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Adipose-derived stem cells modified by BDNF gene rescue erectile dysfunction after cavernous nerve injury 预览
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作者 Mei Yang Jiang-Yang Sun +2 位作者 Cheng-Cheng Ying Yong Wang Yong-Lian Guo 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2020年第1期120-127,共8页
Cavernous nerve injury is the main cause of erectile dysfunction following radical prostatectomy.The recovery of erectile function following radical prostatectomy remains challenging.Our previous studies found that in... Cavernous nerve injury is the main cause of erectile dysfunction following radical prostatectomy.The recovery of erectile function following radical prostatectomy remains challenging.Our previous studies found that injecting adipose-derived stem cells(ADSCs)into the cavernosa could repair the damaged cavernous nerves,but the erectile function of the treated rats could not be restored to a normal level.We evaluated the efficacy of ADSCs infected with a lentiviral vector encoding rat brain-derived neurotrophic factor(lenti-rBDNF)in a rat model of cavernous nerve injury.The rats were equally and randomly divided into four groups.In the control group,bilateral cavernous nerves were isolated but not injured.In the bilateral cavernous nerve injury group,bilateral cavernous nerves were isolated and injured with a hemostat clamp for 2 minutes.In the ADSCGFP and ADSCrBDNF groups,after injury with a hemostat clamp for 2 minutes,rats were injected with ADSCs infected with lenti-GFP(1×106 in 20μL)and lenti-rBDNF(1×106 in 20μL),respectively.Erectile function was assessed 4 weeks after injury by measuring intracavernosal pressures.Then,penile tissues were collected for histological detection and western blot assay.Results demonstrated that compared with the bilateral cavernous nerve injury group,erectile function was significantly recovered in the ADSCGFP and ADSCrBDNF groups,and to a greater degree in the ADSCrBDNF group.Neuronal nitric oxide synthase content in the dorsal nerves and the ratio of smooth muscle/collagen were significantly higher in the ADSCrBDNF and ADSCGFP groups than in the bilateral cavernous nerve injury group.Neuronal nitric oxide synthase expression was obviously higher in the ADSCrBDNF group than in the ADSCGFP group.These findings confirm that intracavernous injection with ADSCs infected with lenti-rBDNF can effectively improve erectile dysfunction caused by cavernous nerve injury.This study was approved by the Medical Animal Care and Welfare Committee of Wuhan University,China(approval No.2017-163 展开更多
关键词 adipose-derived stem cells BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC factor CAVERNOUS nerve injury erectile dysfunction infection intracavernous injection LENTIVIRAL vector neuronal nitric oxide SYNTHASE radical prostatectomy
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TrkA regulates the regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts 预览
