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慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
PTEN调控大鼠原始卵泡启动和生长 预览
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作者 洪雯丽 黄瑶琪 +4 位作者 祝费隐 郑月慧 李佳 戴峻 张立霞 《基础医学与临床》 CSCD 2019年第8期1077-1084,共8页
目的探讨PTEN对大鼠原始卵泡激活和生长的调控作用和机制。方法2日龄大鼠卵巢在Waymouth培养系统中培养0、4和8d,用HE染色检测慢病毒PTENsiRNA的沉默效率及其对原始卵泡生长启动情况。同步用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化... 目的探讨PTEN对大鼠原始卵泡激活和生长的调控作用和机制。方法2日龄大鼠卵巢在Waymouth培养系统中培养0、4和8d,用HE染色检测慢病毒PTENsiRNA的沉默效率及其对原始卵泡生长启动情况。同步用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色检测PTENmRNA和蛋白在卵泡生长中的表达和动态变化;用慢病毒PTEN-shRNA沉默卵巢中PTEN表达后,观察对原始卵泡启动生长及雌二醇和孕酮分泌的影响;此外,利用PI3K抑制剂LY294002探讨了PTEN在原始卵泡形成过程中的可能信号通路。结果PTENmRNA和蛋白在原始卵泡中均有表达,随着原始卵泡的发育,其表达水平降低(P<0.01);经PTEN-shRNA慢病毒转染后,荧光成像显示慢病毒在体外已成功转染到卵巢组织,HE染色显示原始卵泡数量减少(P<0.01),表明PTEN参与了原始卵泡的起始。结论PTEN可通过PI3K信号通路和调节雌、孕激素分泌调控原始卵泡发育。它在原始卵泡的发育启动中起着重要的作用。 展开更多
关键词 PTEN 原始卵泡 慢病毒 RNA干扰
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PGRN过表达慢病毒载体的构建与鉴定
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作者 李敬 张玉英 +5 位作者 李树林 李森 刘春霄 李家仪 王红艳 梁淑娟 《潍坊医学院学报》 2019年第4期244-246,316,F0003,共5页
目的构建针对颗粒蛋白前体(PGRN)基因的过表达载体,鉴定PGRN基因过表达效率,研究其对胃癌细胞的生物学效应的影响。方法 PCR扩增获得人EPO基因信号肽与PGRN成熟蛋白编码的融合序列,经酶切、连接到慢病毒载体Plenti6/V5上,通过菌落PCR、... 目的构建针对颗粒蛋白前体(PGRN)基因的过表达载体,鉴定PGRN基因过表达效率,研究其对胃癌细胞的生物学效应的影响。方法 PCR扩增获得人EPO基因信号肽与PGRN成熟蛋白编码的融合序列,经酶切、连接到慢病毒载体Plenti6/V5上,通过菌落PCR、双酶切和DNA测序验证构建出Plenti6/V5-epo-PGRN载体,转染293T细胞的制备慢病毒。经纯化和病毒滴定后,感染BGC-823细胞并建立过表达胃癌细胞株,提取细胞总RNA和总蛋白,分别用RT-PCR法和WB法测定PGRN分子及蛋白过表达的水平,用MTT法和克隆形成检测细胞增殖能力。结果成功构建出PGRN过表达慢病毒载体,RT-PCR和WB分别显示过表达组BGC-823细胞表达PGRN的mRNA和蛋白较对照组明显增加,细胞增殖和克隆形成能力明显增强。结论构建的PGRN慢病毒过表达载体在分子与蛋白水平上明显上调BGC-823细胞株PGRN的表达,促进胃癌细胞的增殖。 展开更多
关键词 颗粒蛋白前体 过表达 慢病毒
稳定过表达人源SAMHD1基因细胞株的建立及其抗病毒活性的研究 预览
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作者 武晋英 张洲 +5 位作者 李子威 王昊然 操孙润 李宇恒 宋晓宇 曹流 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期128-131,143共5页
目的建立慢病毒介导的稳定过表达人源SAMHD1基因的结肠癌细胞株,观察SAMHD1对细胞抗1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染能力的影响。方法利用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP慢病毒载体新构建了p CDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP重组质粒,测序鉴定成功后,... 目的建立慢病毒介导的稳定过表达人源SAMHD1基因的结肠癌细胞株,观察SAMHD1对细胞抗1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染能力的影响。方法利用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP慢病毒载体新构建了p CDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP重组质粒,测序鉴定成功后,将重组质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集病毒液,浓缩后感染人结肠癌细胞,构建过表达细胞株。利用HSV-1感染过表达细胞株并与对照组比较,通过Western blotting和免疫荧光检测病毒感染效率。结果基因测序结果显示成功构建了重组质粒;Western blotting检测稳定过表达人源SAMHD1结肠癌细胞株构建成功;Western blotting和免疫荧光结果显示过表达人源SAMHD1的细胞株能够有效抑制HSV-1病毒感染和复制。结论成功构建慢病毒介导的稳定过表达人源SAMHD1基因细胞株,过表达人源SAMHD1的细胞株能有效抑制HSV-1病毒复制,为进一步深入研究SAMHD1蛋白生物学功能提供保障。 展开更多
