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L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因5′端二级结构对重组表达的抑制机制及消除策略 预览
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作者 令狐梅 韩来闯 +1 位作者 周哲敏 崔文璟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第16期1-10,共10页
探究赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)与人工高效表达元件适配过程中翻译抑制产生的机制,并发展新的消除策略.首先在枯草芽孢杆菌中利用高效表达元件验证翻译抑制现象并分析了翻译抑制产生的机制,同时融合sfGFP... 探究赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)与人工高效表达元件适配过程中翻译抑制产生的机制,并发展新的消除策略.首先在枯草芽孢杆菌中利用高效表达元件验证翻译抑制现象并分析了翻译抑制产生的机制,同时融合sfGFP考察其对翻译抑制的影响,筛选与PanD酶适配性强的精简融合肽.结果显示,强组成型启动子不能介导PanD高表达,呈翻译抑制.分析证实,panD转录后mRNA的5'编码区与5'UTR形成抑制性的二级结构,降低翻译起始效率.将两种报告基因和其N端部分序列作为绝缘肽分别与PanD的N端融合后均能够提升重组蛋白的表达水平,消除由mRNA分子内部的顺式作用导致的翻译抑制现象.这为深入探索利用通用型肽绝缘子元件稳定异源基因在底盘中的表达提供依据. 展开更多
关键词 L-天冬氨酸-α-脱羧酶 MRNA二级结构 N端截断 融合肽 枯草芽孢杆菌
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高产β-丙氨酸基因工程菌的构建与优化 预览
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作者 李博 宿承璘 +2 位作者 范超 洪皓 张春枝 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期1-4,共4页
为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,得到重组菌后,采用不同方法进行优化。通过选用不同表达载体、对目的基因序列进行密码子优化以及对菌株进行... 为构建高产β-丙氨酸基因工程菌,克隆了来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,得到重组菌后,采用不同方法进行优化。通过选用不同表达载体、对目的基因序列进行密码子优化以及对菌株进行自动诱导的策略,逐步提高目的蛋白的表达量,进而提高β-丙氨酸产量。结果表明,经优化后,菌株30a-1的β-丙氨酸产量提高到140.82mmol/L,较优化前提高了2.5倍。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸-α-脱羧酶 Β-丙氨酸 密码子优化 自动诱导
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代谢工程改造大肠杆菌合成β-丙氨酸 预览
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作者 梁姗姗 周丽 +1 位作者 张斌 周哲敏 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2017年第5期13-18,共6页
β-丙氨酸是天然存在的唯一一种β型氨基酸,在医药、食品、化工等领域有重要应用。该研究考察了以重组Escherichia coli发酵合成B一丙氨酸的可能性。在敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因的Escherichia coli CI... β-丙氨酸是天然存在的唯一一种β型氨基酸,在医药、食品、化工等领域有重要应用。该研究考察了以重组Escherichia coli发酵合成B一丙氨酸的可能性。在敲除副产物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途径编码基因的Escherichia coli CICIM B0016-050(ackA-pta pflB adhE frdA ldhA)菌株中,考察叠加敲除β-丙氨酸的竞争途径天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖转运蛋白(EⅡCBGIc)的编码基因(lysC、panC、ptsG)以及过表达来源于Corynebacterium glutamicum的panD基因对合成β-丙氨酸的影响。结果表明,叠加敲除上述基因后,β-丙氨酸的合成量依次提高了12.5%、39.3%和13.3%;过量表达panD基因,B-丙氨酸合成量提高了86.2倍;经发酵条件优化,菌株B0016-080BB/pPL-panD摇瓶发酵可合成(5.0±0.2)g/Lβ-丙氨酸,体积生产强度达到(0.12±0.01)g/(L·h)。该结果为发酵法合成B一丙氨酸奠定了基础。 展开更多
关键词 Β-丙氨酸 大肠杆菌 L-天冬氨酸-α-脱羧酶 代谢工程 基因敲除
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结核杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶诱导表达条件研究 预览 被引量:2
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作者 陈涛 徐世永 冯炎 《金陵科技学院学报》 2016年第3期80-83,共4页
L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸。将结核杆菌中的panD基因克隆后连接到pET30a(+)载体上在E.coLi BL21(DE3)中进行重组表达。通过对诱导乳糖浓度、温度等发酵条件的优化,得到最佳培... L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸。将结核杆菌中的panD基因克隆后连接到pET30a(+)载体上在E.coLi BL21(DE3)中进行重组表达。通过对诱导乳糖浓度、温度等发酵条件的优化,得到最佳培养条件为:乳糖浓度10g·L-1,诱导温度30℃。最佳条件下工程菌株酶活力达到200U以上。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 结核杆菌 乳糖 诱导条件
