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L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因5′端二级结构对重组表达的抑制机制及消除策略 预览
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作者 令狐梅 韩来闯 +1 位作者 周哲敏 崔文璟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第16期1-10,共10页
探究赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)与人工高效表达元件适配过程中翻译抑制产生的机制,并发展新的消除策略.首先在枯草芽孢杆菌中利用高效表达元件验证翻译抑制现象并分析了翻译抑制产生的机制,同时融合sfGFP... 探究赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)与人工高效表达元件适配过程中翻译抑制产生的机制,并发展新的消除策略.首先在枯草芽孢杆菌中利用高效表达元件验证翻译抑制现象并分析了翻译抑制产生的机制,同时融合sfGFP考察其对翻译抑制的影响,筛选与PanD酶适配性强的精简融合肽.结果显示,强组成型启动子不能介导PanD高表达,呈翻译抑制.分析证实,panD转录后mRNA的5'编码区与5'UTR形成抑制性的二级结构,降低翻译起始效率.将两种报告基因和其N端部分序列作为绝缘肽分别与PanD的N端融合后均能够提升重组蛋白的表达水平,消除由mRNA分子内部的顺式作用导致的翻译抑制现象.这为深入探索利用通用型肽绝缘子元件稳定异源基因在底盘中的表达提供依据. 展开更多
关键词 L-天冬氨酸-α-脱羧酶 MRNA二级结构 N端截断 融合肽 枯草芽孢杆菌
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磷脂酶A1辅助蛋白N端截短菌株的构建及其优化表达 预览
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作者 朱昊 薛正莲 +2 位作者 王洲 陈阿娜 杨蒙 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2018年第5期34-38,45共6页
根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构... 根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。 展开更多
关键词 磷脂酶A1辅助蛋白PlaS N端截短 原核表达 表达条件优化
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N端截短对嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶酶学特性及功能的影响 被引量:3
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作者 陈阿娜 刘秀霞 +7 位作者 戴晓峰 詹锦玲 彭枫 李璐 王芬 李松 杨艳坤 白仲虎 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期355-364,共10页
采用N端截短方式对嗜酸普鲁兰芽孢杆菌Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶进行分子精简,构建不同形式的N端截短突变体,考察截短突变对表达水平、酶学特性及实用性能的影响。研究结果表明:缺失X45后,目标蛋白几乎全部以不溶形式的包涵... 采用N端截短方式对嗜酸普鲁兰芽孢杆菌Bacillus acidopullulyticus普鲁兰酶进行分子精简,构建不同形式的N端截短突变体,考察截短突变对表达水平、酶学特性及实用性能的影响。研究结果表明:缺失X45后,目标蛋白几乎全部以不溶形式的包涵体形式存在;缺失CBM41可引起可溶性表达量的大幅提升。缺失CBM41(M1)、X25(M3)、亦或两结构域同时缺失(M5)的变体最适温度(60℃)和最适p H(5.0)与野生型相同。突变体M1和M5的Km值分别提高至野生型的2.4倍和3.1倍,kcat/Km测定结果显示M5催化效率下降明显。突变体M1、M3和M5对分子量较大底物的水解效率略有下降,但对小分子底物的水解效率影响不明显。野生型及突变体M1、M3和M5与糖化酶复配使用时,糖化值(DE)分别为93.6%、94.7%、94.5%和93.1%。上述结果表明,切除CBM41和/或X25结构域的普鲁兰酶变体不影响其在淀粉糖化过程中的应用,且由于分子量减小更易于异源表达,截短突变体可能更适合于工业化生产。 展开更多
关键词 N端截短 普鲁兰酶 表达水平 酶学特性 应用
普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响 被引量:1
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作者 王明道 聂慧慧 +3 位作者 王红阳 邢岩 焦国宝 邱立友 《农业生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1101-1108,共8页
淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域。普鲁兰酶(pullulanase,pul A,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α^(-1),6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率。因此,寻找一条... 淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域。普鲁兰酶(pullulanase,pul A,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α^(-1),6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率。因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义。课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pul A基因(Gen Bank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中异源表达。为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45℃,二者的最适p H分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204 U/mg,是M1的1.6倍。动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的V_(max)、K_(cat)、K_m和K_(cat)/K_m分别为0.001 3μmo L/(m L·s)^(-1)、191.80 s(-1)、0.30 mg/m L、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍。本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路。 展开更多
关键词 普鲁兰酶 信号肽 N端氨基酸 酶学性质 截短
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