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猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达 预览
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作者 潘孝成 沈学怀 +5 位作者 赵瑞宏 戴银 胡晓苗 侯宏艳 周学利 张丹俊 《安徽农业科学》 CAS 2019年第17期91-93,共3页
[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDVFD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDVFD株N基因序列全长为1326个核苷酸,编... [目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDVFD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDVFD株N基因序列全长为1326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58ku;Westernblot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N蛋白 原核表达
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小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立
2
作者 毛立 张纹纹 +5 位作者 李文良 杨蕾蕾 李基棕 郝飞 刘茂军 江杰元 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第5期114-120,共7页
小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯... 小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA
基于猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用 预览
3
作者 杨朋霞 闫若潜 +6 位作者 王华俊 马震原 王淑娟 赵雪丽 谢彩华 赵月龙 李孟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1021-1026,共6页
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株间接ELISA抗体检测方法,本研究通过RT-PCR方法扩增PEDV变异强毒株N基因并克隆至pQE30载体后进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件... 为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株间接ELISA抗体检测方法,本研究通过RT-PCR方法扩增PEDV变异强毒株N基因并克隆至pQE30载体后进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性试验。对500份来源于不同猪场的临床血清样品进行检测,并将检测结果与进口商品化试剂盒比较。结果显示,表达的重组蛋白约为50.4 ku,western blot结果表明其反应原性良好。该ELISA方法的最优反应条件为:重组N蛋白最佳包被浓度为2μg/m L;血清最佳稀释度为1∶100,作用时间1 h;羊抗猪HRP-Ig G最适稀释度为1∶5 000,作用时间为30 min;TMB最佳显色时间为10 min。该方法可特异性检测PEDV抗体,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TGEV等病原的阳性血清均无交叉反应;该方法检测出阳性血清的最高稀释倍数与中和试验结果基本一致,具有较高的敏感性;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。对500份临床猪血清的检测结果,与进口商品化试剂盒检测结果相比符合率为99.6%。本研究为PEDV抗体检测提供了一种有效的血清学方法。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 变异强毒株 N蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
4
作者 于洁 刘雪威 +2 位作者 白娟 宋中宝 姜平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期821-827,共7页
为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10... 为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10、3G12、6E2和6F4,Western-blot和IFA鉴定其均能与PRRSV特异性反应。4株单抗均属于IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA结果显示,3D10、3G12、6E2和6F4之间的叠加系数均在50%以上。选择N蛋白3个主要抗原表位合成肽进行ELISA检测,证明4株单抗识别的抗原表位均为30~52 aa,提示4株单克隆抗体亲和力可能存在一定差异,为该病毒研究提供了重要材料。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 单克隆抗体 N蛋白
越南水稻黄矮病毒多克隆血清抗体的制备 预览
5
作者 何越强 陈氏懦花 +5 位作者 陈阮河 杜新勇 阮德辉 韦善富 覃武 吕荣华 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1472-1482,共11页
