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牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用
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作者 赵洪哲 范峻豪 +3 位作者 李新培 王昊 关平原 温永俊 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期287-293,共7页
为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间... 为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0~4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 杂交瘤细胞 单克隆抗体(MAb) 直标荧光抗体
抗人t-PSA单克隆抗体的制备及化学发光检测方法的建立 预览
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作者 曹领改 张兰兰 魏德强(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第13期1599-1603,共5页
目的:制备抗人前列腺癌特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体,建立t-PSA的化学发光CLIA检测方法。方法: t-PSA抗原免疫小鼠后,通过细胞融合、HTS筛选、扩大培养及亲和纯化后得到t-PSA单克隆抗体(mAb),测定抗体亲和力、特异性及表位,最后选择抗... 目的:制备抗人前列腺癌特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体,建立t-PSA的化学发光CLIA检测方法。方法: t-PSA抗原免疫小鼠后,通过细胞融合、HTS筛选、扩大培养及亲和纯化后得到t-PSA单克隆抗体(mAb),测定抗体亲和力、特异性及表位,最后选择抗不同表位的单克隆抗体建立双抗体夹心 CLIA检测方法。结果:获得4株阳性信号较强的抗人t-PSA的mAb(3-21-1、3-26-1、3-40-1、3-41-1)。用3-21-1 mAb-HRP和3-26-1 mAb-HRP建立的CLIA体系检测范围为0.1~100 ng/ml,最低检测限为 0.09 ng/ml,相对偏差均在±5%之内,与肿瘤标志物CEA、AFP、Myo无交叉反应。与罗氏试剂检测t-PSA结果对比,一致性检验KAPPA系数为0.933,相关系数为0.936,两组数据具有较好的一致性和相关性。结论:本研究成功制备了抗人t-PSA mAb,建立了定量检测t-PSA的双抗体夹心CLIA 方法。 展开更多
关键词 人前列腺癌特异性抗原 单克隆抗体 肿瘤标志物 化学发光免疫分析
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单克隆抗体消光系数测定方法的建立
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作者 孙开青 李文华 +3 位作者 周冬梅 徐军 孙文正 杨彬 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第6期633-637,共5页
目的建立单克隆抗体药物消光系数测定方法,用于单克隆抗体药物的鉴别和紫外分光光度法的定量分析,并对其进行初步评价。方法使用6 mol/L盐酸胍对抗体进行变性处理,打开抗体折叠的高级结构,将其当作是色氨酸、酪氨酸和"S-S"键的三元体... 目的建立单克隆抗体药物消光系数测定方法,用于单克隆抗体药物的鉴别和紫外分光光度法的定量分析,并对其进行初步评价。方法使用6 mol/L盐酸胍对抗体进行变性处理,打开抗体折叠的高级结构,将其当作是色氨酸、酪氨酸和"S-S"键的三元体系,通过检测相同浓度下折叠和非折叠抗体在紫外280 nm波长处的吸光值,计算抗体的消光系数,并进行方法的精密度验证。结果两种单克隆抗体m Ab1和m Ab2在280 nm波长处的消光系数平均值分别为1.702和1.387 m L/(mg·cm);两位实验员检测的消光系数各自相对标准偏差分别为0.48%和0.87%,总相对标准偏差为0.69%,均小于1%,表明方法精密度良好。结论建立的方法操作简单,不依赖于抗体浓度,不破坏其二硫键结构,结果准确,可用于单克隆抗体药物消光系数的测定。 展开更多
关键词 单克隆抗体 消光系数 变性 朗伯比尔定律
阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体的电荷异质性 预览
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作者 秦海艳 安晨 +6 位作者 宋兰兰 陈继军 黄峥 乔玉玲 南建军 庄超 毛晓燕 《微生物学免疫学进展》 2018年第4期19-25,共7页
目的建立阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)电荷异质性的方法,并对其进行验证。方法基于m Ab等电点呈弱碱性,且因为抗体所带电荷的不同导致其与色谱柱结合力的不同,采用"PropacTMWCX... 目的建立阳离子交换高效液相色谱检测重组人源化抗CD52单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)电荷异质性的方法,并对其进行验证。方法基于m Ab等电点呈弱碱性,且因为抗体所带电荷的不同导致其与色谱柱结合力的不同,采用"PropacTMWCX-10"弱阳离子交换柱,利用盐梯度洗脱的方法依次洗脱出m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体及碱性电荷变异体;对方法的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性进行验证。