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基于PIPE现象的质粒克隆位点序列设计与功能评价
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作者 陈凡 喻艳莉 李奕雅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1166-1174,共9页
分子克隆是现代生物学研究的核心技术之一,是基因工程、蛋白质工程中的重要手段。为提高分子克隆实验的操作效率,本研究设计并合成基于聚合酶引物不完全延伸(polymerase incomplete primer extension,PIPE)现象的质粒克隆位点序列。并... 分子克隆是现代生物学研究的核心技术之一,是基因工程、蛋白质工程中的重要手段。为提高分子克隆实验的操作效率,本研究设计并合成基于聚合酶引物不完全延伸(polymerase incomplete primer extension,PIPE)现象的质粒克隆位点序列。并以此为基础统一相关引物的设计方案,避免传统酶切——连接法中需针对不同载体MCS序列设计不同引物的缺点。该方案利用13 bp定长接头序列,在同一体系中使用2对引物、2种线性化模板同时扩增载体和插入片段,通过20个循环,在1次PCR过程中即合成可供转化使用的带缺口质粒产物。在NEB Q5酶系统中,利用此法将3种荧光素酶序列插入pET-15b及pET-21b(+)载体,均获得成功。且利用商品化感受态细胞(转化效率> 5×10~8cfu/μg)转化后所获得转化子数量均在300个以上,其中含插入片段的阳性克隆比例可达85%以上。基于本方案的设计及作用原理,可将其应用于10 kb以内载体和插入片段的快速重组。且具有通用性强、耗时少、阳性克隆得率高和成本低等优点,是传统DNA重组方法的有益补充,可作为各实验室的常规分子克隆手段之一。 展开更多
关键词 聚合酶引物不完全延伸 聚合酶链式反应 分子克隆 克隆位点序列
美国农业部黄瓜分子育种研究简介 预览
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作者 翁益群 《天津农业科学》 CAS 2019年第6期6-18,共13页
美国农业部黄瓜研究实验室隶属于美国农业部农业研究署(USDA-ARS)蔬菜作物研究室(VCRU),挂靠于威斯康星大学园艺系。该实验室黄瓜育种项目始于1968年。过去50年中,该实验室在黄瓜遗传育种方面取得了丰硕的成果,并对美国及世界黄瓜育种... 美国农业部黄瓜研究实验室隶属于美国农业部农业研究署(USDA-ARS)蔬菜作物研究室(VCRU),挂靠于威斯康星大学园艺系。该实验室黄瓜育种项目始于1968年。过去50年中,该实验室在黄瓜遗传育种方面取得了丰硕的成果,并对美国及世界黄瓜育种起到了重要的推动作用。本文简要介绍了实验室的历史及研究成果,着重概括了2008—2018年本实验室在以下方面所做的研究及取得的成绩:(1)黄瓜应用基因组学工具的开发;(2)黄瓜重要经济性状分子标记的开发,基因及主效QTL的克隆与功能研究;(3)黄瓜染色体的起源与进化分析,以及栽培黄瓜的驯化与种质资源的遗传多样性研究。同时,对所取得的各项成果在黄瓜育种中的潜力进行了评价。最后对今后实验室的工作进行了展望。 展开更多
关键词 黄瓜 分子育种 QTL 基因克隆 染色体进化 驯化
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黑曲霉内切β-1,4-半乳聚糖酶AghA的分子克隆与特征解析 预览
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作者 蔡可 王太康 +5 位作者 王君 董自星 田康明 金鹏 刘晓光 王正祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期29-35,共7页
利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC3.2.1.89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌G... 利用内切β-1,4-半乳聚糖酶(endo-β-1,4-galactanase,EC3.2.1.89)水解土豆浆制备低聚半乳糖,有望解决产品回收率低的问题。为此,该研究通过分子克隆技术,将黑曲霉β-1,4-半乳聚糖酶基因aghA在毕赤酵母中进行克隆表达,构建获得了重组菌GS115(pPIC-aghA)。摇瓶培养条件下,重组酶AghA的酶活为130U/mL,高于大多数已报道的半乳聚糖酶的酶活。酶学性质的研究表明,该酶的最适反应pH值和温度分别为4.5和45℃,且在pH4.0~6.0或30~50℃具有较好稳定性。大部分金属离子和EDTA对重组酶AghA的酶活没有显著影响;Fe^3+对其活性有强烈的抑制作用;而Hg^2+则可使AghA几乎完全失活。该酶对半乳聚糖的最大反应速率Vmax和米氏常数Km分别为400mg/(mL·min)和0.08mg/mL。此外,重组酶AghA还可以水解土豆浆,产生半乳二糖、半乳三糖和少量半乳四糖等低聚半乳糖。 展开更多
关键词 内切β-1 4-半乳聚糖酶 低聚半乳糖 黑曲霉 分子克隆 酶学性质
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草鱼脂酰辅酶A合成酶4基因全长cDNA分子克隆及表达调控 预览
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作者 韩振 高琦 +4 位作者 许建和 易乐飞 申欣 丁祝进 程汉良 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期2442-2450,共9页
