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NK4基因联合奥沙利铂对人结肠癌细胞株HCT116凋亡和侵袭的影响 预览
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作者 杨柳婷 姜蓬垒 +3 位作者 祖丹丹 李美宁 张栋 常冰梅 《中国癌症防治杂志》 CAS 2017年第6期456-461,共6页
目的探讨NK4基因联合奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)在人结肠癌细胞HCT116凋亡和侵袭中的作用。方法构建NK4质粒表达载体,将NK4基因转染至HCT116细胞,采用流式细胞术分析NK4基因联合奥沙利铂对HCT116细胞凋亡的影响,Transwell小室法检测... 目的探讨NK4基因联合奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)在人结肠癌细胞HCT116凋亡和侵袭中的作用。方法构建NK4质粒表达载体,将NK4基因转染至HCT116细胞,采用流式细胞术分析NK4基因联合奥沙利铂对HCT116细胞凋亡的影响,Transwell小室法检测NK4基因联合奥沙利铂对该细胞侵袭的影响。采用金正均Q值法判断NK4基因联合奥沙利铂是否有协同作用;Western blot法检测不同药物作用下相关机制蛋白p-Akt的变化情况。结果在HCT116细胞中成功构建NK4质粒表达载体,NK4组m RNA表达水平高于阴性对照组(NC组)和空白组,差异有统计学意义(P〈0.01)。与NC组相比,NK4基因联合奥沙利铂促细胞凋亡作用最显著(16.55%vs 46.86%,P〈0.05);抑制细胞侵袭能力最强(0.9%vs 77.4%,P〈0.05);金正均Q值法结果显示NK4基因联合奥沙利铂具有协同相加作用(0.85≤Q〈1.15),且细胞凋亡和侵袭相关蛋白p-Akt的表达在联合用药组中显著下调,亦显示协同作用(P〈0.01)。结论 NK4基因协同奥沙利铂可能通过Akt相关信号通路诱导HCT116结肠癌细胞凋亡并抑制该细胞侵袭。 展开更多
关键词 结肠肿瘤 NK4 奥沙利铂 凋亡 侵袭
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PAMAM-NK4纳米复合物对乳腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用
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作者 延艳 刘民锋 +7 位作者 孙世强 刘润奇 董建宇 郭昭泽 郭婧昀 王恒雨 叶长生 李文姬 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期206-211,共6页
目的:探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine dendrimer,PAMAM)介导NK4基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用。方法:制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒,纳... 目的:探讨新型纳米材料聚酰胺-胺型树枝状高聚合物(polyamidoamine dendrimer,PAMAM)介导NK4基因对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长的抑制作用及对MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型的治疗作用。方法:制备PAMAM-NK4纳米复合物颗粒,纳米复合物和空载体PAMAM分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞作为实验组和对照组。MTT实验、Western blotting和流式细胞术分别检测转染PAMAM-NK4对细胞增殖、NK4蛋白表达和细胞凋亡的影响。40只雌性裸鼠经皮下注射建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,随机分成4组,每组10只裸鼠:空白组肿瘤接种部位旁皮下注射0.2 ml 0.9%Na Cl溶液、空载体组注射0.2 ml含100μg PAMAM-Lac Z质粒的溶液、给药组注射0.2 ml含100μg PAMAM-NK4质粒的溶液、阳性对照组腹腔注射0.2 ml多柔比星(100μg)溶液。连续注射7 d,第30天处死裸鼠,完整摘除肿瘤,测量肿瘤体积和质量。Western blotting检测各组移植瘤组织NK4蛋白表达。结果:PAMAM-NK4纳米粒转染MDA-MB-231、MCF-7细胞后能够稳定表达NK4蛋白、抑制细胞增殖和增加细胞凋亡率。成功建立MDA-MB-231细胞移植瘤裸鼠模型,给药组和阳性对照组肿瘤体积及质量显著低于空白组(P〈0.05),且安全性良好;给药组NK4蛋白表达显著高于空白组(P〈0.05)。结论:PAMAMNK4纳米粒对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞生长具有抑制作用,并对人乳腺癌细胞移植瘤裸鼠模型具有治疗作用。 展开更多