关键词 SAMHD1 结肠癌 慢病毒 1型单纯疱疹病毒
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经睾丸输出小管注射慢病毒对Wistar大鼠生殖系统的影响
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作者 狄钰 陈东山 阎磊 《山东大学学报:医学版》 CAS 北大核心 2019年第5期67-73,共7页
目的探讨慢病毒高毒性物质稳定转基因技术对雄性Wistar大鼠生殖系统的影响。方法构建PAX2稳定干扰的含有绿色荧光蛋白的慢病毒,将该病毒溶液用台盼蓝标记,通过34 G针头注入16只Wistar大鼠睾丸输出小管。2周后用超声监测睾丸实质,1个月... 目的探讨慢病毒高毒性物质稳定转基因技术对雄性Wistar大鼠生殖系统的影响。方法构建PAX2稳定干扰的含有绿色荧光蛋白的慢病毒,将该病毒溶液用台盼蓝标记,通过34 G针头注入16只Wistar大鼠睾丸输出小管。2周后用超声监测睾丸实质,1个月后将大鼠处死,取出睾丸及其附属腺体,免疫荧光染色及HE染色观察组织结构形态。结果大鼠睾丸输出小管注射,共有8只注射成功,均出现不同程度的睾丸曲精小管凋亡坏死,部分小管腔内可见报告基因的高表达,附睾上皮未出现明显的转染情况,而精囊腺上皮细胞出现不同程度的绿色荧光蛋白高表达。结论睾丸和附睾不适合雄性动物的慢病毒转染,并且该处转染容易影响精子的成熟和发育,而精囊腺注射慢病毒建立转基因动物模型具有可行性。 展开更多
关键词 睾丸输出小管 慢病毒 转基因 精囊腺 附睾
慢病毒介导shRNA干扰MAT2A与MAT2B基因抑制猪肌内脂肪细胞分化 预览
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作者 赵存真 易本驰 +3 位作者 陈培荣 李建柱 赵云焕 朱忠珂 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第15期2706-2715,共10页
【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3... 【目的】腺苷甲硫氨酸转移酶(MAT)在ATP的作用下,催化生成体内重要的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)。通过构建慢病毒介导的pLenti-H1干扰载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶MAT2A和MAT2B对猪肌内脂肪细胞分化的影响。【方法】无菌条件下采集3—7日龄小猪背最长肌,采用差速贴壁法分离猪肌内脂肪细胞。根据GenBank中猪MAT2A基因序列(AccessionNo.NM001167650.1)和MAT2B基因序列(AccessionNo.NM001142832.1),获得其CDS序列。利用Invitrogen公司在线软件BLOCK-iTTM RNAi Designer分别设计shRNA靶序列,将合成的单链寡核苷酸退火形成双链,与经过Bam H I和Xho I (TaKaRa)双酶切后的pLenti-Hl载体连接,转化,并提取质粒进行酶切和测序鉴定。采用X-tremeGENE-HP DNA转染试剂与测序成功的重组质粒以及包装质粒(CMV-Δ8.9和CMV-VSVG)共转染293T细胞,48 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,并进行滴度测定。在猪原代脂肪细胞密度达到70%—80%时,侵染病毒;细胞密度融合时诱导分化。提取分化第8天的猪肌内脂肪细胞的RNA,按照反转录试剂盒操作说明进行反转录,合成cDNA第一链。采用primer primer 5软件设计MAT2A、MAT2B、PPARγ、aP2、CEBP/α、β-actin基因的定量引物,实时定量和Western blot试验检测MAT2A和MAT2B基因的干扰效率。油红O染色和实时定量鉴定MAT2A和MAT2B基因对猪肌内脂肪脂质积累的影响。【结果】酶切及测序证明重组慢病毒载体pLenti-Hl-MAT2A/MAT2B构建成功;包装的慢病毒sh-MAT2A和sh-MAT2B病毒滴度分别为6.7×107和7×107 pfu/mL,侵染肌内脂肪细胞72 h后,可出现90%的绿色荧光蛋白(GFP),表明所包装的病毒可满足侵染猪前体肌内脂肪细胞需要。实时定量结果显示其显著抑制了MAT2A和MAT2B的m RNA水平表达,其干扰效率分别在70%和60%以上;进一步采用Western blot试验及蛋白分析表明,干扰MAT2A基因后,MAT2A蛋白表达水平降低40%左右,差异达到极显著水平(P<0.01 展开更多
关键词 腺苷甲硫氨酸转移酶2A 腺苷甲硫氨酸转移酶2B 慢病毒 肌内脂肪细胞
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大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响 预览