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作者 Mei-Ge Zheng Wen-Yuan Sui +8 位作者 Zhen-Dan He Yan Liu Yu-Lin Huang Shu-Hua Mu Xin-Zhong Xu Ji-Sen Zhang Jun-Le Qu Jian Zhang Dong Wang 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第10期1765-1771,共7页
We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the r... We previously demonstrated that overexpression of tropomyosin receptor kinase A(TrkA)promotes the survival and Schwann celllike differentiation of bone marrow stromal stem cells in nerve grafts,thereby enhancing the regeneration and functional recovery of the peripheral nerve.In the present study,we investigated the molecular mechanisms underlying the neuroprotective effects of TrkA in bone marrow stromal stem cells seeded into nerve grafts.Bone marrow stromal stem cells from Sprague-Dawley rats were infected with recombinant lentivirus vector expressing rat TrkA,TrkA-shRNA or the respective control.The cells were then seeded into allogeneic rat acellular nerve allografts for bridging a 1-cm right sciatic nerve defect.Then,8 weeks after surgery,hematoxylin and eosin staining showed that compared with the control groups,the cells and fibers in the TrkA overexpressing group were more densely and uniformly arranged,whereas they were relatively sparse and arranged in a disordered manner in the TrkA-shRNA group.Western blot assay showed that compared with the control groups,the TrkA overexpressing group had higher expression of the myelin marker,myelin basic protein and the axonal marker neurofilament 200.The TrkA overexpressing group also had higher levels of various signaling molecules,including TrkA,pTrkA(Tyr490),extracellular signal-regulated kinases 1/2(Erkl/2),pErk1/2(Thr202/Tyr204),and the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xL.In contrast,these proteins were downregulated,while the pro-apoptotic factors Bax and Bad were upregulated,in the TrkA-shRNA group.The levels of the TrkA effectors Akt and pAkt(Ser473)were not different among the groups.These results suggest that TrkA enhances the survival and regenerative capacity of bone marrow stromal stem cells through upregulation of the Erk/Bcl-2 pathway.All procedures were approved by the Animal Ethical and Welfare Committee of Shenzhen University,China in December 2014(approval No.AEWC-2014-001219). 展开更多
关键词 NERVE REGENERATION bone marrow stromal stem cells TROPOMYOSIN RECEPTOR kinase A RECEPTOR LENTIVIRAL vector shRNA extracellular SIGNAL-REGULATED protein kinases 1/2 Bcl-2 NERVE grafts peripheral NERVE REGENERATION survival neural REGENERATION
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On the development of optical peripheral nerve interfaces 预览
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作者 Hans E.Anderson Richard F.ff.Weir 《中国神经再生研究:英文版》 SCIE CAS CSCD 2019年第3期425-436,共12页