关键词 聚酰胺-胺型树枝状高聚合物 NK4基因 乳腺癌 基因治疗
过表达NK4对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响
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作者 朱莹然 俞小卫 《南京医科大学学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期950-954,共5页
目的 :构建含有NK4基因的重组慢病毒载体(LV-NK4),感染人肺腺癌A549细胞后观察NK4基因的表达,并研究NK4对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体GV358,脂质体介... 目的 :构建含有NK4基因的重组慢病毒载体(LV-NK4),感染人肺腺癌A549细胞后观察NK4基因的表达,并研究NK4对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用DNA重组技术,将NK4基因克隆至带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体GV358,脂质体介导法将其与慢病毒包装系统共转染293T细胞,包装为慢病毒,感染A549细胞,观察感染效率。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹法(Western blot)检测NK4基因和蛋白的表达。建立A549(空白对照组)、A549/NK4(实验组)、A549/LV(空病毒对照组)3组细胞;RT-PCR法测定各组细胞c-met基因水平;噻唑蓝(MTT)比色法测定各组细胞第1~7天增殖情况,绘制生长曲线;流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:经基因测序证实LV-NK4构建成功;感染后A549细胞中可见明显的NK4蛋白表达,Western blot显示50 000处有蛋白条带;RT-PCR结果显示实验组NK4 m RNA水平较空白对照组和空病毒对照组明显升高(P<0.01),c-met m RNA水平较其他两组下降(P<0.05);MTT结果显示实验组细胞从第4天起生长比正常对照组和空病毒对照组均缓慢(P<0.05);流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率高于正常对照组和空病毒对照组(P<0.05)。结论 :成功构建NK4慢病毒载体且有效转染A549细胞;NK4具有抑制A549细胞增殖并促进其凋亡的作用,可能与下调c-met基因水平有关。 展开更多
关键词 慢病毒载体 人肺腺癌A549细胞 基因转染 NK4 增殖 凋亡
含 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌的制备及其稳定性研究 预览
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作者 杨志华 哈小琴 +5 位作者 张尚弟 冯强生 薛荣利 杨淑娟 赵勇 杨迎桂 《解放军医药杂志》 CAS 2014年第7期33-38,共6页
目的:制备含 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌 TPIN 并检测其稳定性。方法将 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒转进减毒沙门菌 Ty21a 感受态,制备成重组的减毒沙门菌菌株 TPIN;将 TPIN 在含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)的 LB 培养板传代... 目的:制备含 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒减毒沙门菌 TPIN 并检测其稳定性。方法将 pCMV-IL-2-IRES-NK4质粒转进减毒沙门菌 Ty21a 感受态,制备成重组的减毒沙门菌菌株 TPIN;将 TPIN 在含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)的 LB 培养板传代培养至第10代、20代、30代和40代时用灭菌的牙签分别挑取含有氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB 培养基上的单克隆菌落,质粒提取、PCR 扩增酶切鉴定;TPIN 转染 HepG2细胞后采用 RT-PCR 检测IL-2和 NK4基因表达,ELISA 法检测细胞培养上清 IL-2和 NK4蛋白。结果构建菌株经提取质粒、酶切、PCR 扩增获得目的基因 IL-2、NK4特异条带;在氨苄西林(+)和氨苄西林(-)LB 培养板传代培养40代的 TPIN 菌株均可扩增并双酶切出目的基因 IL-2及 NK4;TPIN 体外转染 HepG2细胞后,IL-2及 NK4表达水平均显著升高。结论重组携带IL-2/ NK4双基因的减毒沙门菌菌株 TPIN 可稳定遗传,不受无选择性压力的影响而丢失质粒,且在体外 IL-2、NK4基因及蛋白可以稳定高效表达。 展开更多
关键词 白细胞介素 2 NK4 沙门菌菌苗 疫苗 减毒 基因