本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同... 本试验采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆草鱼脂酰辅酶A合成酶4(ACSL4)基因全长cDNA,利用实时荧光定量PCR技术研究ACSL4基因在草鱼大脑、心脏、脾脏、肝胰脏、肌肉、肾脏、肠系膜脂肪、前肠、中肠、后肠10种组织中的表达情况,并对投喂不同淀粉源饲料以及饥饿再投喂0、3、6、12和24h后草鱼肝胰脏中ACSL4基因表达情况进行研究。结果显示:草鱼ACSL4基因cDNA全长2418bp,其开放阅读框2121bp,共编码706个氨基酸;草鱼ACSL4蛋白的氨基酸序列包含1个跨膜结构域、1个脂肪酸绑定基序和1个ATP/AMP绑定基序。草鱼ACSL4mRNA在大脑和脾脏中相对表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05),在肌肉中相对表达量最低;投喂不同淀粉源饲料对草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05);饥饿再投喂12h后,草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量达到最高值,显著高于其他时间段(P<0.05),24h后恢复至最初水平。本试验从草鱼10种混合组织中克隆了ACSL4基因全长cDNA,其所编码的氨基酸序列的主要功能性位点脂肪酸绑定基序和ATP/AMP绑定基序在不同物种间高度保守;草鱼ACSL4基因主要在大脑和脾脏中表达;饲料中淀粉源对草鱼肝胰脏中ACSL4基因的表达无显著影响;在饥饿再投喂12h后,草鱼肝胰脏中ACSL4mRNA相对表达量达到最高值,随后显著下降至最初水平。 展开更多
关键词 草鱼 长链脂酰辅酶A合成酶4 分子克隆 表达调控
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草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆及表达分析 预览
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作者 陈阳 孙华山 +4 位作者 王玉书 张学通 师冉 熊良兵 金一锋 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期459-465,共7页
氮素是制约草坪草生长发育的重要因素之一,GS/GOGAT循环是植物氮同化的主要途径,谷氨酸合酶(glutamine:2-oxoglutarate amidotransferase,glutamate synthase,GOGAT)在植物氮素转化过程中发挥着重要的催化作用。本研究以草地早熟禾(Poa ... 氮素是制约草坪草生长发育的重要因素之一,GS/GOGAT循环是植物氮同化的主要途径,谷氨酸合酶(glutamine:2-oxoglutarate amidotransferase,glutamate synthase,GOGAT)在植物氮素转化过程中发挥着重要的催化作用。本研究以草地早熟禾(Poa pratensis)为试材,基于二代测序RNA-seq相关数据,克隆得到草地早熟禾NADH-GOGAT基因,并进行生物信息学分析。结果表明:草地早熟禾NADH-GOGAT基因序列为3236bp,完整的开放阅读框(OpenReadingFrameFinder,ORF)为1338bp,编码445个氨基酸残基组成的蛋白;预测NADH-GOGAT蛋白的分子量为49.89KD,等电点(isoelectric point,pI)为6.11,无信号肽,含有1个Glu-syn-central结构域,属于Glu-syn-central超级家族;二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主;同源进化分析结果表明草地早熟禾NADH-GOGAT与硬粒黑小麦氨基酸序列相似度为97%。草地早熟禾NADH-GOGAT基因在叶部的相对表达量高于根与茎,低氮浓度更有利于该基因的表达。NADH-GOGAT在干旱胁迫和水氮互作中表达差异显著(P<0.05)。草地早熟禾NADH-GOGAT基因的克隆,及相关序列分析和基因表达,对进一步研究该基因的功能和草地早熟禾GS/GOGAT循环的调控过程具有一定意义。 展开更多
关键词 草地早熟禾 谷氨酸合酶 基因克隆 氮素调控
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黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析 预览 被引量:2
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作者 王鑫 金鹏 +3 位作者 宋鹏 董自星 刘晓光 王正祥 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期40-46,共7页
酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH >3.0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIMF0510的酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了克隆表达... 酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH >3.0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIMF0510的酸性蛋白酶基因expA在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115(pPIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257380RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3.0;分别在40~50℃或pH2.5~3.5孵育1h后,仍能保留80%左右的活力。Zn^2+、Ca^2+、Fe^2+和Mn^2+对其活性有一定的促进作用;而Cu^2+、Co^2+、Fe^3+、EDTA和SDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 酸性蛋白酶 黑曲霉 分子克隆 酶学特征