Limb loss and spinal cord injury are two debilitating conditions that continue to grow in prevalence.Prosthetic limbs and limb reanimation present two ways of providing affected individuals with means to interact in t... Limb loss and spinal cord injury are two debilitating conditions that continue to grow in prevalence.Prosthetic limbs and limb reanimation present two ways of providing affected individuals with means to interact in the world.These techniques are both dependent on a robust interface with the peripheral nerve.Current methods for interfacing with the peripheral nerve tend to suffer from low specificity,high latency and insufficient robustness for a chronic implant.An optical peripheral nerve interface may solve some of these problems by decreasing invasiveness and providing single axon specificity.In order to implement such an interface three elements are required:(1)a transducer capable of translating light into a neural stimulus or translating neural activity into changes in fluorescence,(2)a means for delivering said transducer and (3)a microscope for providing the stimulus light and detecting the fluorescence change.There are continued improvements in both genetically encoded calcium and voltage indicators as well as new optogenetic actuators for stimulation.Similarly,improvements in specificity of viral vectors continue to improve expression in the axons of the peripheral nerve.Our work has recently shown that it is possible to virally transduce axons of the peripheral nerve for recording from small fibers.The improvements of these components make an optical peripheral nerve interface a rapidly approaching alternative to current methods. 展开更多
关键词 PERIPHERAL NERVE INTERFACES optogenetics OPTICAL neural interface OPTICAL PERIPHERAL NERVE interface GCaMP ArcLight adenoassociated VIRAL vector lentiviral VECTORS VIRAL VECTORS implantable microscopy
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下调claudin-1对胆囊癌细胞SGC996生物学行为的影响 预览
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作者 金浩 谈燚 +3 位作者 庞青 满忠然 王勇 刘会春 《中国继续医学教育》 2019年第11期167-171,共5页
目的探讨下调claudin-1对胆囊癌细胞生物学行为的影响。方法通过慢病毒LV-CLDN1-RNAi感染下调claudin-1在胆囊癌细胞SGC996中的表达。检测细胞增值、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭和凋亡相关基因Bax及Bcl-2蛋白表达水平,分析下调claudi... 目的探讨下调claudin-1对胆囊癌细胞生物学行为的影响。方法通过慢病毒LV-CLDN1-RNAi感染下调claudin-1在胆囊癌细胞SGC996中的表达。检测细胞增值、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭和凋亡相关基因Bax及Bcl-2蛋白表达水平,分析下调claudin-1在胆囊癌细胞中的表达后对其增殖、凋亡及侵袭等生物学行为的影响。结果感染LV-CLDN1-RNAi后SGC996增殖无明显变化,被阻滞的G1期细胞明显增多(P=0.003 7),S期细胞明显减少(P=0.0021),细胞凋亡比例增加(P<0.0211)。下调claudin-1表达能抑制胆囊癌细胞侵袭;促凋亡基因Bax的蛋白表达增加,抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表达降低。结论下调claudin-1表达能有效促进胆囊癌细胞的凋亡,抑制其侵袭,提示claudin-1在胆囊癌的复发和转移中可能会发挥作用。 展开更多
关键词 CLAUDIN-1 胆囊癌细胞 慢病毒 增殖 凋亡 侵袭
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沉默MFG-E8对乳腺癌细胞的功能影响研究
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作者 杨泳 李杰宝 +4 位作者 宋旗 祝孔俊 喻晓程 田野 张家衡 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2018年第8期3563-3568,共6页
通过沉默乳脂肪球表皮生长因子基因表达,探讨其对MFG-E8高表达乳腺癌细胞的功能影响。采用RT-PCR检测方法筛选MFG-E8高表达乳腺癌细胞;利用实验室已构建的MFG-E8干扰慢病毒干扰高表达乳腺癌细胞,检测细胞增殖、凋亡和迁移变化,利用Weste... 通过沉默乳脂肪球表皮生长因子基因表达,探讨其对MFG-E8高表达乳腺癌细胞的功能影响。采用RT-PCR检测方法筛选MFG-E8高表达乳腺癌细胞;利用实验室已构建的MFG-E8干扰慢病毒干扰高表达乳腺癌细胞,检测细胞增殖、凋亡和迁移变化,利用Western blotting方法检测相关蛋白因子。经筛选,在几种不同乳腺癌细胞中,MCF-7细胞MFG-E8表达量最高;与对照组相比,通过沉默MFG-E8基因,乳腺癌细胞异常增殖减缓,细胞凋亡率上升,细胞迁移受到抑制,MFG-E8、BCL2、MMP2、MMP9、磷酸化STAT3蛋白表达量均下降,Bax和Caspase3蛋白表达上调;研究表明,沉默MFG-E8基因,乳腺癌细胞在癌症的发生发展过程中,功能受到明显改变,提示干扰MFG-E8的表达可能成为乳腺癌治疗的重要手段。 展开更多
