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siRNA沉默POLE2基因表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响
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作者 李娜苗 张莹莹 +4 位作者 范亚莉 赵钰玲 董娅 白洁 李建英 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第1期35-40,共6页
目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切... 目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切后产生GV115-shPOLE2慢病毒载体。该载体含有绿色荧光蛋白(GFR),经聚合酶链式反应(PCR)筛选出阳性克隆并测序鉴定。将GV115-shPOLE2、Helper1.0、Helper2.0质粒共感染包装293T细胞,包装成假病毒颗粒并感染非小细胞肺癌A549细胞,经免疫印迹法(Western blot)检测筛选POLE2 siRNA有效靶点,从而进行细胞功能学实验。CCK-8法检测POLE2基因沉默对于细胞增殖能力的影响;克隆形成实验检测POLE2基因沉默对细胞克隆形成能力的影响;Casepase3/7检测POLE2基因沉默对细胞凋亡的影响。结果:RT-PCR结果证实POLE2基因在三株细胞中表达丰度均为高表达。PCR和测序结果显示,GV115-shPOLE2慢病毒载体构建正确,经Western blot法证明POLE2 siRNA对于POLE2的外源表达有明显沉默作用,是有效靶点。慢病毒转染A549细胞后细胞增殖明显减缓,细胞克隆数减少,凋亡细胞数增多,与转染阴性对照病毒的A549细胞组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi技术沉默POLE2基因表达后,POLE2 siRNA明显抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖。 展开更多
关键词 慢病毒转染 基因 非小细胞肺癌 RNA干扰
慢病毒介导的微小RNA-191对小鼠视网膜新生血管的抑制作用
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作者 刘勃实 东莉洁 +9 位作者 李筱荣 张琰 张明亮 刘勋 黄亮瑜 吴绵绵 徐嫚鸿 苏睿虹 张哲 韩金栋 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期475-479,共5页
目的观察慢病毒介导(LV)的微小RNA (miR)-191对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用。方法7日龄C57BL/6J小鼠80只,随机分为正常组、非干预组、LV miR-191 (LV-191)组、生理盐水(NS)组、LV-绿色荧光蛋白(GFP)组... 目的观察慢病毒介导(LV)的微小RNA (miR)-191对氧诱导视网膜病变(OIR)模型小鼠视网膜新生血管(RNV)的抑制作用。方法7日龄C57BL/6J小鼠80只,随机分为正常组、非干预组、LV miR-191 (LV-191)组、生理盐水(NS)组、LV-绿色荧光蛋白(GFP)组,每组均为16只。参照文献方法建立OIR小鼠模型。12日龄时,LV-191组、NS组、LV-GFP组,小鼠右眼玻璃体腔分别注射1 μl LV-191、NS、LV-GFP;正常组、非干预组小鼠不做处理。视网膜铺片观察视网膜无灌注区相对面积,病理切片计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;实时定量PCR (RT-PCR)检测小鼠视网膜中LV-191、p21 mRNA相对表达量。结果正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜无灌注区面积比较,差异有统计学意义(F=127.20,P<0.001);突破内界膜的血管内皮细胞核计数比较,差异有统计学意义(F=31.71 ,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,正常组、非干预组、LV-191组、NS组、LV-GFP组小鼠视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=10.95、15.60,P<0.05、<0.05)。与正常组、非干预组、NS组、LV-GFP组小鼠比较,LV-191组视网膜中miR-191、p21 mRNA相对表达量均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的miR-191可通过上调p21表达抑制RNV的生成。 展开更多
关键词 视网膜新生血管化/预防和控制 慢病毒感染 动物实验
慢病毒介导PTEN-Long过表达抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠移植瘤的生长 预览
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作者 耿连婷 李春晖 +3 位作者 单小松 郑亚北 曾昭穆 郑克彬 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第11期1743-1748,共6页
背景:第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10,PTEN)的翻译变体(PTEN-Long)是新发现的一种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发展密切相关。目的:探讨PTEN-Long对人脑胶质瘤U25... 背景:第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10,PTEN)的翻译变体(PTEN-Long)是新发现的一种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发展密切相关。目的:探讨PTEN-Long对人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤生长的抑制作用及相关分子机制。方法:①人脑胶质瘤细胞U251购自国家实验细胞资源共享服务平台北京总部,实验将未感染慢病毒的U251为对照组,感染LV-EGFP的U251为空载组,感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251为过表达组,用荧光显微镜、Western blot检测转染效率;②实验将购自北京华阜康生物科技股份有限公司的BALB/c-nu雄性裸鼠随机分为3组,将3组细胞分别接种于裸鼠背部皮下,观察裸鼠一般状况及肿瘤生长趋势,分析各组裸鼠皮下肿瘤的体积及质量变化,免疫组织化学染色法检测肿瘤中PTEN-Long,p-Akt及NF-κB p65蛋白表达变化情况。结果与结论:①一般状况:PTEN-Long过表达后可抑制裸鼠皮下胶质瘤细胞的增殖,与对照组及空载组相比,过表达组裸鼠肿瘤体积及质量减少(P<0.01);②免疫组织化学染色显示:与对照组及空载组相比,过表达组PTEN-Long表达量增加(P<0.05),p-Akt及NF-κB p65表达量降低(P<0.05);③结果显示:PTEN-Long可抑制人脑胶质瘤U251细胞裸鼠异体移植瘤的生长,机制可能与下调PI3K-AKT-NF-κB信号通路有关。 展开更多