结果阳离子交换高效液相色谱分析重组人源化抗CD52 m Ab各电荷变异体的保留时间在14~21 min之间,其中酸性电荷变异体的保留时间在14~17 min,中性电荷变异体的保留时间在17~18 min,碱性电荷变异体的保留时间在18~21 min之间。专属性验证显示空白辅料对照色谱图在样品出峰位置无干扰。线性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体相关系数R2均〉0.99。准确性验证显示酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体回收率分别为99.3%~99.9%、99.8%~100.4%和99.3%~99.7%。仪器重复性、样品重复性和中间精密度验证中,各电荷变异体的RSD均〈5%。耐用性验证中,流动相p H在8.0±0.1、流动相中盐浓度为100 mmol/L±5 mmol/L、柱温在(30±2)℃变化时各电荷变异体的RSD均〈5%。结论阳离子交换高效液相色谱可以有效分离重组人源化抗CD52 m Ab的酸性电荷变异体、中性电荷变异体和碱性电荷变异体,且该方法具有良好的专属性、线性、准确性、精密度和耐用性。 展开更多
关键词 阳离子交换高效液相色谱 CD52 单克隆抗体 电荷异质性
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Pharmacokinetics of monoclonal antibodies ]nd Fc-fusion proteins
5
作者 Liming Liu 《蛋白质与细胞:英文版》 SCIE CAS CSCD 2018年第1期15-32,共18页
关键词 蛋白质 FC 抗体 熔化 MABS ND 相互作用能 再循环
抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用 预览
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作者 吴智远 焦磊 +6 位作者 徐兵 辛有全 常娅莉 张青雯 祁芝珍 卜培英 王秉翔 《微生物学免疫学进展》 2018年第1期7-13,共7页
目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,... 目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P〈0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。 展开更多
关键词 鼠疫耶尔森菌 鼠疫耶尔森菌F1抗原 单克隆抗体 被动免疫保护
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氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立 预览
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作者 范素菊 杨兴东 高润 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第9期2566-2574,共9页
本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法。在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和... 本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法。在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株(2C4),抗体效价为4.8×10^-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件:0.4μg/mL CAP-HS-OVA 37℃包被2 h;5%猪血清37℃封闭1 h;1∶6.4×10 4 CAP单克隆抗体37℃孵育15 min;1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37℃孵育30 min;室温显色9 min。绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度(IC 50)为0.53 ng/mL。添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%~96.6%和93.7%~96.8%,批内变异系数分别为2.3%~5.0%和2.2%~4.6%,批间变异系数分别为2.7%~4.1%和2.3%~3.6%。HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异。本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求。 展开更多
关键词 氯霉素 残留检测 单克隆抗体 ci-ELISA
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细胞角蛋白19片段抗原21-1含量化学发光微粒子定量免疫检测方法的建立 被引量:1
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作者 王英雪 郭小怡 +3 位作者 刘江武 翁祖星 葛胜祥 陈毅歆 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第5期523-527,共5页