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作者 宋衍秋 毛用敏 +1 位作者 秦勤 丛洪良 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期122-126,226-227共6页
目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列... 目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列,构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒,测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组(Normal组),空载慢病毒组(Lv-rAdrb3-shRNA-control组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组(Lv-rAdrb3-shRNA-1组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组(Lv-rAdrb3-shRNA-2组),感染5 d后,收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白,Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达,Western blot检测rAdrb3蛋白表达。结果构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,滴度均为2×10~8TU/mL。慢病毒感染大鼠VSMC 72 h后,感染效率可达80%。与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、65.27%(P<0.05);与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、70.04%(P<0.05)。结论成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。 展开更多
关键词 受体 肾上腺素能β3 RNA干扰 慢病毒 慢性心力衰竭 血管平滑肌细胞
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人GINS2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在上皮性卵巢癌中的表达 预览
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作者 严婷 叶艾竹 +1 位作者 江恩利 王玉娟 《贵州医药》 CAS 2019年第5期679-682,I0001共5页
目的构建人GINS2基因RNA干扰慢病毒表达载体,并建立稳定干扰GINS2基因表达的上皮性卵巢癌细胞系,为研究GINS2蛋白在上皮性卵巢癌发生发展中的作用奠定基础。方法针对GINS2基因序列,按照RNAi序列的设计原则,设计、合成GINS2基因特异性小... 目的构建人GINS2基因RNA干扰慢病毒表达载体,并建立稳定干扰GINS2基因表达的上皮性卵巢癌细胞系,为研究GINS2蛋白在上皮性卵巢癌发生发展中的作用奠定基础。方法针对GINS2基因序列,按照RNAi序列的设计原则,设计、合成GINS2基因特异性小分子干扰siRNA(small interference RNA,siRNA)靶点,与慢病毒构建重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获取正确克隆。将筛选出的最有效重组载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞并测定病毒滴度。随后将其感染上皮性卵巢癌SKOV3细胞株细胞,采用Real-time PCR 检测靶基因的沉默效率。结果慢病毒RNA干扰载体经酶切和测序鉴定证实准确连接测序正确,且包装出来的病毒纯化后滴度达5×10^8TU/mL。RT-qPCR、Western blot结果显示感染后GINS2 mRNA及蛋白水平显著下降。结论成功构建了人GINS2基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得了GINS2基因稳定干扰的上皮性卵巢癌SKOV3细胞系。 展开更多
关键词 上皮性卵巢癌 GINS2 RNA干扰 慢病毒
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miR-186海绵载体的构建及其在EA.hy926细胞株中的表达 预览
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作者 王梦旭 李胜男 +3 位作者 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 《吉林大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期498-503,I0002共7页