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三疣梭子蟹含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及其表达分析 预览
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作者 李蒙 王金凤 +1 位作者 黄骞 李才文 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期149-158,共10页
为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为... 为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为102bp,3′-UTR长度为87bp,开放阅读框长度为507bp,编码168个氨基酸,其中含有一个典型的由蛋白石终止密码子(220TGA222)编码的硒半胱氨酸(40U)。预测了该基因编码的氨基酸序列及其中的保守结构域,包括GPx家族签名序列(64LAFPCNQF71)、活性位点序列(152WNFEKF157)以及与酶催化活性相关的氨基酸位点包括谷氨酰胺(74Q)、精氨酸(90R和168R)和色氨酸(142W)。相似性比对和系统发育分析结果表明,三疣梭子蟹硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)与甲壳动物中的SeGPxs相似性较高,其中与拟穴青蟹SeGPx相似性最高,并与其在系统发育树中聚为一支。经血卵涡鞭虫侵染后(0—192h),SeGPx基因在三疣梭子蟹的血细胞、肝胰腺和鳃组织中的转录水平均发生显著性升高。该结果表明,SeGPx在三疣梭子蟹应对血卵涡鞭虫的免疫反应中发挥重要作用,可通过调控甲壳宿主体内被病原扰乱的氧化还原状态进而起到宿主组织保护作用。 展开更多
关键词 甲壳动物 固有免疫 寄生虫 谷胱甘肽过氧化物酶基因 分子克隆 基因表达
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异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA克隆及其摄食功能 预览
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作者 商振达 刘锁珠 +3 位作者 谭占坤 商鹏 王宏辉 孔庆辉 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期834-843,共10页
旨在研究异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)缩胆囊素(cholecystokinin,CCK)基因的摄食功能。本研究克隆得到了异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其属于CCK-1亚型。异齿裂腹鱼CCK的cDNA全长为773 bp,其中开放阅读框... 旨在研究异齿裂腹鱼(Schizothorax o’connori)缩胆囊素(cholecystokinin,CCK)基因的摄食功能。本研究克隆得到了异齿裂腹鱼CCK基因的cDNA全长,通过生物信息学分析发现其属于CCK-1亚型。异齿裂腹鱼CCK的cDNA全长为773 bp,其中开放阅读框(ORF)为372 bp,可以编码123个氨基酸。异齿裂腹鱼CCK由1个信号肽和1个典型的CCK-8肽保守结构域组成,为亲水性蛋白,但没有跨膜结构。运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测异齿裂腹鱼CCK基因在组织中的分布情况,以及餐前餐后和禁食复喂对其表达量的影响。结果表明,异齿裂腹鱼CCK在各组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,在肠道、心脏、肝、脾、肾、皮肤、鳃、眼和鳔中表达量相对较高,在肌肉中表达量最低。餐后CCK基因的表达量显著升高,禁食使异齿裂腹鱼CCK基因的表达量显著下降,而复喂使CCK基因的表达量显著上升,表明CCK基因既是异齿裂腹鱼的餐后饱感信号因子,又是长期调控摄食因子。本研究为异齿裂腹鱼的人工饲养和品种保护等提供了理论依据。 展开更多
关键词 CCK基因 异齿裂腹鱼 分子克隆 组织分布 摄食功能调节
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微生物发酵产阿魏酸酯酶及释放阿魏酸研究概述 预览
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作者 孙晓明 辛嘉英 +3 位作者 王艳 吴永存 王宁 陈书明 《食品研究与开发》 CAS 北大核心 2019年第1期201-206,共6页
对微生物发酵法产阿魏酸酯酶以及释放阿魏酸的国内外研究进展进行综述,重点介绍阿魏酸酯酶的微生物来源、理化性质及阿魏酸酯酶分子克隆专利,同时对释放阿魏酸的生产工艺及影响因素进行简单总结,为探讨新产品的生产工艺提供参考信息。
关键词 阿魏酸酯酶 阿魏酸 培养条件 发酵优化 分子克隆
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忽地笑α-葡萄糖苷酶编码基因的分子克隆与原核表达
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作者 李宜奎 李洁 +2 位作者 程丽 钱彬彬 汪仁 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期3562-3569,共8页