关键词 胶质瘤 U251细胞 慢病毒 PTEN-Long p-Akt NF-κB p65 裸鼠 动物模型 皮下接种 神经胶质瘤 模型 动物 慢病毒感染 组织工程
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结缔组织生长因子重组干扰载体慢病毒颗粒的构建及其对视网膜血管内皮细胞内源性结缔组织生长因子表达的抑制作用
4
作者 牛瑞 东莉洁 +4 位作者 马腾 杜雪利 何燕华 崔伟娜 胡博杰 《中华眼底病杂志》 CSCD 北大核心 2018年第6期580-585,共6页
目的构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰... 目的构建结缔组织生长因子(CTGF)重组干扰载体(shRNA),观察其对视网膜血管内皮细胞内源性CTGF表达的抑制作用。 方法构建人源CTGF shRNA,应用三质粒包装系统获得高滴度的CTGF shRNA慢病毒颗粒。感染视网膜血管内皮细胞,利用干扰载体中的红色荧光标记示踪并筛选慢病毒的最佳感染复数及起效时间。将细胞分为空白对照组(正常培养)、感染对照组(Scramble shRNA病毒感染)及CTGF敲低组(CTGF shRNA病毒感染)。通过Transwell细胞迁移实验观察3组细胞的迁移能力;实时定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测3组细胞的结缔组织生长因子(CTGF)、纤连蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)的mRNA和蛋白表达。3组间数据比较采用方差分析。 结果CTGF shRNA的最佳感染复数为20,最佳起效时间是72 h。Transwell细胞迁移实验结果显示,CTGF敲低组穿过小孔细胞数较空白对照组及感染对照组明显降低,差异均有统计学意义(F=20.64,P=0.002)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,CTGF敲低组CTGF、FN、α-SMA、ColⅠ mRNA(F=128.83、124.44、144.76、1 374.44,P=0.000、0.000、0.000、0.000)和蛋白表达(F=22.55、41.60、25.73、161.68,P=0.002、0.000、0.001、0.000)较空白对照组、感染对照组明显降低,差异均有统计学意义。 结论成功构建的CTGF shRNA慢病毒颗粒可有效抑制视网膜血管内皮细胞迁移并下调内源性CTGF的表达。 展开更多
关键词 结缔组织生长因子 慢病毒感染 视网膜血管/细胞学 内皮细胞
慢病毒介导的microRNA-155过表达对肝癌细胞HepG2增殖的影响 预览
5
作者 牛连杰 张雅敏 武兆国 《天津医药》 CAS 北大核心 2018年第11期1151-1154,共4页
目的通过构建慢病毒(LV)介导的miRNA-155(miR-155)过表达载体,探讨上调miR-155对肝癌细胞系HepG2增殖的影响.方法针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP,将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载... 目的通过构建慢病毒(LV)介导的miRNA-155(miR-155)过表达载体,探讨上调miR-155对肝癌细胞系HepG2增殖的影响.方法针对目标序列合成特异性miR-155过表达片段并克隆入慢病毒载体pGCSHL-GFP,将重组miR-155-hRNA-LV和阴性对照空病毒载体转染HepG2细胞,建立稳定过表达miR-155的细胞系.细胞设过表达组(H组)、阴性对照组(negativecontrol,NC组)和正常组(normal,N组).实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测各组miR-155和PTEN的表达水平;Western blot检测各组PTEN、CyclinD1、CyclinA1+A2蛋白表达情况;细胞增殖-毒性检测(CCK-8)细胞增殖情况.结果H组miR-155表达量明显高于其NC组及N组,靶基因PTEN的表达量低于NC组及N组(均P〈0.05).H组PTEN蛋白的表达量明显低于NC组和N组,而CyclinD1、CyclingA1+A2蛋白的表达量明显高于NC组和N组(均P〈0.05).CCK-8结果显示3组12h时吸光度值开始出现差异,24h、48h、72hH组吸光度值均明显大于NC组和N组(P〈0.05),但后2组差异无统计学意义.结论过表达miR-155可促进肝癌细胞系HepG2细胞增殖. 展开更多
关键词 肝肿瘤 肝细胞 微RNAS 慢病毒感染 microRNA-155
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过表达基质细胞衍生因子1基因促进骨髓间充质干细胞增殖和迁移 预览 被引量:2
6
作者 陈少强 吴碧莲 +1 位作者 王姗姗 黄海辉 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第1期32-39,共8页