目的:构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法:化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到H... 目的:构建微小RNA-186(miR-186)基因的海绵载体,建立稳定敲减miR-186的EA.hy926细胞株。方法:化学合成miR-186海绵体序列,并克隆到慢病毒FV040表达载体上;采用lipofectamine 2000共转染FV040-miR-186-sponge载体和慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞,包装慢病毒,测定病毒滴度;FV040-control慢病毒作为对照组,FV040-miR-186-sponge作为实验组,分别感染EA.hy926细胞,筛选稳转细胞株;采用荧光定量PCR(qPCR)法检测空白对照组、FV040-control对照组及FV040-miR-186-sponge实验组中EA.hy926细胞miR-186的相对表达水平。结果:测序结果显示克隆的目的基因序列与设计的miR-186海绵体序列完全一致。在感染的EA.hy926细胞中观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。FV040-control包装的慢病毒滴度为2×108TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge组慢病毒滴度为6×108TU·mL^-1;成功建立了稳定表达miR-186-sponge的EA.hy926细胞株,感染效率达95%;qPCR检测,与空白对照组和FV040-control组比较,FV040-miR-186-sponge组EA.hy926细胞中miR-186相对表达水平降低(P<0.01)。结论:成功构建了miR-186基因的海绵载体,建立了稳定下调miR-186表达的EA.hy926-miR-186-sponge细胞株。 展开更多
关键词 微小RNA-186 海绵体 慢病毒 EA.hy926细胞
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前列腺特异性启动子在慢病毒介导基因治疗中的研究进展 预览
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作者 魏绪磐 杨波 +4 位作者 李文娟 张发 梁梦天 吕海迪 周逢海 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第16期2958-2961,共4页
前列腺癌多发生于老年男性,其发病率和死亡率正在逐年上升。对于早期前列腺癌,采用阻断雄激素的去势治疗可以有效抑制肿瘤生长,但在治疗2~3年后大部分进展为去势抵抗性前列腺癌,这是导致患者死亡的主要原因。目前,对晚期尤其是去势抵抗... 前列腺癌多发生于老年男性,其发病率和死亡率正在逐年上升。对于早期前列腺癌,采用阻断雄激素的去势治疗可以有效抑制肿瘤生长,但在治疗2~3年后大部分进展为去势抵抗性前列腺癌,这是导致患者死亡的主要原因。目前,对晚期尤其是去势抵抗性前列腺癌尚缺乏有效的治疗策略,随着生物技术的兴起与发展,针对恶性肿瘤的生物靶向治疗研究日趋深入和成熟,其中慢病毒介导的基因治疗成为研究的热点。运用特异性启动子调控相关基因的表达,可以进一步提高抗肿瘤的靶向性和安全性。本文就目前在基础研究中,前列腺特异性启动子在慢病毒介导下基因靶向治疗前列腺癌的研究现状进行综述。 展开更多
关键词 前列腺癌 慢病毒 基因启动子 靶向治疗 基因治疗
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高表达Per2基因的胶质瘤干细胞下调其基质金属蛋白酶2的研究 预览
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作者 古禹 梁彦斌 +3 位作者 刘文斌 张静远 姚健 夏鹤春 《宁夏医科大学学报》 2019年第4期332-335,共4页
目的构建Period2(Per2)基因过表达的U87胶质瘤干细胞,检测Per2基因过表达U87胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的mRNA及蛋白的表达变化。方法以Per2基因过表达慢病毒转染U87胶质瘤干细胞,然后对U87胶质瘤干细胞进行转染,通过嘌呤霉... 目的构建Period2(Per2)基因过表达的U87胶质瘤干细胞,检测Per2基因过表达U87胶质瘤干细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)的mRNA及蛋白的表达变化。方法以Per2基因过表达慢病毒转染U87胶质瘤干细胞,然后对U87胶质瘤干细胞进行转染,通过嘌呤霉素筛选,用real-timePCR和Westernblot技术鉴定得到Per2基因过表达的U87胶质瘤干细胞,空载体转染的U87胶质瘤干细胞和U87胶质瘤干细胞未转染组作为对照。结果此次转染成功构建Per2基因过表达U87胶质瘤干细胞系,过表达组细胞内Per2基因的mRNA和蛋白表达量明显高于其他两组细胞,MMP-2mRNA及蛋白表达量在Per2基因过表达U87胶质瘤干细胞内明显降低。结论U87胶质瘤干细胞高表达Per2基因能够下调其MMP-2。 展开更多
关键词 Priod2基因 U87胶质瘤干细胞 基质金属蛋白酶2因子 慢病毒
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MPST基因慢病毒载体的构建及在SH-SY5Y细胞中的表达
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作者 范海琼 孙达权 +3 位作者 柳香香 王念 徐国强 潘际刚 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期1812-1816,共5页