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枯草芽胞杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶的酶学性质 被引量:6
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作者 邓思颖 张君丽 +1 位作者 蔡真 李寅 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1184-1193,共10页
β-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸α脱羧酶(PanD)能特异地脱去L-天冬氨酸的仅羧基,生成β-丙氨酸。本丈比较了3种分别来源于大肠... β-丙氨酸是一种重要的医药化工原料,目前主要依靠化学法进行生产。探寻更为环保和高效的生物生产法是未来研究的一个方向。L-天冬氨酸α脱羧酶(PanD)能特异地脱去L-天冬氨酸的仅羧基,生成β-丙氨酸。本丈比较了3种分别来源于大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌及枯草芽胞杆菌的PanD比酶活(分别为0.98、7.52和8.4U/mg)。后两者的最适pH均为6.5,最适反应温度分别为65℃及60℃。与目前研究最多的来源于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的PanD相比,来源于枯草芽胞杆菌的PanD具有更好的活性和热稳定性,具有更强的工业应用潜力。同时,本文对该酶特有的翻译后自剪切及机理性失活现象进行了分析和讨论。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 Β-丙氨酸 枯草芽胞杆菌 谷氨酸棒状杆菌 酶学性质
谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因的克隆及重组酶性质研究 预览 被引量:5
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作者 石增秀 崔文璟 +1 位作者 周丽 周哲敏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期110-115,共6页
从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中克隆得到L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD。将该基因连接到pET-24a载体上,并在Esche,ichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。蛋白电泳检测显示,PanD自裂解后形成的α亚基和β亚基,即P... 从谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中克隆得到L-天冬氨酸α-脱羧酶基因panD。将该基因连接到pET-24a载体上,并在Esche,ichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。蛋白电泳检测显示,PanD自裂解后形成的α亚基和β亚基,即PanD重组酶具有自身加工功能。重组酶的比酶活高达2.60U/mg(156mmol/g·h)。酶学性质研究表明,其最适温度为55℃,最适pH为7.0。80℃条件下,PanD的半衰期约为40min。在37℃,pH7.5条件下,km值为4.26mmol/L,V_max为35.97nmol/min,K_eat 为1.02/s,催化效率K-cat/k_m为0.24L/mmol.s。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 谷氨酸棒杆菌 表达 纯化 酶学性质
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L-天冬氨酸脱羧酶研究进展 预览 被引量:8
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作者 高丽娟 裘娟萍 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期 54-59,共6页
根据作用于L-天冬氨酸的位置不同,L-天冬氨酸脱羧酶可分为L-天冬氨酸α-脱羧酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶,本文综述了两种酶在结构特点、酶学性质、基因表达、酶的应用等方面的研究进展。
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 L-天冬氨酸β-脱羧酶 Β-丙氨酸 L(α)-丙氨酸
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L-天冬氨酸-α-脱羧酶高产菌株初筛方法的建立 预览
8
作者 王姗姗 余志良 裘娟萍 《氨基酸和生物资源》 CAS 2016年第2期58-63,共6页
通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性... 通过试管法、平板法、Berthelot法和纸层析法对L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)高产菌株的初筛方法进行研究。分别检测转化体系中底物L-天冬氨酸减少引起的pH变化及产物CO2和β-丙氨酸的增加量,并用高效液相色谱法比较这四种方法的准确性。结果表明:CO2能溶于转化液,难以用倒置管收集完全;PanD系胞内酶,难以用平板点种法改变平板的pH;β-丙氨酸和L-天冬氨酸在Berthelot检测中吸收值均偏低,不适用于PanD高产菌的筛选;纸层析法可以直接检测β-丙氨酸和L-天冬氨酸,成本低,操作简单,具一定的精确度,可以较大规模地筛选PanD高产菌株。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD) Β-丙氨酸 L-天冬氨酸 高产菌株 筛选