目的建立细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1,CYFRA21-1,简称CY21-1)含量的化学发光微粒子免疫检测方法(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)。方法原核表达制备重组CY21-1(r CY21-1),用其免疫... 目的建立细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment 21-1,CYFRA21-1,简称CY21-1)含量的化学发光微粒子免疫检测方法(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)。方法原核表达制备重组CY21-1(r CY21-1),用其免疫BALB/c小鼠后,收集小鼠脾脏细胞,常规杂交瘤技术与Sp2/0进行融合,制备CY21-1单抗。间接ELISA法筛选可稳定分泌CY21-1抗体的杂交瘤细胞,分别标记微性磁珠(magnetic beads,MB)和吖啶酯(acridinium ester,AE),筛选可特异检测CY21-1的单抗配对,建立CY21-1 CMIA,同时验证方法的线性及灵敏度,并与同类试剂盒进行比较。结果经筛选获得了一组能特异检测CY21-1的单抗配对MB*26B5-3E4*AE,建立的CY21-1 CMIA对检测CY21-1校准品的线性范围为0.1-1 000 ng/m L,R-2=0.992 3,检测灵敏度为0.076 ng/m L。该方法与美国雅培公司生产的Abbott CY21-1 CMIA诊断试剂盒平行检测250份临床血清标本的结果具有良好的相关性(R-2=0.961 6)。结论成功建立了CY21-1 CMIA,且具有良好的线性及灵敏度,为我国肺癌的临床筛查和早期诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 细胞角蛋白19片段抗原21-1 单克隆抗体 化学发光微粒子免疫检测方法 非小细胞肺癌
H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位预测方法研究
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作者 郭春艳 刘杨 +7 位作者 封青 梁导艳 孙晶莹 李慧瑾 赵向绒 李研 赵彭花 胡军 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期93-97,共5页
目的对H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白抗原表位预测方法进行研究。方法用H1N1流感病毒裂解疫苗常规法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/O)融合、克隆化筛选,获得特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mA... 目的对H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白抗原表位预测方法进行研究。方法用H1N1流感病毒裂解疫苗常规法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/O)融合、克隆化筛选,获得特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记各株mAb,ELISA阻断试验检测各mAb相互阻断结果;克隆各mAb的轻链和重链可变区基因,并用计算机模拟预测各mAb结合HA抗原表位的氨基酸位点。结果获得稳定分泌抗H1N1流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞3株;ELISA阻断试验将3株mAbs分为2类;计算机模拟预测将3株mAbs也分为2类。结论ELISA阻断试验和计算机模拟预测在解析H1N1流感病毒HA蛋白抗原表位时可以相互佐证。 展开更多
关键词 H1 N1流感病毒 血凝素 单克隆抗体 抗原表位
汞离子胶体金免疫层析试纸条的研制
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作者 王玉珍 温雅琼 +2 位作者 陈泽忠 冯锋 邓安平 《西南大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2017年第11期107-112,共6页
基于特异性识别汞离子的单克隆抗体,以胶体金标记抗体作为检测探针,样品中的汞离子和检测线上的包被抗原竞争与免疫探针结合,建立了一种快速测定水样中汞离子的胶体金免疫层析试纸条方法.在最优实验条件下,试纸条对汞离子的检出限为100... 基于特异性识别汞离子的单克隆抗体,以胶体金标记抗体作为检测探针,样品中的汞离子和检测线上的包被抗原竞争与免疫探针结合,建立了一种快速测定水样中汞离子的胶体金免疫层析试纸条方法.在最优实验条件下,试纸条对汞离子的检出限为100μg/L,与其他金属离子没有交叉反应,样品的加标回收实验结果与酶联免疫吸附分析方法(ELISA)有很好的相关性.整个分析过程在10min内可以完成,表明该方法可以快速直接检测汞离子,不需要复杂的样品预处理过程. 展开更多
关键词 汞离子 胶体金 免疫层析 试纸条 单克隆抗体
人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备 预览
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作者 何赛 廖旻晶 +8 位作者 靳晓瑞 邱义兰 李晓丹 郑姣 唐娜 罗焕 梁湘辉 郭向荣 刘如石 《生命科学研究》 CAS CSCD 2017年第1期16-22,共7页