为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染2... 为构建MPST基因慢病毒表达载体,获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,本研究通过PCR扩增出MPST目的基因,将其克隆到慢病毒表达载体p EB-GFP (T2A) PURO上,将重组慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒系统(pLP/VSVG, pLP1, p LP2)共转染293T细胞,用获得重组的慢病毒液感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达MPST基因的(SH-MPST)细胞株。采用Real-time PCR和Western blotting以及ELISA等方法对筛出来的SH-MPST中的MPST的表达及功能进行鉴定。与空转染组(SH-PEB)相比,SH-MPST细胞中MPST mRNA及蛋白的表达水平显著增加,且细胞内MPST酶活性、酶含量及细胞释放硫化氢的水平均显著增加(p<0.05)。以上研究表明,MPST基因慢病毒表达载体成功构建,并获得稳定表达外源MPST基因的SH-SY5Y细胞株,这将为MPST功能的深入研究提供依据。 展开更多
关键词 慢病毒 MPST 过表达 SH-SY5Y细胞 硫化氢
UGT1A1基因Q239X突变型过表达慢病毒载体的构建及病毒包装 预览
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作者 羊希 赵薇 钟丹妮 《山东医药》 CAS 2019年第11期9-12,共4页
目的构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因Q239X突变型过表达慢病毒载体并进行慢病毒包装。方法 设计合成UGT1A1基因Q239X突变型片段,将纯化的UGT1A1基因Q239X突变型片段与线性化的慢病毒表达载体GV358DNA进行连接反应,构建GV... 目的构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因Q239X突变型过表达慢病毒载体并进行慢病毒包装。方法 设计合成UGT1A1基因Q239X突变型片段,将纯化的UGT1A1基因Q239X突变型片段与线性化的慢病毒表达载体GV358DNA进行连接反应,构建GV358-UGT1A1(p.Q239X)慢病毒表达载体。利用PCR及DNA测序鉴定GV358-UGT1A1(p.Q239X)阳性克隆;将构建成功的GV358-UGT1A1(p.Q239X)慢病毒表达载体和辅助包装质粒共转染293T细胞,进行病毒包装,并用梯度稀释法测定病毒滴度。结果 通过PCR技术成功地扩增UGT1A1基因Q239X突变型片段并连接到GV358载体上,PCR鉴定及DNA测序结果示GV358-UGT1A1(p.Q239X)慢病毒表达载体构建成功。转染293T细胞后可观察到绿色荧光蛋白表达,测定其浓缩病毒滴度为2×108TU/mL。结论 UGT1A1基因Q239X突变型过表达慢病毒载体构建成功,包装获得高滴度慢病毒,为UGT1A1基因的后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1 Q239X突变型 过表达 慢病毒
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Dectin-1慢病毒过表达载体的构建与鉴定
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作者 沈林霞 徐红艳 刘栋华 《中国皮肤性病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期507-512,共6页
目的通过构建Dectin-1慢病毒过表达载体,感染巨噬细胞RAW264.7,建立Dectin-1过表达的巨噬细胞模型。方法根据小鼠Dectin-1基因序列设计引物,经PCR扩增目的基因后克隆至载体pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST(MCS),获得重组质粒pLenti6.3-dec... 目的通过构建Dectin-1慢病毒过表达载体,感染巨噬细胞RAW264.7,建立Dectin-1过表达的巨噬细胞模型。方法根据小鼠Dectin-1基因序列设计引物,经PCR扩增目的基因后克隆至载体pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST(MCS),获得重组质粒pLenti6.3-dectin-1-IRES-EGF。经和包装质粒Mix共同转染293T细胞,收获慢病毒,利用293T细胞大量扩增慢病毒并进行慢病毒的滴度测定,根据MOI值感染巨噬细胞RAW264.7,经荧光显微镜和荧光定量PCR鉴定感染慢病毒组和感染空病毒组中Dectin-1基因的表达。结果PCR和测序结果证明已成功构建pLenti6.3-dectin-1-IRES-EGFP,成功包装慢病毒,计算慢病毒滴度为3.12×10~9 Tu/mL,成功感染巨噬细胞RAW264.7,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR检测到感染重组慢病毒组Dectin-1表达量是感染空病毒组的1 275倍(P<0.01)。结论成功构建Dectin-1基因过表达的巨噬细胞模型,为进一步研究Dectin-1基因在巨噬细胞对抗真菌感染中的作用打下基础。 展开更多