关键词 MFG-8 慢病毒 细胞增殖 细胞凋亡
稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体GluA1亚基单克隆细胞株的构建
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作者 李炯 张吉凤 +3 位作者 赵波 蔡振彬 朱肖楠 郭国庆 《解剖学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期591-597,共7页
目的构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体GluA1亚基的细胞株。方法PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV. 0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细... 目的构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体GluA1亚基的细胞株。方法PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV. 0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定GluA1的表达与功能。结果菌落PCR鉴定扩增产物与GluA1分子量(2724 bp)一致,经测序插入慢病毒载体序列与GluA1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,GluA1在过表达GluA1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达。单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面GluA1蛋白表达相对一致。单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达GluA1组可记录5~40 p A电信号。结论成功构建了稳定表达AMPA受体GluA1亚基的HEK293T细胞株。 展开更多
关键词 GluA1亚基 慢病毒 单克隆 细胞株 实时定量聚合酶链反应 免疫印迹法
Construction of a lentiviral vector over - expressing BDNF and its transfection into adipose derived stem cell lines in vitro
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作者 Rui Lu Yu Peng +10 位作者 Yi-Heng Liu Zhi-Jian Ma Yuan Fu Ming-Hui Chen Jian-Xing Li Hao-Chi Yang Ge-Xin Xu Bo Li Ling-Ling Fu Su-Wen Feng Hai-Ying Zhang 《海南医科大学学报(英文版)》 2018年第24期5-9,共5页
Objective:To construct a recombinant lentiviral vector that co-express ZsGreen and BDNF and establish an Adipose derived stem cell (ADSC) line with stable BDNF expression down- regulation.Methods: BDNF were designed a... Objective:To construct a recombinant lentiviral vector that co-express ZsGreen and BDNF and establish an Adipose derived stem cell (ADSC) line with stable BDNF expression down- regulation.Methods: BDNF were designed and inserted into the lentiviral vector p HBLV-CMVIE-Zs Green-Puro. After identification by DNA sequencing, the lentiviral vectors carrying BDNF were packaged in 293 cells. The transfection efficiency was observed under fluorescence microscope;the lentiviral particles were collected to infect mouse ADSCs, and BDNF level were assessed using real-time PCR and Western blotting.Results: DNA sequencing demonstrated successful construction of the BDNF lentivirus vectors. Real- time PCR and Western blotting showed a high level BDNF mRNA and protein.Conclusion: We have successfully established an ADSC model with stable BDNF expression which establish the basis for the potential application of ADSCs-BDNF in the treatment of AD. 展开更多
关键词 Alzheimer's disease ADIPOSE derived stem cell LENTIVIRAL vector BDNF
慢病毒介导CX43基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞体系的建立及鉴定 预览 被引量:1
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作者 王亚萍 司英健 +3 位作者 王艳 邢国胜 王洋 封志纯 《中国小儿血液与肿瘤杂志》 CAS 2017年第3期123-130,共8页