【目的】制备用于检测水稻黄矮病毒(RYSV)的多克隆抗体,为水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断提供技术支持。【方法】利用两种不同来源的RYSV抗原免疫家兔,一种是从受感染的水稻病叶组织纯化获得RYSV病毒粒子;另一种是从越南RYSV分离株克隆出完... 【目的】制备用于检测水稻黄矮病毒(RYSV)的多克隆抗体,为水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断提供技术支持。【方法】利用两种不同来源的RYSV抗原免疫家兔,一种是从受感染的水稻病叶组织纯化获得RYSV病毒粒子;另一种是从越南RYSV分离株克隆出完整N蛋白编码基因,然后将其连接至pET-28a载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中进行诱导表达获得N蛋白抗原。其中,N蛋白抗原又以两种形式(洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆)对家兔进行免疫。最后,采用PTA-ELISA分析评估家兔抗体血清(多克隆抗体)对水稻叶片和黑尾叶蝉RYSV的特异性和敏感性。【结果】分离自越南RYSV分离株的N基因由1542个核苷酸组成,与来自我国和日本RYS分离株N基因序列进行比对,其核苷酸序列同源性分别为98.1%和97.9%,对应的推导氨基酸序列同源性为83.4%和99.4%。以RYSV病毒粒子、洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆3种抗原免疫家兔获得的多克隆抗体均能有效检测出水稻植株中的RYSV,其中,感病植株的OD405分别为1.449、2.337和1.649,健康植株的OD405分别为0.375、0.294和0.283。PTA-ELISA检测结果表明,获得的多克隆抗体能从单个带病毒黑尾叶蝉中检测出RYSV,且该结论在RT-PCR检测中得到进一步验证。【结论】制备获得的多克隆抗体对RYSV具有较高特异性和敏感性,可用于水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断,同时表明以含有病毒植物蛋白的聚丙烯酰胺切片直接注射免疫模型动物制备多克隆抗体具有可行性。 展开更多
关键词 水稻黄矮病毒 多克隆抗体 酶联免疫吸附测定(ELISA) N蛋白 表达 病毒纯化
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小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的优化及反应活性
6
作者 苗书魁 汪萍 +9 位作者 魏玉荣 陆桂丽 米晓云 夏俊 沙依兰·卡依扎 魏婕 王延 李金娜 马文戈 黄炯 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期30-34,共5页
目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPT... 目的探讨小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法参照GenBank中PPRV (Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a (+)-N,转化至BL21 (DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白(64.4kD)成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件:诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0mmol/L、诱导时间16h。结论原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 原核表达 反应活性
猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立 预览
7
作者 闫瑞杰 张云飞 +3 位作者 刘玲玲 张红垒 王亚宾 胡慧 《西北农林科技大学学报:自然科学版》 CSCD 北大核心 2019年第10期1-8,17共9页
[目的]制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PD-CoV N蛋白抗体的间接ELISA方法.[方法]从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL... [目的]制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PD-CoV N蛋白抗体的间接ELISA方法.[方法]从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定.诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测.[结果]成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应.制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200.以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10g/L BSA在37℃下封闭2h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD450值≥0.272判定为阳性.特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%.用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%.[结论]成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测. 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体 血清学检测
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一株PRRSV N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 预览
8
作者 李敏华 王倩 +1 位作者 田志军 金涛 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期279-283,共5页
为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig... 为了制备具有阻断能力的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb),本研究以PRRSV SD53株感染Marc-145细胞后的上清作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得一株稳定分泌抗PRRSV MAb的杂交瘤细胞株(1H4)。鉴定结果显示,1H4 MAb是Ig G1亚类,轻链为κ链。1H4细胞上清经间接免疫荧光(IFA)检测其效价是1∶40,腹水的IFA效价是1∶3 200。阻断ELISA试验显示1H4 MAb与病毒的结合能够被PRRSV阳性血清阻断。Western blot试验显示1H4 MAb可以特异性识别PRRSV的N蛋白,经截短表达N蛋白鉴定该MAb的抗原识别序列为N蛋白末端aa 107~aa 123。该抗原表位在美洲型PRRSV中高度保守,该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的PRRSV阻断ELISA检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 单克隆抗体 细胞融合 N蛋白 表位鉴定