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并... 人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)分布广泛,能够引发多种疾病,人群感染率极高,严重威胁到人类健康。现根据标准毒AD169基因序列,人工合成包膜糖蛋白B(glycoprotein B,g B)AD13区段的主要中和抗原表位AD-1、AD-2、AD-3,并将其与表达载体p ET-32a连接,构建重组表达质粒;用IPTG诱导表达重组蛋白,采用Western-blot进行特异性鉴定;将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,然后筛选制备AD13单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)。12%SDS-PAGE电泳鉴定表明重组蛋白表达成功,其相对分子质量约为35 k D;Western-blot和间接ELISA结果说明,重组AD13蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性;克隆化后筛选到5个AD13单克隆抗体细胞株,经间接ELISA鉴定,与AD13抗原有良好的特异性反应。上述研究为研发HCMV快速诊断试剂盒提供了原料,也为研究HCMV亚单位疫苗提供了相关的基础。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒(HCMV) 包膜糖蛋白B(g B) 中和表位 单克隆抗体(m Ab) 酶联免疫吸附反应(ELISA) 免疫反应性
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副溶血性弧菌单克隆抗体的制备及特性鉴定 预览 被引量:4
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作者 谢曼曼 李建武 +5 位作者 王广彬 曾海娟 翟绪昭 丁承超 刘武康 刘箐 《食品科学》 EI CSCD 北大核心 2017年第8期63-68,共6页
为制备特异性强的副溶血性弧菌的单克隆抗体,解决单克隆抗体对免疫学检测产品研发的制约,以副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC17802标准菌株免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、间接酶联免疫吸附测定法筛选,获得稳定分泌抗副溶... 为制备特异性强的副溶血性弧菌的单克隆抗体,解决单克隆抗体对免疫学检测产品研发的制约,以副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC17802标准菌株免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、间接酶联免疫吸附测定法筛选,获得稳定分泌抗副溶血性弧菌(ATCC17802)菌株的单克隆杂交瘤细胞株3F7D7E8C4,通过体内诱生腹水大量制备抗体,用亚类试剂盒测定抗体亚类为IgG1;采用辛酸硫酸铵沉淀法以及亲和层析柱对腹水进行纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳实验鉴定单克隆抗体的纯度。制备得到腹水抗体效价为1∶16000,纯化后抗体效价为1∶8000,抗体敏感性IC50达到106CFU/mL。纯化后的抗体与12株副溶血性弧菌均能特异性结合,与其他9种非副溶血性弧菌的食源性致病菌均无交叉反应。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 单克隆抗体 酶联免疫吸附测定
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一种单克隆抗体的电荷异质体分析 被引量:1
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作者 陈捷敏 郑欣桐 +2 位作者 周芳 马红霞 林军 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第8期828-832,共5页
目的 对抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体的电荷异质体进行结构鉴别及生物学功能分析。方法 通过检测抗PD-1单克隆抗体经专一性蛋白酶(唾液酸酶及羧肽酶)酶切前后的变化,初步确认电荷异质体的种类。采用阳离... 目的 对抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体的电荷异质体进行结构鉴别及生物学功能分析。方法 通过检测抗PD-1单克隆抗体经专一性蛋白酶(唾液酸酶及羧肽酶)酶切前后的变化,初步确认电荷异质体的种类。采用阳离子交换色谱对电荷异质体进行分离和收集,经联用液相色谱-质谱(LC-MS)法分析电荷异质体各组分的组成;通过抑制抗原与配体相互作用影响NFAT荧光素酶报告基因表达的方法确定电荷异质体的生物学功能。结果 碱性异质体含量较少,主要变化为重链N-末端谷氨酰胺未环化;酸性异质体主要变化为重链N383脱氨化和糖链末端唾液酸化。各异质体的生物学活性为89%~102%。结论 抗PD-1单克隆抗体电荷异质体大部分修饰位点均远离互补决定区(complementary determining region,CDR),且在体外生物学活性方面差异较小。 展开更多
关键词 单克隆抗体 电荷异质体 离子交换色谱 联用液相色谱-质谱法 生物学活性
抗血管内皮生成因子单克隆抗体中试纯化工艺的建立
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作者 杨辉 周张章 +3 位作者 马旭通 林小鹊 孙文正 杨彬 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第2期181-185,191共6页