背景:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor,SDF-1)/CXCR4轴不仅能够促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移,而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用。目的:建立慢病毒介导的稳定... 背景:基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor,SDF-1)/CXCR4轴不仅能够促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移,而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用。目的:建立慢病毒介导的稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系,在体外观察其对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响。方法:构建过表达SDF-1α重组慢病毒载体(pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP),并以空载体质粒pNL-IRES2-EGFP、基因沉默质粒GV-118-SDF-1α-siRNA作为实验对照,分别转染293T细胞和骨髓间充质干细胞,建立稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系:SDF-1α-BMSCs组、null-BMSCs组和siRNA-BMSCs组;采用RT-PCR、Western Blot方法检测SDF-1αmRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力;Transwell迁移实验检测SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响。结果与结论:①成功构建pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP质粒,经测序结果表明pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP重组质粒构建成功;②慢病毒转染48h后可见293T细胞和各组骨髓间充质干细胞强烈表达EGFP;③SDF-1α-BMSCs组高效表达SDF-1α,siRNA-BMSCs组SDF-1α表达明显被抑制;④SDF-1α-BMSCs组的细胞增殖能力增强,SDF-1α可明显促进骨髓间充质干细胞的跨膜迁移。在抗SDF-1α多抗作用后各组细胞迁移指数明显下降;⑤结果可见,慢病毒载体可介导外源性基因SDF-1α在大鼠骨髓间充质干细胞中高效表达,并促进骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。 展开更多
关键词 趋化因子CXCL12 骨髓 间质干细胞 慢病毒感染 细胞增殖 细胞运动 组织工程
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慢病毒介导人白细胞介素12转染鼠骨髓间充质干细胞可抑制CT26瘤体的生长 预览
7
作者 何杨 林晨 +2 位作者 高琴 宋京翔 涂小煌 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第25期3944-3949,共6页
背景:白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点,但其在结直肠癌方面的研究相对较少。目的:构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(hIL-12-BMSCs),观察其对大鼠结肠癌模型的影响。方法:设计并合成引物,PCR扩... 背景:白细胞介素12作为最具潜力的抑瘤因子一直是研究的热点,但其在结直肠癌方面的研究相对较少。目的:构建稳定表达人白细胞介素12的大鼠骨髓间充质干细胞株(hIL-12-BMSCs),观察其对大鼠结肠癌模型的影响。方法:设计并合成引物,PCR扩增并回收纯化后的p40和p35基因片段,行Overlap-ping PCR连接获得hIL-12的单链双亚基表达融合基因,与慢病毒包装系统共转染293T细胞,构建慢病毒过表达重组体,再转染大鼠骨髓间充质干细胞,药物筛选培育出稳转株。32只裸鼠皮下注射CT26细胞悬液造模成功后,随机分为4组:瘤周分别注射0.2 mL hIL-12-BMSCs(hIL-12-BMSCs组)、0.2 mL PBS溶液(PBS组)、0.2 mL骨髓间充质干细胞(骨髓间充质干细胞组)、0.2 mL表达IL-12的慢病毒液(LV-IL-12组),统计并分析各组瘤体生长情况。结果与结论:①观察期内PBS组与骨髓间充质干细胞组肿瘤体积差异无显著性意义(P>0.05),表明骨髓间充质干细胞本身对CT26瘤体生长无明显促进或抑制作用;②注射7 d后hIL-12-BMSCs组与PBS组、PBS组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异均有显著性意义(P<0.01),表明白细胞介素12对CT26瘤体生长有明显抑制作用;③注射10 d后hIL-12-BMSCs组与LV-IL-12组间肿瘤体积差异有显著性意义(P<0.05),表明hIL-12-BMSCs抑制CT26生长优于LV-IL-12;④结果表明,hIL-12-BMSCs对裸鼠CT26移植瘤体生长有明显的抑制作用。 展开更多
关键词 结直肠癌 人白细胞介素12 鼠骨髓间充质干细胞 慢病毒载体 干细胞 福建省自然科学基金 结直肠肿瘤 白细胞介素12 骨髓 间质干细胞 慢病毒感染 组织工程
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Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤 预览 被引量:1
8
作者 段志斌 仇志强 +4 位作者 彭鲲 徐泽敏 成科 陈翔 矢庆明 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第29期4607-4613,共7页
背景:研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞,Runx2能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟,从而促进骨愈合。目的:探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作... 背景:研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞,Runx2能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟,从而促进骨愈合。目的:探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作用。