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赤羽病病毒N蛋白单克隆抗体的制备 预览
9
作者 王冰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期309-312,共4页
为制备赤羽病病毒(AKAV)N蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验利用原核表达系统表达、纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,并以纯化的重组N蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出1株稳定分泌抗AKAV N蛋白的MA... 为制备赤羽病病毒(AKAV)N蛋白的单克隆抗体(MAb),本实验利用原核表达系统表达、纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,并以纯化的重组N蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出1株稳定分泌抗AKAV N蛋白的MAb杂交瘤细胞株IIG5,检测结果显示IIG5为IgG1/κ链。间接免疫荧光结果显示,IIG5与AKAV感染细胞呈阳性反应,与茨城病病毒、中山病病毒以及蓝舌病病毒1型均呈阴性反应,特异性较好。Western blot结果显示,IIG5能够识别重组的以及AKAV感染细胞中的N蛋白。本研究结果为AKAV检测方法的建立及相关研究奠定基础。 展开更多
关键词 赤羽病病毒 N蛋白 原核表达 单克隆抗体
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猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 预览 被引量:1
10
作者 张庆桥 王一鹏 +4 位作者 魏艳秋 米建华 赵雪 孙立旦 宋勤叶 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第1期31-35,I0002共6页
为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3~5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM... 为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3~5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5~1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 N蛋白 杂交瘤细胞 单克隆抗体
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猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备
11
作者 周芝海 谭耀荣 +3 位作者 郑瑶瑶 曾繁文 麦凯杰 马静云 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1179-1186,共8页
为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组... 为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体
猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测中包被抗原的研究 预览
12
作者 娄亚坤 任宝红 +3 位作者 张杰 曾小宇 付燕峰 赵林萍 《畜禽业》 2018年第8期15-16,共2页
目的研究不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白对PRRSV抗体ELISA检测效果的影响。方法将PRRSV重组N蛋白、M蛋白和CGP5蛋白3种蛋白抗原单独包被,灵敏度分别为85.0%、60.0%、50.0%。为进一步优化ELISA检测方法 ,以N蛋白为主包被蛋白,M... 目的研究不同的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原性蛋白对PRRSV抗体ELISA检测效果的影响。方法将PRRSV重组N蛋白、M蛋白和CGP5蛋白3种蛋白抗原单独包被,灵敏度分别为85.0%、60.0%、50.0%。为进一步优化ELISA检测方法 ,以N蛋白为主包被蛋白,M蛋白和GP5蛋白以不同的比例混合包被,研究最佳包被条件。结果当N蛋白、M蛋白和GP5蛋白以5ng:5ng:5ng/孔包被时,敏感性和特异性均达到100%,混包效果优于抗原性蛋白单独包被。为今后PRRSV抗体ELISA检测试剂的进一步研制奠定了基础。 展开更多
关键词 ELISA 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 M蛋白 GP5蛋白
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小反刍兽疫病毒抗体高敏快速荧光定量检测方法的建立 被引量:2
13
作者 孙雨 章建 +6 位作者 王传彬 曲萍 杨天意 吴冠英 吴俊清 杨林 宋晓晖 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第10期1207-1213,共7页
为建立快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的方法,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白,基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒抗体高... 为建立快速定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒抗体的方法,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的N蛋白与NH融合蛋白,基于纯化的可溶性N蛋白与NH融合蛋白建立了小反刍兽疫病毒抗体高敏荧光免疫定量检测试剂盒。该方法能够快速定量检测绵羊血清中的小反刍兽疫病毒抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对292份临床血清样品进行检测,同时用法国IDVET竞争ELISA试剂盒进行比较,两种方法符合率达到93.84%。与血清中和试验进行比较,高敏荧光快速定量检测方法检测效价值基本与标准阳性血清(OIE参考实验室提供)的中和试验效价值相符合。本试验建立的方法可对小反刍兽疫病毒抗体进行现场快速定量检测,具有较高的实用价值和推广价值。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 NH融合蛋白 可溶性表达与纯化 快速定量检测