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赤拟谷盗来源天冬氨酸α-脱羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工艺的建立 预览
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作者 王超 叶文琪 +2 位作者 薛岚 刘中美 周哲敏 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期7-13,共7页
L-天冬氨酸α-脱羧酶活性较低,稳定性较差,使得其在工业应用中受到限制。该研究旨在提高L-天冬氨酸α-脱羧酶的催化性能,促进生物法生产β-丙氨酸的工业化进程。依据嗜热蛋白酶的氨基酸内在进化趋势,对赤拟谷盗来源L-天冬氨酸α-脱羧酶... L-天冬氨酸α-脱羧酶活性较低,稳定性较差,使得其在工业应用中受到限制。该研究旨在提高L-天冬氨酸α-脱羧酶的催化性能,促进生物法生产β-丙氨酸的工业化进程。依据嗜热蛋白酶的氨基酸内在进化趋势,对赤拟谷盗来源L-天冬氨酸α-脱羧酶进行分子改造,以期提高稳定性。实验共构建21个突变体,获得催化性能优良的突变体K221R,该突变体的比酶活较野生型提高20.3%;野生型经50℃处理30min,残余酶活接近0,而突变体K221R的残余酶活为43%。建立了基因工程菌全细胞催化天冬氨酸生成β-丙氨酸的工艺,K221R菌株的产量达到134.72g/L,摩尔转化率为94.52%,是迄今为止的最高产量。该研究构建的基因工程菌具有工业应用潜力,同时也为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术基础。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 热稳定性 定点突变 Β-丙氨酸 全细胞催化
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一菌双酶法转化富马酸生成β-丙氨酸 预览
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作者 陈明亮 祁瑛 +3 位作者 肖延铭 华超 李敬亚 梁阿朋 《发酵科技通讯》 CAS 2018年第4期231-235,共5页
利用天冬氨酸转氨酶(AspAT)和L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨作为底物催化合成β-丙氨酸(β-Ala)是工业合成β-丙氨酸的重要途径。但传统的双酶工艺需要分别发酵两个酶,且酶无法固定化。通过将AspAT和PanD构建入同一个大... 利用天冬氨酸转氨酶(AspAT)和L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨作为底物催化合成β-丙氨酸(β-Ala)是工业合成β-丙氨酸的重要途径。但传统的双酶工艺需要分别发酵两个酶,且酶无法固定化。通过将AspAT和PanD构建入同一个大肠杆菌中,使其通过一次发酵就能产生两个酶,并且通过固定化通透细胞使酶可以重复利用。构建的工程菌的整体酶活为85.4U/g,固定化率为64.2%,固定化细胞最适反应温度为45℃,最适反应pH为7.5,最高可将质量浓度为300g/L的富马酸完全转化生成β-Ala,固定化细胞可连续使用12次。根据笔者提出的方法可简化酶的发酵工艺,进一步降低β-Ala的生产成本。 展开更多
关键词 天冬氨酸转氨酶 L-天冬氨酸 α -脱羧酶 通透细胞 固定化
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特基拉芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶的异源表达及高密度发酵 预览
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作者 范雪萍 冯志彬 +3 位作者 房美芳 张娟 陈国忠 李丽娜 《食品科学》 CSCD 北大核心 2018年第2期144-150,共7页
L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,Pan D)能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37的基因组为模板,扩增Pan D表达基因panD,构建表... L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,Pan D)能选择性脱去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸,具有重要的工业应用价值。以特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37的基因组为模板,扩增Pan D表达基因panD,构建表达质粒p ET32a(+)-panD,转入Escherichia coli BL21(DE3)成功实现异源表达。利用摇床和发酵罐优化培养条件实现高密度发酵,确定最佳培养条件为:37℃培养8 h,加入终浓度0.5 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)降温至26℃诱导,采用葡萄糖为碳源并控制初始质量浓度为5 g/L,发酵过程中采用pH-stat方式补料。在此基础上利用5 L发酵罐进行发酵产酶,酶活力最高可达1 109.8 U/m L,OD(600 nm)达到106.3。全细胞催化100 g/L L-天冬氨酸,反应10 h物质的量转化率为99.2%。构建的重组菌经发酵优化后具有较高的细胞浓度和Pan D活力,为生物法β-丙氨酸的工业化生产与应用提供理论支持。 展开更多
关键词 特基拉芽孢杆菌 大肠杆菌 L-天冬氨酸α-脱羧酶 异源表达 Β-丙氨酸
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产L-天冬氨酸α-脱羧酶细菌的分离、鉴定及发酵条件优化 被引量:8
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作者 冯志彬 张娟 +5 位作者 陈国忠 察亚萍 刘进杰 葛宜和 程仕伟 于波涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期44-55,共12页