目的建立慢病毒介导间隙连接蛋白43(CX43)基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体系并进行鉴定,为研究CX43过表达BMSCs在移植物抗宿主病中的作用奠定实验基础。方法采用全骨髓贴壁分离培养法获取小鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞表面... 目的建立慢病毒介导间隙连接蛋白43(CX43)基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体系并进行鉴定,为研究CX43过表达BMSCs在移植物抗宿主病中的作用奠定实验基础。方法采用全骨髓贴壁分离培养法获取小鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞表面标志和成骨、成脂、成内皮细胞诱导分化能力;重组慢病毒载体pHBLV^TM-CX43-GFP、pHBLV^TM-GFP转染BMSCs,未转染慢病毒的BMSCs为空白对照,应用细胞免疫荧光、免疫组化法和Western blot方法检测各组CX43的表达。结果流式细胞术检查示BMSCs表达CD73,CD44,CD29和CD90,不表达CD34,CD105;成骨诱导21d茜素红染色呈红色结节,成脂诱导分化14d可见明显脂滴并油红染色阳性,成内皮细胞诱导分化21d免疫荧光示内皮细胞标识CD31,CD34表达明显增加,接种于Matrigel基底胶上具有成小管能力;免疫荧光、免疫组化和Western blot方法均显示CX43基因修饰的BMSCs的CX43蛋白表达明显增加。结论成功建立了小鼠BMSCs分离培养法和CX43基因体外转染BMSCs体系。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 小鼠 间隙连接蛋白43 慢病毒 转染
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血管生成素-2基因沉默载体构建及其对肝癌细胞的作用
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作者 李霞 何攀文 +2 位作者 韩晓群 吴建红 朱清静 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2017年第4期552-555,共4页
目的:构建血管生成素(ang)-2基因沉默载体,并研究其对肝癌hepG2细胞株的作用。方法:根据ang-2基因序列设计shRNA,并与载体pLVX-shRNA连接,转化感受态细胞,提取质粒测序鉴定。将慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染293T细... 目的:构建血管生成素(ang)-2基因沉默载体,并研究其对肝癌hepG2细胞株的作用。方法:根据ang-2基因序列设计shRNA,并与载体pLVX-shRNA连接,转化感受态细胞,提取质粒测序鉴定。将慢病毒shRNA载体及其辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,在HEK293T细胞中标定其病毒滴度。用包装好的慢病毒以及慢病毒阴性对照感染靶细胞hepG2,感染成功后通过Western Blot方法评价干扰载体对靶基因的干扰效果,并采用MTT法检测其对靶细胞增殖率的影响。结果:酶切鉴定和测序结果证实成功构建了ang-2基因沉默载体。包装并浓缩慢病毒,滴度为1×10~8 TU/ml。将ang-2基因沉默载体感染hepG2细胞,倒置显微镜下可见绿色荧光。Western Blotting检测ang-2蛋白表达水平较对照组明显降低(P〈0.05),而对hepG2细胞增殖率无明显影响。结论:成功构建了ang-2基因沉默载体并感染靶细胞hepG2,证实其对目的基因具有很好的沉默效果。 展开更多
关键词 RNA干扰 ang-2基因 质粒构建 慢病毒 肝癌
慢病毒介导的αB-晶状体蛋白基因沉默对子宫内膜癌ISK细胞增殖和迁移能力的影响 预览
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作者 高瑾 李丽 +2 位作者 赵娟 朱骏 朱江 《现代肿瘤医学》 CAS 2017年第18期2865-2869,共5页
目的:研究αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因在子宫内膜癌增殖和迁移中发挥的作用。方法:利用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默子宫内膜癌ISK细胞系CRYAB基因。通过CCK-8、Transwell和细胞划痕实验分别检测CRYAB基因沉默后细胞增殖和迁移能力... 目的:研究αB-晶状体蛋白(CRYAB)基因在子宫内膜癌增殖和迁移中发挥的作用。方法:利用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默子宫内膜癌ISK细胞系CRYAB基因。通过CCK-8、Transwell和细胞划痕实验分别检测CRYAB基因沉默后细胞增殖和迁移能力的变化。结果:Real-time PCR和Western blot结果均表明成功构建稳定转染的细胞株。CCK-8实验结果显示CRYAB病毒转染组与对照组相比,细胞的增殖能力显著降低(P〈0.05);Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果显示,病毒转染组的细胞迁移率明显低于对照组(P〈0.01)。结论:慢病毒干扰载体能有效抑制CRYAB基因在子宫内膜癌细胞系ISK中的表达,进而抑制细胞增殖和迁移。证实CRYAB在子宫内膜癌侵袭和转移中发挥重要作用。 展开更多
关键词 慢病毒 CRYAB 子宫内膜癌 细胞增殖 迁移
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SFRP5基因沉默促进人类胰腺癌细胞系PANC-1增殖与迁移 预览
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作者 刘保瑞 吴永娜 +3 位作者 王海平 张辉 潘建国 周文策 《基础医学与临床》 CSCD 2017年第10期1434-1439,共6页
目的探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默SFRP5基因对人类胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法构建靶向SFRP5基因特异性shRNA慢病毒载体并转染人胰腺癌PANC-1细胞系,以空白质粒转染阴性对照组,未处理细胞做为空... 目的探讨慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默SFRP5基因对人类胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法构建靶向SFRP5基因特异性shRNA慢病毒载体并转染人胰腺癌PANC-1细胞系,以空白质粒转染阴性对照组,未处理细胞做为空白对照组。用real-time PCR及Western blot检测转染前后SFRP5 RNA以及蛋白的表达;CCK-8实验检测细胞体外增殖能力;使用Transwell小室实验分析细胞侵袭能力;细胞划痕实验分析细胞迁移能力。结果成功建立稳定转染shRNA-SFRP5胰腺癌PANC-1细胞株。SFRP5病毒转染组与阴性对照组及空白对照组相比细胞的增殖能力明显增加(P〈0.01);SFRP5病毒转染组的细胞侵袭、迁移能力明显高于阴性对照组及空白对照组(P〈0.01)。结论 SFRP5慢病毒干扰载体能有效抑制SFRP5基因在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移。 展开更多