目的通过对小试条件优化,选择纯化抗血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体生物类似药的最佳条件,放大至中试规模,建立中试纯化工艺。方法 protein A亲和填料捕获收集液进行料液调节后,采用阳离子填... 目的通过对小试条件优化,选择纯化抗血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体生物类似药的最佳条件,放大至中试规模,建立中试纯化工艺。方法 protein A亲和填料捕获收集液进行料液调节后,采用阳离子填料进行纯化。通过单因素试验,探讨protein A洗脱p H对收获液抗体质量的影响,以及阳离子洗脱p H、洗脱盐浓度和上样载量对收获液抗体质量的影响,分别经上述两步纯化获得抗VEGF单克隆抗体,再分别采用Protein A-HPLC检测单抗的浓度,高效毛细管电泳检测其纯度,SEC-HPLC检测其多聚体含量。结果通过小试优化,protein A最佳洗脱p H为3.8,阳离子层析最佳操作条件为上样载量40 mg/ml,洗脱p H 6.5,洗脱盐浓度(25 mmol/L PBS+100 mmol/L Na Cl)。按小试优化的条件放大至中试规模,无论是protein A还是阳离子层析均能够成功放大,最终下游纯化产物纯度为(98.3±0.2)%,多聚体含量为(1.6±0.3)%,均优于参比制剂。结论通过两步层析:亲和层析+阳离子层析的下游纯化组合方法得到的抗VEGF单克隆抗体的关键质量指标与参比制剂一致,为其进一步的工业放大提供了实验依据。 展开更多
关键词 血管内皮生成因子 单克隆抗体 中试 两步层析
人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定 预览
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作者 翟源惠 刘云 +4 位作者 刘晓芬 张萃 吴强 汪琦 刘晓波 《广东药科大学学报》 CAS 2017年第3期403-407,共5页
目的建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定。方法将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)... 目的建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定。方法将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合。结果提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A_(490))是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白。结论分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合。 展开更多
关键词 人转铁蛋白受体(TfR) 小鼠杂交瘤细胞 单克隆抗体
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重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法的建立
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作者 吕丽娟 陈保汉 +3 位作者 周冬梅 徐军 孙文正 杨彬 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第3期293-297,共5页
目的建立抗TNF-α单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法以健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为效应细胞,自主构... 目的建立抗TNF-α单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法以健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为效应细胞,自主构建膜表面表达TNF-α(membrane-expressed form of TNF-α,m TNF-α)CHO细胞作为靶细胞,通过系列不同浓度的重组抗TNF-α单克隆抗体原研药(m Ab-O)和候选药(m Ab-S)进行ADCC检测,采用四参数拟合计算二者的半数抑制浓度(IC_(50))及m Ab-S的相对活性,并在优化实验条件的基础上进行专属性、精密度验证。结果重组抗TNF-α单克隆抗体的浓度与细胞毒性存在量效关系,符合四参数方程式,曲线在半对数坐标上呈典型S型,R2〉0.99。方法经优化确定相同个体来源PBMC作为效应细胞,靶细胞数目4×10~4个/孔,效靶比25∶1,抗体靶细胞孵育时间1 h,诱导时间4 h。该方法具有良好的专属性,对于相同个体来源的PBMC,m Ab-S活性总体与m Ab-O相近(50%~200%),相对活性重复性RSD为4.64%,同一实验人员间隔3个工作日检测结果的RSD为12.50%,2名实验人员2次检测结果的RSD为8.21%,均符合方法验证的可接受标准。结论成功建立了重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强,精密度好,可作为重组抗TNF-α单克隆抗体与上市原研药相对ADCC生物学活性的评估方法。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子 单克隆抗体 抗体依赖细胞介导的细胞毒性 生物学活性
降钙素原的原核表达及单克隆抗体制备 预览
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作者 郑姣 邱义兰 +7 位作者 廖旻晶 李晓丹 张坚松 吴意 何赛 梁湘辉 郭向荣 刘如石 《激光生物学报》 CAS 2016年第2期147-155,共9页