利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花瓣中克隆获得一个α-葡萄糖苷酶编码基因Lau Agl。该基因cDNA全长2 810 bp,开放阅读框为2 613 bp,编码含有870个氨基酸残基的LauAgl蛋白质。LauAgl蛋白质氨基酸序列具有α-葡... 利用RACE技术从忽地笑(Lycoris aurea(L’Hér.)Herb.)花瓣中克隆获得一个α-葡萄糖苷酶编码基因Lau Agl。该基因cDNA全长2 810 bp,开放阅读框为2 613 bp,编码含有870个氨基酸残基的LauAgl蛋白质。LauAgl蛋白质氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶特征性的保守结构域和天冬氨酸残基组成的活性中心,其N端含有一个由21个氨基酸组成的信号肽序列,还具有一些蛋白质糖基化的潜在位点(N-X-S/T共有序列)。LauAgl蛋白质与石刁柏、椰子、油棕等其他植物的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列一致性达到63%以上。利用pET表达系统,通过截掉其N-端信号肽序列,可以实现LauAgl蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达。本研究为Lau Agl蛋白质的功能鉴定及其在忽地笑种子萌发与生长发育中的作用研究提供理论基础。 展开更多
关键词 忽地笑 Α-葡萄糖苷酶 分子克隆 原核表达
Molecular cloning and characterization of a lipid transfer protein gene (PsLTP1) from Pinus sylvestris (L.) 预览
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作者 Nataliya Hrunyk Valentina Kovaleva +5 位作者 Hryhoriy Krynytskyy Ivan Gout Francisco Amil-Ruiz Juan Munoz-Blanco Jose Luis Caballero Roman Gout 《林业研究:英文版》 CAS CSCD 2019年第3期1149-1158,共10页
Plant nonspecific lipid transfer proteins (nsLTPs) are widely distributed through plant kingdom and are characterized by the presence of a central hydrophobic cavity, suitable for binding various hydrophobic molecules... Plant nonspecific lipid transfer proteins (nsLTPs) are widely distributed through plant kingdom and are characterized by the presence of a central hydrophobic cavity, suitable for binding various hydrophobic molecules. Despite extensive research on nsLTP in different plant species, mostly angiosperm, and the great diversity of physiological processes in which they seem to be involved, their exact functions still remain unclear. Also, very limited experimental data are available on nsLTP in gymnosperm. In this study, we report for the first time on the molecular cloning of nsLTP, from Pinus sylvestris L.(PsLTP1, GenBank accession JN980402.1) and the expression pattern of PsLTP1 during ontogenesis and in response to environmental stress conditions. Total RNA from roots of 7-day old pine seedlings was used to isolate the cDNA clone, corresponding to Scots pine lipid transfer protein. The open reading frame of PsLTP1 consists of 372 bp encoding a protein of 123 amino acids. Amino acid sequence alignment revealed that mature PsLTP1 shares high level of similarity with nsLTP from other conifers and with well-studied nsLTPs from angiosperms. The PsLTP1 contains a 27-amino-acid N-terminal signal sequence and presents all the features of a plant nsLTP. Amino acid comparison analysis and 3D structure prediction showed that PsLTP1 is a type 1 nsLTP. The results of the expression analysis of Scots pine PsLTP1 gene revealed that its transcripts accumulate in actively growing tissues. Furthermore, transcription of PsLTP1 was upregulated in response to cold and salt treatments, and downregulated during acidic, osmotic and water stresses. 展开更多