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携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察
5
作者 哈小琴 张尚弟 +6 位作者 邓芝云 董菊子 赵勇 彭俊华 张媛媛 林静 王鲲 《中国医药》 2014年第2期230-235,共6页
目的 构建同时携带白细胞介素2(IL-2)和NK4基因的真核表达载体(pIRES-IL-2-IRES-NK4),观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGG... 目的 构建同时携带白细胞介素2(IL-2)和NK4基因的真核表达载体(pIRES-IL-2-IRES-NK4),观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景. 展开更多
关键词 白细胞介素2 NK4基因 质粒载体 构建 活性 INTERLEUKIN-2
共表达人PUMA和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及在胰腺癌细胞中的表达 预览
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作者 黄柏强 李二毛 +1 位作者 孔冠群 黄志平 《国际医药卫生导报》 2013年第16期2474-2478,共5页
目的制备同步表达HGF/NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF/NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内... 目的制备同步表达HGF/NK4基因和PUMA基因的重组腺病毒,感染胰腺癌细胞后检测基因的有效表达。方法将PUMA基因和HGF/NK4基因以串联方式依次克隆至腺病毒穿梭载体,构建重组穿梭载体pAdTrack-PUMA-NK4,转化大肠杆菌BJ5183并在细菌内与腺病毒载体同源重组制备重组腺病毒载体pAd-PUMA-NK4。PacⅠ酶切后转染至HEK293细胞包装得到重组腺病毒。一定滴度的腺病毒感染人胰腺癌细胞株,荧光定量RT-PCR检测细胞中NK4和PUMA基因mRNA表达水平。结果双酶切重组pad-PUMA-NK4穿梭载体鉴定证实目的基因PUMA和HGF/NK4正确克隆;重组腺病毒载体经PacⅠ酶切得到特异的酶切产物转染HEK293细胞后成功包装出重组腺病毒;病毒感染胰腺癌细胞后3-9d内PUMA和NK4基因的表达水平较高,整体持续表达可维持2w。结论成功构建了同时表达NK4和PUMA基因的重组腺病毒载体并包装出相应的重组腺病毒颗粒,该腺病毒能有效感染胰腺癌细胞并高表达NK4和PUMA基因,这为进一步确定NK4和PUMA基因的功能及指导双基因联合治疗胰腺癌提供了理论依据和必要的材料。 展开更多
关键词 腺病毒 NK4 PUMA 胰腺癌
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NK4基因转染对人卵巢癌细胞SKOV-3生物学特性的影响
7
作者 王冬冬 霍乃晨 +4 位作者 耿东华 杨志亮 蔡峰 尹少尉 张淑兰 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2013年第2期147-149,共3页
目的通过在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4基因表达片段,研究NK4对人卵巢癌的治疗作用,从而验证NK4可作为卵巢癌潜在的基因治疗新策略。方法用NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人卵巢癌细胞SKOV-3。用West-ern blot检测细胞培养基中NK4... 目的通过在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4基因表达片段,研究NK4对人卵巢癌的治疗作用,从而验证NK4可作为卵巢癌潜在的基因治疗新策略。方法用NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人卵巢癌细胞SKOV-3。用West-ern blot检测细胞培养基中NK4蛋白表达,以及经不同培养基(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4培养上清)培养后SKOV-3细胞中c-Met和磷酸化-c-Met的表达。用MTT试剂盒绘制细胞生长曲线。用细胞划痕试验检测NK4对细胞转移的作用。结果在SKOV-3/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(SKOV-3,SKOV-3/LUC)细胞中无表达。磷酸化-c-Met在SKOV-3/NK4培养基培养的SKOV-3细胞中被抑制,而在对照(SKOV-3,SKOV-3/LUC)细胞培养基培养的SKOV-3细胞中正常表达。c-Met表达在各组差异无统计学意义。三种细胞体外生长曲线差异无统计学意义(P〉0.05)。细胞划痕试验表明SKOV-3/NK4划痕区域的细胞个数明显少于SKOV-3和SKOV-3/LUC细胞。结论 NK4蛋白在SKOV-3/NK4细胞培养基中大量分泌,NK4能抑制人卵巢癌细胞c-Met受体磷酸化,并能抑制卵巢癌细胞体外活动能力,为应用NK4作为卵巢癌基因治疗方法提供了研究基础。 展开更多