目的:高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白,制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体.方法:大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后,利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后,经质谱、Westernblot和间接ELISA法进行性质鉴定和... 目的:高效表达与纯化可溶性重组人PCT蛋白,制备高灵敏度和高特异性的抗人PCT医用诊断单克隆抗体.方法:大肠杆菌表达重组人PCT蛋白后,利用饱和硫酸铵沉淀和亲和层析方法纯化PCT蛋白后,经质谱、Westernblot和间接ELISA法进行性质鉴定和分析重组蛋白的表达与免疫反应性;重组蛋白免疫小鼠,经细胞融合及筛选制备抗PCT单克隆抗体(mAb).结果:在大肠杆菌中高效表达了人PCT蛋白;重组人PCT蛋白具有良好的免疫反应性与免疫原性;经筛选获得7株抗PCT单克隆抗体细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与PCT抗原有良好的特异性反应.结论:利用重组人PCT蛋白免疫制备了抗人PCT单克隆抗体,为进一步研发PCT快速诊断试剂提供了原料. 展开更多
关键词 降钙素原 原核表达 酶联免疫吸附(ELISA) 纯化 单克隆抗体(mAb)
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HER3/ErbB3, an emerging cancer therapeutic target 被引量:1
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作者 Ningyan Zhang Yujun Chang +1 位作者 Adan Rios Zhiqiang An 《生物化学与生物物理学报:英文版》 SCIE CAS CSCD 2016年第1期39-48,共10页
HER3 是由四种密切相关的类型组成的 HER (EGFR/ErbB ) 受体家庭的一个成员 1 transmembrane 受体(EGFR, HER2, HER3,和 HER4 ) 。她的受体是与 Ras/Raf/MAPK, PI3K/AKT, JAK/STAT,和 PKC 发信号小径缠绕的一个复杂发信号网络的... HER3 是由四种密切相关的类型组成的 HER (EGFR/ErbB ) 受体家庭的一个成员 1 transmembrane 受体(EGFR, HER2, HER3,和 HER4 ) 。她的受体是与 Ras/Raf/MAPK, PI3K/AKT, JAK/STAT,和 PKC 发信号小径缠绕的一个复杂发信号网络的部分。HER 的异常激活受体和下游的发信号分子尖端细胞的事件上的平衡,导致癌症的各种各样的类型。Monoclonal 抗体(mAbs ) 和指向 EGFR 和 HER2 酷氨酸 kinase 活动的小分子禁止者在癌症,而是他们的临床的功效的几种类型的治疗展出临床的好处被药抵抗的出现限制。HER3 是 HER2 的比较喜欢的 dimerization 搭挡,它好证实 HER3 在药抵抗起一个重要作用到指向 EGFR 和指向 HER2 治疗。因为 HER3 限制了 kinase 活动, mAbs 正在被探索为癌症治疗指向 HER3。当前,近似一打 anti-HER3 mAbs 在临床的开发的不同阶段。然而,确定的 biomarkers 的缺乏使成层更挑战性癌症病人指向 HER3 治疗能是谁更有效的。在这评论,我们作为一个癌症药目标,在为 anti-HER3 治疗的 biomarker 发现的最近的发展,和在指向 HER3 mAbs 的临床的发展取得的进步集中于 HER3 的确认。 展开更多
关键词 肿瘤治疗 单克隆抗体 跨膜受体 癌症患者 生物标志物 EGFR 临床疗效 靶点
产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量:1
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作者 宋路 曾晓燕 +4 位作者 史凤娟 黄明明 宋小凯 李祥瑞 焦永军 《畜牧与兽医》 北大核心 2016年第8期18-21,共4页
为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素... 为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。 展开更多
关键词 产志贺毒素大肠杆菌 Ⅰ型志贺毒素 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA
PCSK9单克隆抗体作用机制与临床研究进展 被引量:1
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作者 陈曦 刘伯宁 +2 位作者 杨赟 陈启 王皓 《现代生物医学进展》 CAS 2016年第6期1156-1160,共5页
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是前蛋白转化酶家族成员之一,它通过与肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,使体内低密度脂蛋白水平升高,引发高血脂。PSCK9抑制剂可以达到降低血脂的临床效果并已经成为重要的减少冠心病发病率的... 前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是前蛋白转化酶家族成员之一,它通过与肝细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)结合,使体内低密度脂蛋白水平升高,引发高血脂。PSCK9抑制剂可以达到降低血脂的临床效果并已经成为重要的减少冠心病发病率的药物靶点。尤其是单克隆抗体药物,作为目前唯一的具有降脂功能的单克隆抗体,在临床试验上的表现对于家族遗传性高血脂的治疗及冠心病的防治都具有重要意义。本文将主要对PCSK9的作用机制及其单克隆抗体的研发现状、临床试验进展进行总结,旨在对降脂单抗药物研发与临床应用作为参考。 展开更多
关键词 前蛋白转化酶枯草溶菌素9 低密度脂蛋白受体 低密度脂蛋白胆固醇 高胆固醇血症 单克隆抗体
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