【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力... 【目的】从葡萄园土壤中分离L-天冬氨酸α-脱羧酶的产生菌株,对其进行分类鉴定,优化其产生L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵条件,为β-丙氨酸的生物合成提供基础。【方法】采用变色圈法和液体复筛培养基分离筛选具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活力的菌株,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S r RNA序列同源性分析鉴定菌株的系统发育学地位,采用单因素及正交设计试验优化培养基及发酵条件。【结果】筛选到一株L-天冬氨酸α-脱羧酶高产菌株Pan D37,其亲缘关系和特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)较近,且形态与培养特征、生理生化特性与特基拉芽孢杆菌基本相符。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:蔗糖22.5 g/L、富马酸7.5 g/L、蛋白胨20 g/L、L-天冬氨酸6 g/L、Triton X-100 2g/L,起始p H为7.0,装液量50 m L/500 m L,摇床转速220 r/min,种子液接种量为5%(V/V),35°C培养28h。在最优条件下L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/m L,比初筛时提高2.57倍。【结论】分离并获得一株特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)Pan D37,经条件优化后具有较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶产生能力,有望应用于β-丙氨酸的工业生产。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 特基拉芽孢杆菌 分离鉴定 发酵条件优化 Β-丙氨酸
谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中的表达及酶转化生产β-丙氨酸 被引量:7
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作者 赵连真 张梁 石贵阳 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第12期2161-2170,共10页
【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转... 【目的】克隆谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸α-脱羧酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 并进行酶转化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的研究。【方法】PCR扩增谷氨酸棒杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand, 构建表达载体pET24a(+)-Pand, 转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3), 对重组菌进行诱导表达, 表达产物经DEAE离子交换层析和G-75 分子筛层析纯化后进行酶学性质研究, 然后进行酶转化实验, 说明底物和产物对酶转化的影响。【结果】重组菌SDS-PAGE分析表明Pand表达量可达菌体总蛋白的50%以上, AccQ·Tag法检测酶活达到94.16 U/mL。该重组酶最适反应温度为55 °C, 在低于37 °C时保持较好的稳定性, 最适pH为6.0, 在pH 4.0?7.0范围内有较好的稳定性。酶转化实验说明: 底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸对转化反应均有抑制作用; 实验建立了较优的酶转化反应方式, 在加酶量为每克天冬氨酸3 000 U时, 以分批加入固体底物L-天冬氨酸的形式, 使100 g/L底物转化率达到97.8%。【结论】重组L-天冬氨酸α-脱羧酶在大肠杆菌中获得高效表达, 研究了酶转化生产β-丙氨酸的影响因素, 为其工业应用奠定了基础。 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 Β-丙氨酸 谷氨酸棒杆菌 表达 纯化 转化率
L-天冬氨酸α-脱羧酶工程菌株的构建及其培养条件研究 预览 被引量:6
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作者 洪敏 赵春田 +3 位作者 张正波 吴瑶瑶 裘娟萍 白彦兵 《浙江工业大学学报》 CAS 北大核心 2011年第3期 252-256,260,共6页
L-天冬氨酸α-脱羧酶以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸.利用PCR扩增技术,将Escherichia coliDH5α中的PanD基因克隆后连接到pET28c(+)载体上,先转化E.coliDH5α中,经过50μg/mL卡那霉素抗性筛选和酶切、测序验证后,转... L-天冬氨酸α-脱羧酶以L-天冬氨酸为底物,脱去α-羧基后生成β-丙氨酸.利用PCR扩增技术,将Escherichia coliDH5α中的PanD基因克隆后连接到pET28c(+)载体上,先转化E.coliDH5α中,经过50μg/mL卡那霉素抗性筛选和酶切、测序验证后,转化表达菌株E.coliBL21(DE3),得到具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET28c(+)-panD.经乳糖诱导该基因能有效表达C-末端具有组氨酸标签的L-天冬氨酸α-脱羧酶.通过对乳糖诱导时间、乳糖诱导质量浓度、诱导温度、诱导菌龄和培养基诱导初始pH值等发酵条件的优化,得到最佳培养条件为:乳糖诱导时间20 h,乳糖质量浓度12 g/L,诱导温度为35℃,诱导菌龄为3.5 h,诱导培养基初始pH 5.5,通过对转化产物β-丙氨酸的检测结果分析显示,工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET28c(+)-panD在优化条件下,酶活力达186 U. 展开更多
关键词 L-天冬氨酸α-脱羧酶 PanD 工程菌 诱导表达 培养条件
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