番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N及膜多糖蛋白Gn的多克隆抗体制备及应用 预览
14
作者 潘慧 赵忠豪 +4 位作者 章松柏 张德咏 张洁 李俊凯 郑立敏 《福建农业学报》 北大核心 2018年第9期963-968,共6页
由番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt orthotospovirus(TSWV)侵染引起的番茄斑萎病毒病在我国蔬菜、花卉等作物上造成了严重的经济损失。本研究克隆了TSWV核衣蛋白N基因及膜多糖蛋白Gn基因,利用Gateway系统获得N和Gn基因的原核表达载体... 由番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt orthotospovirus(TSWV)侵染引起的番茄斑萎病毒病在我国蔬菜、花卉等作物上造成了严重的经济损失。本研究克隆了TSWV核衣蛋白N基因及膜多糖蛋白Gn基因,利用Gateway系统获得N和Gn基因的原核表达载体。将其转化到大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)细胞内,IPTG诱导表达N蛋白和Gn蛋白,以此为抗原分别免疫新西兰大白兔,制备N蛋白和Gn蛋白的多克隆抗体。Western blot检测结果表明,N蛋白的多克隆抗体能够与N蛋白发生特异性结合反应,间接酶联免疫吸附(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)分析检测表明抗体滴度为1∶12 800,而Gn蛋白的多克隆抗体特异性差,效价未检出。本研究制备的N蛋白多克隆抗体可用于田间病株的病害诊断,同时有助于开展病毒在介体昆虫内定位、病毒和介体昆虫互作及功能分析的研究。 展开更多
关键词 番茄斑萎病毒 N蛋白 Gn蛋白 多克隆抗体
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不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立
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作者 马思续 崔春晓 +6 位作者 张留君 冯延 魏凤灵 许瑞勤 杨国宇 夏平安 张改平 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1082-1087,共6页
为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,... 为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET32a—GP4、pET-32a-N和pET-32a—GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP4蛋白 N蛋白 原核表达 间接ELISA方法
猪流行性腹泻病毒的结构和非结构蛋白应对宿主细胞先天性免疫 预览
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作者 袁芃 杨舟 +4 位作者 王凯 杨洋 黄石磊 谢录异 宋振辉 《微生物前沿》 2018年第2期39-47,共9页
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种肠道致病菌。它引起仔猪流行性腹泻,这是许多国家在畜牧业中出现重大经济损失的最重要原因之一。在某种程度上,Toll样受体(TLRs)的转录和干扰素(IFN)的激活这两种先天免疫反应对抗病毒免疫有一定的影响。... 猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种肠道致病菌。它引起仔猪流行性腹泻,这是许多国家在畜牧业中出现重大经济损失的最重要原因之一。在某种程度上,Toll样受体(TLRs)的转录和干扰素(IFN)的激活这两种先天免疫反应对抗病毒免疫有一定的影响。后者在抵御病毒感染的防御中发挥了关键作用。PEDV可以有效通过屏障感染宿主。宿主细胞有一系列复杂的策略来抵抗病毒。目前已经发现,在一些研究中,PEDV调控的宿主先天固有免疫出现了很大的提升。为了逃避宿主-先天免疫反应,PEDV采取了两种方法,PEDV将病毒蛋白编码为干扰素拮抗剂,其病原体相关的分子模式(PAMPs)被隐藏。PEDV的非结构蛋白和一些蛋白酶对这一过程有一定的影响。本文介绍了当前对宿主细胞抗PEDV的先天免疫反应,这过程涉及了PEDV的结构性和非结构性的主要蛋白质,并且分析了几个PEDV入侵细胞的关键机制,进一步为探索PEDV传染性免疫和致病机制提供重要的理论依据,并为临床疫苗或药物研究提供主要的实践支撑。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 先天免疫反应 N蛋白 非结构蛋白
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人参皂苷Rb1对PRRSV的体外抑制作用及对病毒N蛋白表达的影响 预览
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作者 孙娜 杨慧 +4 位作者 赵昕 尹伟 范阔海 孙耀贵 李宏全 《中国兽医杂志》 北大核心 2018年第11期30-34,I0002共6页
为了在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145 细胞模型上,探讨人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,GSR1)抑制PRRSV 能力及其作用机制。采用MTT 法测定GSR1 在Marc-145 细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxicconcentration, MNTC... 为了在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145 细胞模型上,探讨人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,GSR1)抑制PRRSV 能力及其作用机制。采用MTT 法测定GSR1 在Marc-145 细胞上的最大安全浓度(Maximum no-cytotoxicconcentration, MNTC)和半数毒性浓度(50% Cytotoxic concentration, CC50 )。