关键词 慢病毒 胰腺肿瘤 细胞增殖 迁移
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Gene editing for corneal disease management 预览
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作者 Sudhanshu P Raikwar Apoorva S Raikwar +1 位作者 Shyam S Chaurasia Rajiv R Mohan 《世界转化医学杂志》 2016年第1期1-13,共13页
Gene editing has recently emerged as a promising technology to engineer genetic modifications precisely in the genome to achieve long-term relief from corneal disorders.Recent advances in the molecular biology leading... Gene editing has recently emerged as a promising technology to engineer genetic modifications precisely in the genome to achieve long-term relief from corneal disorders.Recent advances in the molecular biology leading to the development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)and CRISPR-associated systems,zinc finger nucleases and transcription activator like effector nucleases have ushered in a new era for high throughput in vitro and in vivo genome engineering.Genome editing can be successfully used to decipher complex molecular mechanisms underlying disease pathophysiology,develop innovative next generation gene therapy,stem cell-based regenerative therapy,and personalized medicine for corneal and other ocular diseases.In this review we describe latest developments in the field of genome editing,current challenges,and future prospects for the development of personalized genebased medicine for corneal diseases.The gene editing approach is expected to revolutionize current diagnostic and treatment practices for curing blindness. 展开更多
关键词 ADENO-ASSOCIATED virus Clustered Regularly-Interspaced SHORT Palindromic Repeats associated protein 9 Cornea Clustered regularly interspaced SHORT palindromic repeat Double strand breaks GENE EDITING sgRNA GENE targeting Homology directed repair Homologous recombination INDELS Lentiviral vector Protospacer-adjacent motif Transcription activator like effector NUCLEASES Zinc finger NUCLEASES
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ErbB3/Her3基因重组慢病毒的构建及应用 预览
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作者 生秀梅 王正新 《郑州大学学报:医学版》 CAS 北大核心 2016年第5期572-575,共4页
目的:构建慢病毒Lenti-Her3,探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。方法:将ErbB3/Her3基因的两个片段Her3-1和Her3-2分段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,构建慢病毒载体pCDH-Her3,然后将其包装成慢病毒Lenti-Her3; 用Lenti-Her3感染经p44-s... 目的:构建慢病毒Lenti-Her3,探索ErbB3/Her3在p44通路中的作用。方法:将ErbB3/Her3基因的两个片段Her3-1和Her3-2分段克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro,构建慢病毒载体pCDH-Her3,然后将其包装成慢病毒Lenti-Her3; 用Lenti-Her3感染经p44-shRNA沉默的A549细胞,细胞计数法检测细胞的生长情况,Western blot法检测 P44、Her3蛋白的表达。结果:转染p44-shRNA的A549细胞P44蛋白不表达,Her3蛋白表达显著降低,细胞计数显著降低; Lenti-Her3感染后,p44沉默的A549细胞Her3蛋白表达显著增强,细胞计数有所升高(P<0.05),但未达到正常水平。结论:成功构建了重组慢病毒Lenti-Her3; p44可部分通过Her3促进肺癌A549细胞的生长,可能成为肺癌药物研究的新靶点。 展开更多
关键词 慢病毒 Her3 p44
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大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定 预览 被引量:1