方法:①分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,用Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞,同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组),并设置未用慢病毒转染的空白对照组;转染48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,并用嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株;②将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断建立骨性关节炎模型,并随机分为生理盐水组、单纯骨髓间充质干细胞组、Runx2转染骨髓间充质干细胞组;分别于小鼠膝关节腔内注射0.1 mL生理盐水、0.1 mL含1×107个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水、0.1 mL含1×107个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水。结果与结论:①骨髓间充质干细胞表面标志抗原CD90、CD105高表达,慢病毒转染效率(88.57±3.07)%,经4 mg/L嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞;②Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整,无明显退化,关节面平整;其他2组软骨退变,关节面不平;③Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞多,软骨层厚;其他2组软骨细胞减少,软骨层变薄,且Runx2转染骨髓间充质干细胞组Mankin’s评分低于其他2组;④Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率大于其他2组,Ⅹ型胶原蛋白阳性率小于其他2组;⑤Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白蛋白及mRNA表达高于其他2组;⑥结果说明,Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞能够促进骨性关节炎关节损伤修复,从而为骨性关节炎的临床治疗提供新的方向。 展开更多
关键词 RUNX2 慢病毒 骨髓间充质干细胞 骨形成蛋白2 碱性磷酸酶 骨钙素 骨桥蛋白 骨性关节炎 干细胞 骨关节炎 慢病毒感染 组织工程
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病毒介导骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子165双基因转染促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 预览
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作者 周桢杰 李强 +2 位作者 李诗鹏 陶旋 马跃刚 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第25期3950-3955,共6页
背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具... 背景:骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)均为骨修复过程中必不可少的细胞因子,利用慢病毒转染干细胞研究双因子作用下细胞的生物学改变具有重要意义。目的:探讨慢病毒介导人BMP-2和人VEGF-165双基因转染(2次转染)骨髓间充质干细胞的可行性以及转染后细胞的诱导成骨性能。方法:将骨髓间充质干细胞分为4组:①未转染组;②空载组:通过2次相同感染复数的空载慢病毒转染细胞;③BMP-2组:转染了单个目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP);④BMP-2/VEGF-165组:通过2次转染后携带双目的基因的细胞(Lv-BMP-2/GFP,Lv-VEGH-165/RFP)。转染后不同时间点Western Blot检测目的蛋白表达,MTT法检测各组细胞增殖活性,转染后14 d检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果与结论:①空载组、BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组在荧光显微镜下均可见相应的绿色及红色荧光蛋白表达;②转染后3 d,BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组均有相应目的蛋白高表达;转染后7,14,21 d,目的蛋白检测无明显变化(P>0.05);③BMP-2/VEGF-165组增殖稍快于BMP-2组(P<0.05),BMP-2组明显快于未转染组、空载组(P<0.05);④BMP-2组、BMP-2/VEGF-165组碱性磷酸酶活力明显高于未转染组、空载组;⑤结果表明,慢病毒介导的hBMP-2和hVEGF-165双基因经2次转染成功转入兔骨髓间充质干细胞内,并长期稳定表达,该双因子的表达能通过刺激细胞碱性磷酸酶生成促使细胞更好的向成骨细胞分化。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 骨形态发生蛋白2 血管内皮生长因子165 慢病毒 基因转染 细胞增殖 碱性磷酸酶 干细胞 国家自然科学基金 骨髓 间质干细胞 骨形态发生蛋白质类 血管内皮生长因子类 慢病毒感染 细胞增殖 组织工程
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慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预 预览
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作者 周小雄 魏伟超 +5 位作者 孙策 叶桃春 王嵩 卿立金 吴辉 冼绍祥 《中国组织工程研究》 北大核心 2018年第9期1425-1431,共7页
背景:CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用,而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。目的:比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效,并探讨黄芪总苷... 背景:CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用,而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。目的:比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效,并探讨黄芪总苷在内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压中的干预作用。方法:将90只SD大鼠以随机数字表法分为5组,分别为正常对照组(n=24)、模型组(n=24)、慢病毒转染组(n=18)、常规移植组(n=18)及黄芪总苷组(n=6)。