关键词 SCOTS PINE NONSPECIFIC lipid transfer protein (nsLTP) Molecular cloning Expression ABIOTIC stresses
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芜菁BrrCIPAS8基因的克隆,序列分析与功能预测
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作者 陈迪 李雄 +1 位作者 和兆荣 杨永平 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期388-395,共8页
镉(Cd)诱导蛋白AS8基因(cadmium-induced protein AS8, CIPAS8)广泛存在于植物中,可能参与了植物对Cd等金属离子的响应过程,但目前关于它的功能报道很少。本研究从芜菁(Brassica rapa var. rapa,Turnip)中克隆得到了BrrCIPAS8基因的CDS... 镉(Cd)诱导蛋白AS8基因(cadmium-induced protein AS8, CIPAS8)广泛存在于植物中,可能参与了植物对Cd等金属离子的响应过程,但目前关于它的功能报道很少。本研究从芜菁(Brassica rapa var. rapa,Turnip)中克隆得到了BrrCIPAS8基因的CDS序列,其全长开放阅读框为528 bp,编码175个氨基酸。预测的蛋白分子量为18.7 kD,理论等电点为8.35,不稳定系数为20.49。蛋白序列分析显示BrrCIPAS8蛋白有2个保守的跨膜结构域,亚细胞定位检测发现其定位于细胞质膜。基因表达量分析表明BrrCIPAS8基因主要在芜菁叶中表达,并随着植物生长有上调表达趋势。此外,BrrCIPAS8基因对多种金属离子胁迫有响应,Zn、Cu和Mn能诱导芜菁叶中BrrCIPAS8基因的表达,Co和Cd会抑制叶中BrrCIPAS8基因的表达。说明该基因可能参与了芜菁吸收和转运金属离子。本研究将促进对植物CIPAS8基因的认识,为深入研究BrrCIPAS8基因的功能提供理论依据。 展开更多
关键词 芜菁 分子克隆 基因表达 金属离子
韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白基因的克隆及光强度对其表达量影响
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作者 安立娜 范凡 +3 位作者 杨小凡 李梦瑶 刘小侠 魏国树 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期971-979,共9页
为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用... 为明确韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga紫外敏感视蛋白基因Bo-uv的作用及其与趋光性的关系,利用常规PCR方法克隆获得Bo-uv基因的全长cDNA序列,分析了其敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,运用qPCR技术检测了不同发育阶段、不同组织及不同光强度下Bo-uv基因的相对表达量。结果表明,Bo-uv基因cDNA全长2 757 bp,开放阅读框1 542 bp,编码514个氨基酸。韭菜迟眼蕈蚊紫外敏感视蛋白的氨基酸序列与其它12种昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为21.93%~43.00%,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的氨基酸序列同源性最高。Bo-uv基因在韭菜迟眼蕈蚊蛹末期、成虫期表达,在成虫头部的相对表达量较高。在0~10 000 lx光强范围内雌、雄成虫体内该基因的相对表达量均呈先增高后降低趋势。与对照相比,1 000 lx光强度下其相对表达量显著升高,10 000 lx时相对表达量显著降低。表明光强度能够有效地调控Bo-uv基因的表达,该基因在韭菜迟眼蕈蚊感知外界光刺激过程中具有重要作用。 展开更多
关键词 韭菜迟眼蕈蚊 紫外敏感视蛋白基因(uv) 克隆 趋光性 光强
虹鳟Fc受体FcγR的α和γ亚基基因的克隆及表达分析 预览
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作者 王鹏 张弩 +1 位作者 张旭杰 张永安 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期27-36,共10页
Fc受体(FcR)是一种表达在免疫细胞表面的受体分子,由多亚基构成,通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc段结合引起包括炎症因子释放和吞噬作用等体液和细胞免疫反应。研究采用RACE技术首次克隆得到了虹鳟FcγR的α亚基基因(FcγRα)和γ亚基基因(FcR... Fc受体(FcR)是一种表达在免疫细胞表面的受体分子,由多亚基构成,通过与免疫球蛋白(Ig)的Fc段结合引起包括炎症因子释放和吞噬作用等体液和细胞免疫反应。研究采用RACE技术首次克隆得到了虹鳟FcγR的α亚基基因(FcγRα)和γ亚基基因(FcRγ)的cDNA序列,采用生物信息学软件对FcγRα和FcRγ的序列进行了特征分析,实时荧光定量PCR检测了其在不同组织和细胞亚群中以及在Poly(I:C)和LPS刺激后头肾中的表达。结果显示:FcγRα的cDNA全长1677bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸;FcγRα由信号肽和2个Ig样结构域构成,但没有跨膜区和胞内区。FcRγ亚基存在2种形式,分别命名为FcRγ1和FcRγ2(包含FcRγ2a和FcRγ2b两个剪接异构体),它们均由信号肽、跨膜区和胞内的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)构成。氨基酸序列相似性分析表明虹鳟FcγRα与斑点叉尾鮰FcRI相同率最高(30%),虹鳟FcRγ1和FcRγ2a/2b与哺乳动物FcRγ相同率最高可达40%。组织表达显示FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在头肾、脾脏和血液中表达较高;细胞亚群表达显示FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在髓样细胞群中表达最高;LPS和Poly(I:C)刺激后,FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b在头肾中的表达显著上调,这表明FcγR在机体抗细菌和抗病毒免疫中可能发挥重要作用。 展开更多