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作者 白志勋 陆静 杨亦彬 《贵州医药》 CAS 2016年第7期675-677,共3页
目的构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体,为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础。方法针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列,合成4条干扰(KD)序列。与pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体。将连接... 目的构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体,为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础。方法针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列,合成4条干扰(KD)序列。与pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体。将连接产物转入制备完毕的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆,测序验证。包装慢病毒,以绿色荧光蛋白(GFP)表达水平验证病毒滴度。慢病毒载体感染大鼠NRK-52E细胞后,RTPCR、WB检测及荧光显微镜观察ILK在其细胞中的表达。结果测序验证成功构建3条大鼠ILK-RNAi慢病毒载体,滴度分别为5×10^8,2.5×10^8,3.5×10^8 pfu/mL。分别以不同感染复数(MOI)感染NRK-52E细胞进行内源筛靶,荧光观察80%细胞的绿色荧光蛋白,RT-PCR、WB检测ILK的表达明显下降。相对于阴性对照序列,KD2,KD3在高MOI组中对ILK表达的敲减达到65%以上(P〈0.05),为有效靶点。其中KD2及KD3的ILK 2-△△Ct值分别为0.337,0.217。KD2序列为对ILK的表达抑制最显著。结论成功构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体。 展开更多
关键词 NRK-52E 整合素连接激酶 慢病毒载体
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Fn14-shRNA慢病毒载体的制备 预览
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作者 于涛 杨云峰 +5 位作者 李兵 陈凯 朱辉 张明珠 赵有光 俞光荣 《外科研究与新技术》 2016年第2期96-101,共6页
目的构建Fn14-shRNA慢病毒载体,以进一步进行动物实验,研究Fn14在骨肉瘤中的表达和作用。方法使用RNA干扰技术,构建Fn14干扰载体、病毒包装、感染细胞,并进行鉴定。结果 Fn14-shRNA干扰质粒单酶切验证阳性,测序结果与设计完全一致,干扰... 目的构建Fn14-shRNA慢病毒载体,以进一步进行动物实验,研究Fn14在骨肉瘤中的表达和作用。方法使用RNA干扰技术,构建Fn14干扰载体、病毒包装、感染细胞,并进行鉴定。结果 Fn14-shRNA干扰质粒单酶切验证阳性,测序结果与设计完全一致,干扰组Fn14在稳转细胞株中表达下调。结论成功构建了Fn14-shRNA慢病毒载体,为进一步从分子水平探讨Fn14在骨肉瘤中的生物学作用奠定了基础。 展开更多
关键词 骨肉瘤 细胞表面受体成纤维细胞生长因子诱导14 RNA干扰 慢病毒
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金黄色葡萄球菌肠毒素C3过表达慢病毒载体的构建及鉴定 预览
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作者 谢益欣 王敏 +6 位作者 李先平 杨敏 李碰玲 张婷婷 宋欢 董智慧 唐爱国 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1323-1326,1332共5页
目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3基因片段;用Age I酶切线性化GV365慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;... 目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增SEC3基因片段;用Age I酶切线性化GV365慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA法测定慢病毒载体滴度。结果:获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3慢病毒载体,通过PCR及DNA测序鉴定,证明GV365-SEC3质粒构建正确;转染293T细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 k D大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA检测病毒载体滴度为5×10~8TU/ml。结论:成功构建GV365-SEC3过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌肠毒素C3 慢病毒 载体构建 过表达
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Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株
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作者 温斯健 倪娜娜 +5 位作者 周晓伟 吴琼 王小坡 宋昊 张韡 孙建方 《中国皮肤性病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期998-1002,共5页