除正常对照组外,其余4组均以野百合碱诱发肺动脉高压模型,慢病毒转染组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,每个时间点6只;常规移植组大鼠分别于野百合碱注射后第7,14,21天尾静脉注射内皮祖细胞,每个时间点6只;黄芪总苷组在野百合碱注射后第21天时间点注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞,同时在第1-21天每日一次给予80 mg/(kg?d)黄芪总苷腹腔注射。野百合碱注射后第28天,进行血流动力学、血浆内皮素1水平与右心室肥大指数检测。结果与结论:①与正常对照组比较,模型组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均升高(P<0.05)。与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均明显下降(P<0.05)。随着移植内皮祖细胞时间的延长,2个细胞移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均有逐渐升高趋势,但慢病毒转染组变化差异不明显;②与正常对照组比较,模型组大鼠血浆内皮素1水平升高(P<0.05);与模型组比较,慢病毒转染组、常规移植组血浆内皮素1水平降低(P<0.05);慢病毒转染组相同移植时间点的血浆内皮素1水平低于常规移植组(P<0.05);③黄芪总苷组的血流动力学、血浆内皮素1水平及右心室肥大指数均� 展开更多
关键词 高血压 肺性 内皮细胞 慢病毒感染 CD40配体 黄芪 组织工程
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miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达 预览
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作者 杨威利 王珊 +1 位作者 王宝利 李晓霞 《天津医药》 CAS 2017年第7期695-698,共4页
目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLV... 目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础。方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Westernblotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平。结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80%。Westernblotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用。 展开更多
关键词 微RNAS RNA干扰 miR-196b 慢病毒感染 骨髓基质细胞 海绵吸附慢病毒载体
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沉默TMEM45A基因表达可促进肾癌CAKI-1细胞的体外增殖和迁移 被引量:1
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作者 杨琼 王明磊 +1 位作者 徐辉明 高维强 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期218-224,236共8页
目的:探讨跨膜蛋白45A(transmembrane protein 45A,TMEM45A)基因表达对肾癌细胞CAKI-1体外增殖和迁移能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:构建特异性针对TMEM45A基因的TMEM45A-shRNA慢病毒载体,并制备为慢病毒后感染CAKI-1细... 目的:探讨跨膜蛋白45A(transmembrane protein 45A,TMEM45A)基因表达对肾癌细胞CAKI-1体外增殖和迁移能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:构建特异性针对TMEM45A基因的TMEM45A-shRNA慢病毒载体,并制备为慢病毒后感染CAKI-1细胞,沉默CAKI-1细胞中TMEM45A基因的表达。分别采用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测TMEM45A mRNA及蛋白在CAKI-1细胞中表达水平的改变。通过CCK-8法和平板克隆法检测TMEM45A基因沉默对CAKI-1细胞增殖和克隆形成能力的影响。通过Transwell小室迁移实验检测TMEM45A基因沉默对CAKI-1细胞迁移能力的影响。采用蛋白质印迹法检测TMEM45A基因沉默对CAKI-1细胞中蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称为Akt)及磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白表达的影响。结果:成功构建了LV-TMEM45A-shRNA慢病毒载体,并感染CAKI-1细胞株。携带有TMEM45A-shRNA的慢病毒载体转入CAKI-1细胞后,TMEM45A mRNA及蛋白的表达水平均被明显下调(P值均〈0.01);CAKI-1细胞的增殖能力明显增强(P值均〈0.01);CAKI-1细胞的迁移能力明显增强(P〈0.01)。沉默TMEM45A基因表达后,CAKI-1细胞中Akt蛋白的表达水平无明显变化(P〉0.05),而p-Akt蛋白的表达水平明显升高(P〈0.01)。结论:沉默TMEM45A基因的表达可增强人肾癌细胞CAKI-1的增殖和迁移能力,其机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/Akt信号转导通路的活化有关。 展开更多
关键词 肾肿瘤 慢病毒感染 RNA 小分子干扰 细胞增殖 细胞运动 TMEM45A基因
神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值 预览 被引量:2
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作者 陈京 余伟华 李付贵 《中国组织工程研究》 北大核心 2017年第21期3370-3375,共6页