关键词 慢病毒 DECTIN-1 真菌
应用基于重组慢病毒的CRISPR/Cas9技术构建基因突变的鸡DF1细胞 预览
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作者 靳泽华 谢梦利 +4 位作者 易辰阳 黄英 付磊 王晓萍 张安定 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期83-88,共6页
为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否... 为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1220bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300bp和900bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 慢病毒 鸡DF1细胞 基因编辑
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钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ RNA干扰载体构建及对破骨细胞分化和骨吸收的影响 预览
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作者 王艺睿 王会 +3 位作者 戚孟春 董伟 冯晓洁 孙红 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期557-561,共5页
目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)RNA干扰对破骨细胞分化和骨吸收的影响。方法构建3个CaMKⅡγRNA慢病毒重组干扰载体;阴性载体转染RAW264.7细胞,确定最适转染滴度值(MOI)和转染效率。用重组载体转染细胞,确定干扰效果最佳的... 目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ(CaMKⅡγ)RNA干扰对破骨细胞分化和骨吸收的影响。方法构建3个CaMKⅡγRNA慢病毒重组干扰载体;阴性载体转染RAW264.7细胞,确定最适转染滴度值(MOI)和转染效率。用重组载体转染细胞,确定干扰效果最佳的重组载体用于后续实验。细胞分为对照组、阴性载体组、干扰载体组;病毒转染5d后通过TRAP染色及牙本质磨片骨吸收陷窝检测3组破骨细胞生成及骨吸收情况。结果成功构建了3个CaMKⅡγ重组干扰载体;最适MOI值为30,转染效率>80%。#3重组载体干扰效果最佳,干扰效率在mRNA及蛋白水平分别为78.16%和67.02%(P<0.01)。3组细胞中,干扰载体组多核破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数和面积较对照组分别下降了59.99%、54.19%和57.94%(P<0.01),而阴性载体组和对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论CaMKⅡγRNA干扰可显著抑制破骨细胞生成和骨吸收功能。 展开更多
关键词 钙调蛋白依赖性激酶IIγ 破骨细胞 RNA干扰 慢病毒
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大鼠神经元型一氧化氮合酶基因慢病毒载体的构建及功能测定
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作者 朱贤慧 张蕾 +5 位作者 杜紫薇 徐楚 孙楠 周亚萍 张宇 周其冈 《南京医科大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期841-845,861共6页
目的:构建编码大鼠神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)全长基因的慢病毒载体,并检测其表达效率和催化活性功能。方法:采用RT-PCR提取nNOS的cDNA,同时改造真核表达载体pCDH-GFP。鉴定nNOS的cDNA碱基序列正确后,... 目的:构建编码大鼠神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)全长基因的慢病毒载体,并检测其表达效率和催化活性功能。方法:采用RT-PCR提取nNOS的cDNA,同时改造真核表达载体pCDH-GFP。鉴定nNOS的cDNA碱基序列正确后,将目的基因克隆入慢病毒载体pCDH-GFP,得重组载体pCDH-GFP/nNOS,采用Lipofectamine 2000将其及慢病毒包装辅助质粒转染293T细胞,超速离心纯化后,感染神经干细胞和海马齿状回神经元进行感染能力鉴定,并检测nNOS蛋白表达和催化功能。结果:成功构建编码nNOS全长cDNA,测序证明重组慢病毒载体pCDH-GFP/nNOS构建成功。包装慢病毒颗粒LV-nNOS-GFP可以感染离体神经干细胞和在体神经元。Western blot检测证明nNOS蛋白成功表达。一氧化氮浓度检测表明表达的nNOS具有催化活性。结论:慢病毒载体LV-nNOS-GFP构建成功,可以表达功能性全长nNOS蛋白。 展开更多
关键词 神经元型一氧化氮合酶 慢病毒 神经干细胞 一氧化氮
YAP过表达稳定细胞系的建立及与结肠癌细胞增殖的关系