建立PRRSV 感染Marc-145 细胞模型,设计阻断PRRSV 复制和直接杀灭PRRSV 试验,确定GSR1 体外抗PRRSV 的作用方式;利用FQ-PCR 检测GSR1 对病毒N 基因的影响,间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western Blot 技术测定GSR1 对PRRSVN 蛋白表达的影响。结果表明,GSR1 在直接杀灭PRRSV 试验中最高抑制率为54. 65%,在阻断PRRSV 复制试验中前12 h 起抗病毒作用,且最高抑制率达60. 01%,推测GSR1 主要通过直接使病毒灭活或干扰病毒的早中期复制来发挥其抗病毒作用。此外,在设定12 ~72 h 试验时间内,阳性药物利巴韦林组,4 mg/ mL、2 mg/ mL GSR1 组PRRSV N 基因拷贝数显著低于病毒组(P <0. 05)。在对N 蛋白含量影响试验中4 mg/ mL GSR1 和阳性药物可以减少N 蛋白载量。表明GSR1 可以通过抑制病毒N 蛋白的表达来抑制病毒的复制,并可作为抗PRRSV 的候选药物或先导物。 展开更多
关键词 人参皂苷RB1 PRRSV 复制 N蛋白
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抗传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 预览 被引量:1
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作者 周景明 耿玥 +4 位作者 马文利 刘红亮 祁艳华 张改平 王爱萍 《郑州大学学报:理学版》 北大核心 2018年第4期75-79,共5页
将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增N基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-N.将测序正确的重组质粒转化入E.coli Transetta(DE3)感受态,对重组蛋白进行诱导表达并纯化,切除GST标签.采用纯化的... 将IBV H120毒株通过接种鸡胚的方法扩繁,从含病毒的尿囊液中提取总RNA,RT-PCR扩增N基因,构建原核表达载体pGEX-6p-1-N.将测序正确的重组质粒转化入E.coli Transetta(DE3)感受态,对重组蛋白进行诱导表达并纯化,切除GST标签.采用纯化的N蛋白制备抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫效果最好的小鼠B淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合.利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆筛选出13株单抗,其中8株能与IBV结合.通过体内诱生腹水的方法对1A12C5细胞株进行大量制备,辛酸/硫酸铵方法对腹水进行纯化并鉴定. 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 N蛋白 原核表达 单克隆抗体
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犬冠状病毒BC-1株核衣壳蛋白的原核表达及生物信息学分析 预览
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作者 王静 梁琳 +2 位作者 罗亚坤 袁维峰 崔尚金 《畜牧兽医科技信息》 2018年第2期24-26,共3页
本试验对犬冠状病毒核衣壳蛋白编码的基因进行原核表达, 并进行生物信息分析.结果显示, 成功获得 N基因, 全长为 1149 bp, 编码 382 个氨基酸.SDS-PAGE 显示, His-N重组蛋白主要以包涵体形式表达, 大小约为 62 ku.Western blot分析表明... 本试验对犬冠状病毒核衣壳蛋白编码的基因进行原核表达, 并进行生物信息分析.结果显示, 成功获得 N基因, 全长为 1149 bp, 编码 382 个氨基酸.SDS-PAGE 显示, His-N重组蛋白主要以包涵体形式表达, 大小约为 62 ku.Western blot分析表明成功表达目的蛋白.生物信息分析发现 CCoV BC-1 株与 CCoV A76 株和 CCoV HLJ-072株亲缘关系较近; CCoVN 蛋白中含有 3个结构域和 9个潜在的优势抗原表位. 展开更多
关键词 犬冠状病毒 N蛋白 原核表达 生物信息学
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猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因工程亚单位疫苗免疫保护试验 被引量:1
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作者 刘义 杨秀芬 +4 位作者 冯云飞 黄巧珍 荣丽丽 蓝胜芝 荣俊 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第5期174-177,267,268共6页
为了探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因工程亚单位疫苗的免疫保护效果,试验利用大肠杆菌表达并纯化了重组PRRSV N蛋白,添加佐剂制成亚单位疫苗进行免疫保护试验。试验猪分为2个不同佐剂制备的PRRSV N蛋白亚单位疫苗免疫组,1... 为了探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因工程亚单位疫苗的免疫保护效果,试验利用大肠杆菌表达并纯化了重组PRRSV N蛋白,添加佐剂制成亚单位疫苗进行免疫保护试验。试验猪分为2个不同佐剂制备的PRRSV N蛋白亚单位疫苗免疫组,1个PRRSV TJM-F92株减毒活疫苗免疫组和1个攻毒对照组。首免5周后,用PRRSV NVDC-JXA1强毒株攻击,观察临床表现并在攻毒后21 d对试验猪进行剖检。结果表明:首免3周后2个亚单位疫苗组和减毒活疫苗组抗体全部转阳,组间无显著性差异(P〉0.05);攻毒后PRRSV N蛋白亚单位疫苗免疫1#组有2/3的猪只、2#组有1/3的猪只的临床症状、体征和解剖病变较攻毒对照组猪只轻微,转归较好且成活,但保护作用不及PRRSV TJM-F92株减毒活疫苗组;剩余的亚单位疫苗免疫1#组1/3的猪只和亚单位疫苗免疫2#组2/3的猪只,与攻毒对照组猪只一样表现为比较典型的PRRS症状,并在8-12 d内死亡。说明PRRSV N蛋白亚单位疫苗能够引起机体的体液免疫反应,具有部分保护作用,但不能提供完全的保护,单独使用达不到减毒活疫苗的效果。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白 亚单位疫苗 抗体 攻毒
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