背景:神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点,在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景,但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点。利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程,并获得纯化的单一类型终... 背景:神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点,在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景,但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点。利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程,并获得纯化的单一类型终末神经细胞为这一难点的解决提供了可行的方案。目的:探讨携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子驱动的荧光报告系统在神经干细胞神经分化示踪中的价值。方法:原代分离小鼠胚胎的脑部皮质,经机械消化和吹打后悬浮培养,免疫荧光染色检测其特异标志物Nestin的表达以确定神经干细胞。再将携带pL V/Final-neo-GFAP(promoter)-dT omato载体的慢病毒感染小鼠神经干细胞,遗传霉素G418筛选14 d后获得纯化神经干细胞,然后诱导其向星形胶质细胞分化,显微镜观察细胞红色荧光(dT omato)的变化。诱导第13天采用细胞免疫荧光技术对表达红色荧光的细胞行GFAP抗体复染。结果与结论:(1)原代分离获得的小鼠神经干细胞呈Nestin表达阳性;(2)慢病毒感染并筛选14 d后得到具有G418抗性的纯化神经干细胞;(3)该细胞经神经诱导分化后,显微镜下观察到红色荧光大量表达,且GFAP复染与红色荧光具有非常高的一致性;(4)实验成功地获得了体外表达neo-GFAP(promoter)-dT omato载体的小鼠神经干细胞,该细胞可以体外示踪GFAP基因的特异表达,为神经干细胞的定向神经分化机制、细胞移植及组织工程产品开发等研究提供了有力的工具。 展开更多
关键词 神经干细胞 慢病毒感染 神经胶质原纤维酸性蛋白质 组织工程 干细胞 分化 慢病毒 红色荧光蛋白 胶质纤维酸性蛋白 广东省自然科学基金
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慢病毒介导的解偶联蛋白-2基因差异表达对人脐静脉内皮细胞增生及凋亡的影响
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作者 沈胤忱 陈凤娥 +6 位作者 孙涛 顾青 刘堃 郑志 陈轶卉 王宁 许迅 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期52-56,共5页
目的 观察解偶联蛋白-2(UCP-2)基因差异表达对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生及凋亡的影响。 方法 构建UCP-2 rs660339位点碱基是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的慢病毒载体UCP-2C、UCP-2T。将HUVEC分为UCP-2C组、UCP-2T组、阴性对照(N... 目的 观察解偶联蛋白-2(UCP-2)基因差异表达对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生及凋亡的影响。 方法 构建UCP-2 rs660339位点碱基是胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)的慢病毒载体UCP-2C、UCP-2T。将HUVEC分为UCP-2C组、UCP-2T组、阴性对照(NC)组,分别转染UCP-2C、UCP-2T、无意义阴性病毒。荧光显微镜观察各组HUVEC病毒感染效率;实时定量聚合酶链反应检测各组HUVEC UCP-2 mRNA表达;细胞计数试剂盒、流式细胞仪检测各组HUVEC增生、凋亡情况;蛋白免疫印迹法、激光共聚焦显微镜检测各组HUVEC B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白的表达及荧光强度。 结果 各组HUVEC病毒感染效率均>80%。UCP-2C组、UCP-2T组HUVEC UCP-2 mRNA表达较NC组显著增高,差异有统计学意义(F=29.183,P=0.001)。目的病毒感染后48、72、96 h,UCP-2C组、UCP-2T组HUVEC增生显著高于NC组,差异有统计学意义(F=15.970、16.738、5.414,P=0.004、0.004、0.045)。感染后72 h,与NC组比较,UCP-2T组、UCP-2C组HUVEC凋亡率均降低,差异有统计学意义(F=277.138,P=0.000);UCP-2T组HUVEC凋亡率较UCP-2C组低(P=0.003)。UCP-2T组、UCP-2C组HUVEC Bcl-2蛋白表达显著高于NC组,差异有统计学意义(F=425.679,P=0.000);UCP-2T组HUVEC Bcl-2蛋白表达高于UCP-2C组(P=0.002)。UCP-2T组、UCP-2C组HUVEC Bcl-2蛋白荧光强度显著高于NC组,差异有统计学意义(F=11.827,P=0.008);UCP-2T组、UCP-2C组之间HUVEC Bcl-2蛋白荧光强度差异无统计学意义(P=0.404)。 结论 UCP-2 rs660339位点差异表达可能影响HUVEC增生及凋亡;UCP-2T较UCP-2C抑制凋亡作用更显著。 展开更多
关键词 内皮细胞/病理生理学 细胞增殖 细胞凋亡 基因表达 慢病毒感染
慢病毒介导的靶向干扰PARP-1基因乳腺癌稳定细胞株的构建 被引量:1
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作者 莫柒艳 陈龙 +6 位作者 李龄 曲颂 黎建绪 林欢 武江波 朱小东 赵伟 《中国癌症防治杂志》 CAS 2017年第2期129-133,共5页
