特性相似。OHM/02株全长cDNA感染性克隆的构建及拯救可为FMDV致病机理的研究提供一种重要工具,可促进疫苗的研发。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 全长CDNA 转染 病毒拯救
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广东地区口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析 预览
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作者 李琪 谢增胜 +8 位作者 石庆伟 陈耀 孙彦阔 冯松林 汪志 冀池海 刘艺兴 邢秀琳 张桂红 《华南农业大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期13-18,共6页
【目的】了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)的遗传变异情况,为我国FMDV流行病学的研究及防控提供基础数据。【方法】对2015—2016年间收集的广东地区猪的病料进行FMDV VP1和3A基因的扩增测序和序列分析。【结果】11株O型FMDV均属耿马谱系... 【目的】了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)的遗传变异情况,为我国FMDV流行病学的研究及防控提供基础数据。【方法】对2015—2016年间收集的广东地区猪的病料进行FMDV VP1和3A基因的扩增测序和序列分析。【结果】11株O型FMDV均属耿马谱系毒株,7株A型FMDV均属Asia型毒株。11株O型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,GD-MM-3株与O/BY/CHA/2010株序列相似性最高,为95.3%;GD-1株、GD-MM-1株和GD-MM-3株与O/MYA/1/98株序列相似性最高,为90.8%。7株A型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株序列相似性最高,为99.8%;A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株序列相似性最高,为91.4%。11株O型FMDV的3A蛋白不存在氨基酸的缺失,7株A型FMDV的3A蛋白存在较多氨基酸的缺失。【结论】广东部分地区FMDV基因型复杂,预防控制困难。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 3A基因 序列相似性 遗传变异
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