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作者 晋兰 赵鑫华 郭阳 《湖北医药学院学报》 CAS 2019年第1期15-19,共5页
目的:研究YAP对结肠癌细胞增殖的影响。方法:利用四质粒慢病毒感染系统建立过表达YAP稳定细胞系,通过细胞计数和克隆形成检测过表达YAP对结肠癌细胞增殖的影响。结果:过表达YAP稳定细胞系中,YAP的mRNA和蛋白水平明显增加;过表达YAP能促... 目的:研究YAP对结肠癌细胞增殖的影响。方法:利用四质粒慢病毒感染系统建立过表达YAP稳定细胞系,通过细胞计数和克隆形成检测过表达YAP对结肠癌细胞增殖的影响。结果:过表达YAP稳定细胞系中,YAP的mRNA和蛋白水平明显增加;过表达YAP能促进结肠癌细胞增殖。结论:本研究初步证实YAP能促进细胞的增殖,为结肠癌的治疗提供了新的方向。 展开更多
关键词 YAP 结肠癌 慢病毒 细胞增殖
慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定 被引量:1
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作者 钟纯燕 主性 +6 位作者 李基棕 毛立 李文良 郝飞 刘茂军 嵇辛勤 肖芳 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期50-57,共8页
拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴... 拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴定及测序正确,再克隆于pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体,构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒pCDH-miR-222-GFP。将pCDHmiR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞,制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒VPCDH+miR-222。用制备成功的慢病毒VPCDH+miR-222感染MDBK细胞,经Puromycin嘌呤霉素筛选,荧光显微镜观察感染效率。结果显示,pCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功,序列比对符合率达100%。将pCDH-miR-222-GFP、PSP和PMD共转染后,通过荧光显微镜观察到293T细胞分布大量的荧光,说明成功构建了重组慢病毒VPCDH+miR-222,经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后,VPCDH+miR-222在MDBK细胞中仍具有感染效率。本研究成功获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为进一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 bta-miR-222 MDBK细胞 慢病毒
黑色素转铁蛋白重组慢病毒载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的功能验证 预览
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作者 杨悦 李婉 卢春 《江苏大学学报:医学版》 CAS 2019年第3期216-220,共5页
目的:构建黑色素转铁蛋白(melanotransferrin,MFI2)基因嵌入的慢病毒载体,上调宫颈癌HeLa细胞中MFI2表达水平,并探讨MFI2对HeLa细胞增殖的影响。方法:以HeLa细胞cDNA为模板复制扩增MFI2相应片段,并将该单边对应序列嵌入到慢病毒载体pHAG... 目的:构建黑色素转铁蛋白(melanotransferrin,MFI2)基因嵌入的慢病毒载体,上调宫颈癌HeLa细胞中MFI2表达水平,并探讨MFI2对HeLa细胞增殖的影响。方法:以HeLa细胞cDNA为模板复制扩增MFI2相应片段,并将该单边对应序列嵌入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen(pHAGE)质粒中构建pHAGE-MFI2重组质粒;将重组质粒与包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2协同转染入人胚肾上皮293T细胞,制备MFI2融合病毒,通过梯度稀释法检测病毒滴度。以MFI2融合病毒感染HeLa细胞,通过免疫印迹法检测MFI2标签在细胞中的表达量,采用CCK-8法及划痕实验评价上调MFI2表达量对HeLa细胞扩增能力的影响。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果均证实pHAGE-MFI2质粒构建成功;通过慢病毒三质粒协同包装系统成功构建MFI2基因融合慢病毒,病毒液滴度高达6×10^7TU/mL;MFI2慢病毒感染HeLa细胞后,其MFI2的蛋白表达水平明显增高,而细胞增殖活力则显著降低。结论:MFI2高表达可有效抑制HeLa细胞增殖。 展开更多
关键词 黑色素转铁蛋白 宫颈癌 慢病毒 增殖
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