目的 构建慢病毒介导的人PARP-1基因短发夹RNA (shRNA)载体,并建立PARP-1基因稳定干扰的MDA-MB-231乳腺癌细胞株.方法 根据GenBank提供的PARP-1 cDNA序列,构建靶向PARP-1基因慢病毒载体,将慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共同转染293... 目的 构建慢病毒介导的人PARP-1基因短发夹RNA (shRNA)载体,并建立PARP-1基因稳定干扰的MDA-MB-231乳腺癌细胞株.方法 根据GenBank提供的PARP-1 cDNA序列,构建靶向PARP-1基因慢病毒载体,将慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共同转染293T细胞,产生重组慢病毒并进行滴度测定.将重组慢病毒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株 (PARP-1组),同时设立阴性对照组和空白对照组.采用实时荧光定量PCR及Western blot检测细胞PARP-1基因mRNA及蛋白的表达.结果 成功构建了人PARP-1-RNAi重组慢病毒并转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞株.空白对照组.阴性对照组和PARP-1组的PARP-1 mRNA相对表达量分别为1.001±0.056.1.022±0.021和0.166±0.041;PARP-1蛋白的相对表达量分别为0.963±0.006.0.943±0.008和0.573±0.011;与空白对照组和阴性对照组相比,PARP-1组PARP-1 mRNA和蛋白的表达均显著降低 (P〈0.05).结论 成功构建了PARP-1基因稳定干扰的乳腺癌MDA-MB-231细胞株. 展开更多
关键词 乳腺肿瘤 PARP-1 RNA干扰 慢病毒感染
靶向大鼠沉默信息调节因子1基因小干扰RNA慢病毒载体对大鼠视网膜神经节细胞中沉默信息调节因子1表达的影响
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作者 摆茹 周月 +2 位作者 芦晓红 蔡金金 姚青 《中华眼底病杂志》 CSCD 北大核心 2017年第5期503-507,共5页
目的观察靶向大鼠沉默信息调节因子1(Sirt1)基因的小干扰(si)RNA慢病毒载体对大鼠视网膜神经节细胞(RGC)中Sirt1表达的影响。方法设计4条靶向大鼠Sirt1基因的siRNA靶点序列,构建靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体。采用菌落聚... 目的观察靶向大鼠沉默信息调节因子1(Sirt1)基因的小干扰(si)RNA慢病毒载体对大鼠视网膜神经节细胞(RGC)中Sirt1表达的影响。方法设计4条靶向大鼠Sirt1基因的siRNA靶点序列,构建靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体。采用菌落聚合酶链反应(PCR)和DNA测序鉴定阳性克隆。应用阳性重组质粒与包装质粒共转染293T细胞,进行慢病毒包装及病毒滴度测定。将RGC分为空白对照组、转染阴性对照病毒载体组(NC组)以及分别转染4个带有干扰序列的si-Sirt1-1组、si.Sirt1.2组、si—Sirt1-3组、si-Sirt1.4组。采用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Westernblot)分别检测各组RGC中Sirt1mRNA、蛋白相对表达量。结果菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体构建成功。在293T细胞中成功包装后,其病毒滴度为8×10^8TU/ml。荧光定量PCR和Westernblot检测结果显示,与NC组比较,si-Sirt1-1组、si-Sirt1-2组、si-Sirt1-3组、si.Sirt1.4组RGC中Sirt1mRNA、蛋白相对表达量均明显下降,差异有统计学意义(F=27.682、1185.206,P=-0.000、0.000);其中,以si—Sirt1.2组Sirt1mRNA、蛋白相对表达量下降幅度最为明显。结论靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体可降低大鼠RGC中sirtlmRNA、蛋白表达。 展开更多
关键词 沉默信息调节蛋白质类 酿酒酵母 慢病毒感染 视网膜神经节细胞 细胞 培养的
慢病毒载体介导色素上皮衍生因子基因转染人脐带间充质干细胞研究
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作者 段红涛 陈松 +5 位作者 董蒙 王月欣 孔佳慧 宋建 李泽东 王继明 《中华眼底病杂志》 CSCD 北大核心 2017年第6期621-625,共5页
目的构建携带色素上皮衍生因子(PEDF)基因的慢病毒(LV)载体并转染人脐带间充质干细胞(hUCMSCs),初步探讨基因修饰PEDF-间充质干细胞的可行性。方法采用基因重组方法构建LV-PEDF载体,测定其LV滴度,以感染复数(MOI)值为10、30... 目的构建携带色素上皮衍生因子(PEDF)基因的慢病毒(LV)载体并转染人脐带间充质干细胞(hUCMSCs),初步探讨基因修饰PEDF-间充质干细胞的可行性。方法采用基因重组方法构建LV-PEDF载体,测定其LV滴度,以感染复数(MOI)值为10、30、50 的LV体外转染hUCMSCs,并据此分为相应MOI值实验组;以不含PEDF基因的相同MOI值的重组LV载体[LV-绿色荧光蛋白(GFP)]转染hUCMSCs,并据此分为 相应MOI值对照组。荧光显微镜观察两组细胞转染效率并计算转染率。采用细胞免疫荧光法、免疫细胞化学法、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDF、血管内皮生长因子(VEGF) 表达水平。结果经酶切以及基因测序鉴定证明LV载体构建成功。转染96 h后,50MOI实验组细胞可见大量GFP表达,转染效率为72.1%。荧光显微镜观察发现,转染后96 h,50MOI实验组细胞胞浆PEDF、VEGF表达增强。光学显微镜观察发现,转染后96 h,50MOI实验组细胞胞浆PEDF表达较低,而VEGF表达较强。RT-PCR检测结果发现,50MOI实验组、50MOI对照组细胞中PEDF mRNA相对表达量分别为0.170±0.028、0.015±0.007;VEGF mRNA相对表达量分别为0.265±0.022、0.285±0.049。两组细胞中PEDF mRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=70.29,P<0.001);VEGF mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(F=9.57,P>0.05)。结论成功构建携带PEDF基因LV表达载体,并在hUCMSCs中过表达PEDF基因。 展开更多
关键词 血管内皮生长因子类 间充质干细胞 慢病毒感染 细胞 培养的
构建线粒体钙离子摄入蛋白1慢病毒表达载体及在H9C2细胞中的应用 预览 被引量:1
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作者 荆哲 刘峰舟 +1 位作者 刘燕 陈永清 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2016年第37期5560-5566,共7页