关键词 FC受体 FcγRα FcRγ 虹鳟 分子克隆 基因表达
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东北狍PTN基因cDNA克隆及表达分析
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作者 卢斌山 王强辉 +2 位作者 张强 高悦禹 夏彦玲 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期82-86,共5页
采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲... 采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质,其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占46.71%、32.34%和20.96%;生物信息分析发现,东北狍PTN基因在进化上较为保守,与其他物种同源性均>89%;构建的进化树表明,东北狍PTN基因与野牦牛、绵羊、野猪等偶蹄目动物亲缘关系较近,这一结果符合经典分类学规律;实时荧光定量RT-PCR分析显示,PTN基因在狍茸顶端组织不同生长层表达量存在显著差异,其中前软骨和间充质组织层的表达量明显高于皮肤和软骨组织层。 展开更多
关键词 东北狍 PTN基因 分子克隆 生物信息分析 实时荧光定量RT—PCR
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略
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作者 杨发誉 杨云彭 霍毅欣 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期364-370,共7页
随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的... 随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的培训周期长,不利于以流水线形式进行工程化使用,已经逐步在生物工程领域内被淘汰。文中论述了一系列适于机械化操作的新一代分子克隆技术,即不依赖基因序列和连接反应克隆方法、Gibson组装、聚合酶环形延伸克隆、细胞裂解物体外无痕连接和细胞体内组装克隆。对这些方法的建立、基本原理及应用前景等方面进行了总结,并对其优缺点进行了比较。 展开更多
关键词 分子克隆 不依赖基因序列和连接反应克隆方法 Gibson组装 聚合酶环形延伸克隆 细胞裂解物体外无痕连接 细胞体内组装克隆
Molecular Cloning and Phylogenetic Analysis of a Chitin Deacetylase Isolated from the Epidermis of the Red Snow Crab <i>Chionoecetes japonicas</i> 预览
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作者 Kakeru Fujimori Hideto Fukushima Masahiro Matsumiya 《生命科学与技术进展(英文)》 2018年第1期52-62,共11页
Chitin deacetylase (CDA;EC 3. 5. 1. 41) catalyzes the deacetylation of chitin. In this study, we successfully cloned and sequenced a chitin deacetylase gene from the red snow crab Chionoecetes japonicas. By using reve... Chitin deacetylase (CDA;EC 3. 5. 1. 41) catalyzes the deacetylation of chitin. In this study, we successfully cloned and sequenced a chitin deacetylase gene from the red snow crab Chionoecetes japonicas. By using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and 5' and 3' rapid amplification of cDNA ends, we obtained a 2141-bp amplicon containing a chitin deacetylase gene (CjCDA) from the epidermis of C. japonicas. The amplicon contains a 1575-bp open reading frame that is predicted to encode a 525-amino acid protein. The structure predicted from the deduced amino acid sequence included an N-terminal signal peptide, chitin-binding domain (CBD), low-density lipoprotein receptor class A domain (LDL-A), and catalytic domain. Comparative analysis of the deduced amino acid sequence of CjCDA revealed the highest homology (74%) to gastrolith protein 59 of Cherax quadricarinatus. We used RT-PCR to evaluate the expression of CjCDA in various tissues of C. japonicas, and we observed that CjCDA was expressed only in the epidermis. A phylogenetic analysis, using the amino acid sequences of CjCDA and other known chitin deacetylases, showed that CjCDA belonged to a group of crustacean chitin deacetylases. To our knowledge, this is the first study reporting the cDNA cloning of a chitin deacetylase from a crab. 展开更多
关键词 CHITIN DEACETYLASE Molecular Cloning Chionoecetes japonicas Phylogenetic ANALYSIS Expression ANALYSIS
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大肠杆菌丙酮酸脱氢酶蛋白研究 预览
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作者 陶施淼 王盼星 +1 位作者 薛藩 王进军 《科教导刊》 2018年第32期29-30,共2页
原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种慢性疾病,PBC患者体内大肠杆菌增多并且粪便中大肠杆菌出现变异。本 文对PBC患者大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶蛋白的变化及大肠杆菌诱发PBC分子机制研究进展进行综述。
关键词 大肠杆菌 丙酮酸脱氢酶 分子模拟机制 分子克隆技术
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薏苡分子生物学研究进展 预览
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作者 王红娟 江本利 +4 位作者 於春 路献勇 胡积送 闫晓明 朱加保 《安徽农业科学》 CAS 2018年第1期10-13,共4页
目前关于薏苡分子生物学方面的研究虽然相对其他作物起步较晚,但也取得了一些重要进展。从分子标记、功能基因和基因组测序3个方面综述了国内外关于薏苡的分子生物学研究,讨论了薏苡分子水平研究的现状和发展方向,为其分子生物学进一步... 目前关于薏苡分子生物学方面的研究虽然相对其他作物起步较晚,但也取得了一些重要进展。从分子标记、功能基因和基因组测序3个方面综述了国内外关于薏苡的分子生物学研究,讨论了薏苡分子水平研究的现状和发展方向,为其分子生物学进一步研究提供参考。 展开更多
关键词 薏苡 分子标记 基因克隆 分子生物学
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橘小实蝇神经肽sulfakinin的分子生物学特性及其表达模式 预览
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作者 栗洪飞 郑莉莎 +2 位作者 石岩 王进军 蒋红波 《生物安全学报》 2018年第3期186-192,共7页
【目的】分析橘小实蝇sulfakinin的时空表达模式及其对饥饿的响应,初步明确sulfakinin在调节橘小实蝇行为和生理方面的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆橘小实蝇神经肽sulfakinin的c DNA序列,采用实时定量PCR技术分析该基因在橘小实蝇... 【目的】分析橘小实蝇sulfakinin的时空表达模式及其对饥饿的响应,初步明确sulfakinin在调节橘小实蝇行为和生理方面的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆橘小实蝇神经肽sulfakinin的c DNA序列,采用实时定量PCR技术分析该基因在橘小实蝇不同发育阶段、成虫不同组织、幼虫不同组织及其在饥饿胁迫下的表达模式,并运用半定量RT-PCR技术进一步验证。【结果】实时定量PCR分析结果表明,sulfakinin在橘小实蝇的幼虫期和成虫期显著性高表达,卵期和蛹期几乎不表达。其中早期成虫表达量最高,约为晚期成虫的2倍,幼虫期表达量位于两者之间。在橘小实蝇幼虫、成虫不同组织中,sulfakinin在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织,在触角的表达量仅次于中枢神经系统。此外,橘小实蝇在经饥饿处理24 h的过程中,sulfakinin的表达量均出现下调,其中从饥饿处理结果可知在6 h下降幅度最大,12 h和24 h表达量下降幅度减少。半定量RT-PCR技术进一步检测结果与实时定量PCR技术检测结果一致。【结论】sulfakinin在橘小实蝇中枢神经系统可能调节橘小实蝇成虫对饥饿胁迫的响应。其在触角中的高表达可能与橘小实蝇嗅觉的敏感性相关。本研究为进一步研究橘小实蝇sulfakinin的生理功能、评估其药靶潜力奠定了理论基础。 展开更多
关键词 橘小实蝇 神经肽 SULFAKININ 表达模式 分子克隆
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