目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴... 目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒pLV/helper-SL3,pLV/helper—SIA及pLV/helper—SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine2000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不含目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR(QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证耽扣在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/Neo—CMV〉hRhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×10^8TU/mL。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80%;A375-RhoD组RhoDmRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。 展开更多
关键词 RhoD基因 慢病毒 载体 GATEWAY技术 过表达 A375
大鼠HO-1基因重组慢病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达
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作者 汪文婧 田光 +1 位作者 韩志海 陈旭昕 《国际呼吸杂志》 2016年第14期1071-1075,共5页
目的构建大鼠血红素加氧酶1(HO-1)基因重组慢病毒载体lenti-EGFP—HO-1,并检测其在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达效率。方法利甩聚合酶链反应技术(PCR)扩增rat-HO-1基因,并克隆到pGV287-EGFP载体中,行PCR及测序鉴定所构建的... 目的构建大鼠血红素加氧酶1(HO-1)基因重组慢病毒载体lenti-EGFP—HO-1,并检测其在骨髓间充质干细胞(BMSC)中的表达效率。方法利甩聚合酶链反应技术(PCR)扩增rat-HO-1基因,并克隆到pGV287-EGFP载体中,行PCR及测序鉴定所构建的重组质粒pGV287-EGFP—HO-1;将重组质粒pGV287-EGFPHO-1及辅助包装质粒pHelper1.0、pHelper1.0共转染293细胞进行重组慢病毒Ienti-EGFP—HO-1的包装,并采用荧光标记法检测病毒滴度,再进一步感染BMSC,荧光显微镜下观察感染效果、Western blot检测BMSC内HO-1表达情况。结果大鼠HO-1基因扩增产物大小为911bp,与目的基因相关片段中HO-1cDNA大小一致。阳性克隆行PCR后形成498bp,其大小与目的片段大鼠HO-1cDNA相当,进一步测序鉴定提示与GenBank信息库中rat-HO-1基因mRNA一致。重组慢病毒lenti—GV287-EGFP—HO-1滴度为2×10^8TU/ml,感染BMSC后可观察到报告基因EGFP表达,慢病毒lenti—GV287-EGFP-HO-1感染组中可检测到HO-1蛋白表达。结论本研究成功构建了重组慢病毒载体lenti-GV287-EGFP—HO-1,并能够在BMSC中高效表达,为进一步探索HO-1基因修饰间充质干细胞在肺损伤中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 急性肺损伤 慢病毒 血红素加氧酶-1 骨髓间充质干细胞
大鼠活体内Luciferase标记骨髓间充质干细胞生物发光示踪监测 预览 被引量:3
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作者 曹娟 吕琪 +3 位作者 丁辉 于梦洋 刘晋阳 樊毫军 《中华灾害救援医学》 2016年第1期12-16,共5页
目的应用生物发光技术监测同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在健康大鼠体内的定植与动态分布情况。方法 Wistar大鼠BMSC经稳定表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,e-GFP)... 目的应用生物发光技术监测同种异体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)在健康大鼠体内的定植与动态分布情况。方法 Wistar大鼠BMSC经稳定表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,e-GFP)和荧光素酶(luciferase)基因的慢病毒感染后,经尾静脉注射植入Wistar大鼠体内,通过活体成像连续监测其动态分布。结果活体成像结果显示,植入感染病毒的骨髓间充质干细胞(Luc-GFP-BMSC)1.5 h后在大鼠体内生物信号最强,主要聚集在肺,24 h后背部信号增强并居于主导,第3天胸部信号检测不到,14 d后,全身生物信号消失。结论同种异体大鼠BMSC经尾静脉植入后,首先聚集于肺部,弥散分布于背部,最终信号逐渐消失,提示经尾静脉注射植入可能是BMSC治疗肺部疾病的有效途径。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 生物发光 活体成像 慢病毒
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慢病毒介导的SEMA3G过表达对人胰腺癌细胞系PANC-1的作用 预览
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作者 高增法 高效 +3 位作者 吴永娜 白仲添 张磊 李汛 《基础医学与临床》 CSCD 2016年第7期891-895,共5页
目的 通过体外实验探讨过表达SEMA3G对人胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将携带SEMA3G的慢病毒载体转染人胰腺癌PANC-1细胞系,利用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白质水平。CCK-8法检测细胞增殖,tr... 目的 通过体外实验探讨过表达SEMA3G对人胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将携带SEMA3G的慢病毒载体转染人胰腺癌PANC-1细胞系,利用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白质水平。CCK-8法检测细胞增殖,transwell实验检测细胞侵袭和细胞划痕试验检测细胞的迁移。结果 成功建立稳定转染SEMA3G胰腺癌PANC-1细胞系。SEMA3G病毒感染组与空白对照组和阴性对照组相比细胞的增殖能力显著降低(P〈0.05),SEMA3G病毒感染组的细胞侵袭和迁移能力明显低于两组对照组(P〈0.05)。结论 SEMA3G慢病毒载体能有效过表达人胰腺癌PANC-1细胞中内源性SEMA3G蛋白,进而抑制细胞增殖、侵袭和迁移。 展开更多
关键词 慢病毒 胰腺癌 细胞增殖 迁移
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