背景:线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子,MICU1对线粒体钙稳态的调节可能在糖尿病心肌病的发生及发展中起着重要作用,但目前机制尚不明确。目的:构建MICU1基因的慢病... 背景:线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子,MICU1对线粒体钙稳态的调节可能在糖尿病心肌病的发生及发展中起着重要作用,但目前机制尚不明确。目的:构建MICU1基因的慢病毒表达载体,产毒感染H9C2细胞,评价MICU1基因在H9C2细胞中的表达效果,为后续在细胞水平研究糖尿病心肌病的发生及发展建立平台。方法:PCR提取H9C2细胞MICU1基因,SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后,将MICU1基因片段插入慢病毒载体pR RLsin.CMV.e FP中,构建慢病毒表达质粒pR RLsin.CMV.MICU1-e FP。使用pC MVDR8.91、pC MV-VSVG共转染于293T细胞中包装产毒,用于感染H9C2细胞。通过RT-PCR及Western blot检测感染后H9C2细胞中MICU1 m RNA及蛋白的表达。共聚焦显微镜检测Rhod-2染色H9C2细胞后线粒体钙水平。结果与结论:(1)MICU1基因成功插入pR RLsin.CMV.e FP慢病毒表达质粒;(2)转染pR RLsin.CMV.MICU1-e FP慢病毒表达质粒后,可见293T细胞表达绿色荧光蛋白,并且MICU1的蛋白表达明显升高;(3)病毒液感染H9C2细胞后,MICU1的蛋白及m RNA水平较未感染组及空质粒包装组明显升高;(4)Rhod-2染色后观察发现,MICU1能够明显增强线粒体钙水平;(5)结果表明,pR RLsin.CMV.MICU1-e FP慢病毒能够高效感染H9C2细胞,为构建永生化细胞系奠定基础。 展开更多
关键词 慢病毒感染 线粒体蛋白质类 肌细胞 心脏 组织构建 组织工程 H9C2细胞 线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1) 慢病毒载体 病毒包装
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甲状腺髓样癌家系RET基因点突变质粒及稳定细胞系构建 被引量:1
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作者 陆凡倩 陈晓红 +4 位作者 寇秀娟 白云龙 冯亚茹 杨静 王伯淳 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2016年第5期250-252,共3页
目的构建中国大陆甲状腺髓样癌RET基因常见突变位点的质粒并验证其表达。方法分析中国大陆甲状腺髓样癌家系RET基因,进行RET基因外显子高通量"二代"测序分析。体外构建RET基因相应位点突变并研究在NIH3T3细胞中的表达水平。结果通过... 目的构建中国大陆甲状腺髓样癌RET基因常见突变位点的质粒并验证其表达。方法分析中国大陆甲状腺髓样癌家系RET基因,进行RET基因外显子高通量"二代"测序分析。体外构建RET基因相应位点突变并研究在NIH3T3细胞中的表达水平。结果通过对野生型RET质粒进行点突变PCR、克隆测序后,成功获得相应位点点突变慢病毒质粒。经过慢病毒感染NIH3T3细胞,Western Blot验证目的基因为稳定表达。结论成功构建了载有RET基因突变的稳定细胞系,为研究RET不同位点突变提供了良好平台。 展开更多
关键词 甲状腺肿瘤 基因 突变 质粒 慢病毒感染 细胞系 信号通路
沉默RNF181基因表达可促进结肠癌SW480细胞的生长 被引量:5
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作者 牛文博 王穗海 +6 位作者 李鹏 王明清 高彦君 董宁宁 何沛嵘 石相宜 李纪良 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期621-627,共7页
目的 :研究沉默环指蛋白181(ring finger protein 181,RNF181)基因表达对结肠癌细胞SW480生长的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :采用慢病毒感染的方法将靶向沉默RNF181基因表达的重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入人结肠癌SW48... 目的 :研究沉默环指蛋白181(ring finger protein 181,RNF181)基因表达对结肠癌细胞SW480生长的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :采用慢病毒感染的方法将靶向沉默RNF181基因表达的重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入人结肠癌SW480细胞中[以感染重组慢病毒颗粒LV3-negative control(NC)为阴性对照)]。病毒感染48 h后,分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SW480细胞中RNF181m RNA及蛋白的表达水平;CCK-8法和平板克隆法检测RNF 181基因沉默对SW480细胞增殖的影响;蛋白质印迹法检测对细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)及其磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)表达的影响。结果 :实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,重组慢病毒颗粒LV3-RNF181-KD转入SW480细胞后,细胞中RNF181 m RNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组(感染重组慢病毒颗粒LV3-NC的SW480细胞)明显下调,差异均有统计学意义(P值均〈0.01)。CCK-8及平板克隆实验证实,沉默RNF181基因表达后SW480细胞的增殖能力明显增强(P值均〈0.01)。细胞中ERK蛋白的表达水平无明显变化(P〉0.05),而p-ERK蛋白的表达水平明显升高(P〈0.01)。结论 :沉默RNF181基因的表达可增强人结肠癌细胞SW480的增殖能力,其机制可能与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)/ERK信号转导通路的活化有关。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 慢病毒感染 RNF181基因 细胞增殖
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