关键词 NK4 卵巢癌 基因治疗
奥沙利铂联合NK4基因对大肠癌HCT116细胞凋亡的影响 预览 被引量:1
8
作者 祖丹丹 李美宁 +3 位作者 张悦红 张栋 弓韬 常冰梅 《中国医药指南》 2013年第28期317-318,321共3页
目的观察奥沙利铂联合NK4基因对HCT116细胞增殖、凋亡的影响。方法使用Effectene转染试剂,将pcDNA3.1-NK4质柱转染至大肠癌HCT116细胞中,常规条件下培养24h。不同奥沙利铂药物浓度处理HCT116细胞,CCK-8法测定细胞的OD值,分析在不... 目的观察奥沙利铂联合NK4基因对HCT116细胞增殖、凋亡的影响。方法使用Effectene转染试剂,将pcDNA3.1-NK4质柱转染至大肠癌HCT116细胞中,常规条件下培养24h。不同奥沙利铂药物浓度处理HCT116细胞,CCK-8法测定细胞的OD值,分析在不同奥沙利铂药物浓度下对HCT116细胞毒性的影响;检测奥沙利铂最低药物浓度联合NK4基因对HCT116细胞凋亡的影响。结果当奥沙利铂药物浓度为12.5μg/mL时,显著抑制细胞的增殖;奥沙利铂(12.5μg/mL)联合NK4基因处理组与奥沙利铂处理组此较,显著诱导HCT116细胞的凋亡,差异具有统计学意义(P〈0.05)。结论与奥沙利铂组相比,奥沙利铂联合NK4基因后HCT116细胞的凋亡率显著升高。 展开更多
关键词 奥沙利铂 NK4基因 HCT116细胞 凋亡
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重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的构建与鉴定 被引量:3
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作者 匡文斌 成凤 +5 位作者 秦晓林 范晓卿 王秦 董晋豫 梁勤东 涂植光 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第6期 676-681,共6页
目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至... 目的构建携带绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)标签和hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,并检测其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法以pcDNA3/hNK4质粒为模板,采用高保真DNA聚合酶扩增hNK4基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hNK4,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP,经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,经4轮扩增后,测定病毒滴度;将重组腺病毒感染AD-293细胞,采用RT-PCR及Western blot法检测感染细胞中NK4基因的转录及蛋白的表达;MTT法检测Ad5-hNK4-EGFP对肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)诱导的MDA-MB-231细胞增殖的影响。结果重组腺病毒质粒pAd5-hNK4-EGFP经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;经包装及4轮扩增后,重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP的滴度可达1.5×1011PFU/ml;经RT-PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的NK4基因能够在AD-293细胞中表达;HGF可促进MDA-MB-231细胞增殖,而Ad5-hNK4-EGFP可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞增殖。结论成功构建了表达hNK4基因的重组腺病毒Ad5-hNK4-EGFP,其可拮抗HGF诱导的MDA-MB-231细胞的增殖,为进一步深入研究HGF和NK4的功能、相互作用及作用机制奠定了基础,也为乳腺癌的靶向基因治疗提供了一个新的靶点。 展开更多
关键词 腺病毒 肝细胞生长因子 NK4 乳腺癌 基因治疗
肝细胞生长因子拮抗剂NK4对裸鼠体内人宫颈癌种植瘤生长的影响 预览 被引量:2
10
作者 王冬冬 王晓黎 林蓓 《山东医药》 CAS 2012年第12期 54-56,共3页
目的通过建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,研究肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂NK4在裸鼠体内对人宫颈癌细胞的生长抑制作用。方法NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染至人宫颈癌细胞CaSki;应用Westernblot检测NK4在细胞培养基中的分泌表达情况... 目的通过建立裸鼠皮下肿瘤生长模型,研究肝细胞生长因子(HGF)拮抗剂NK4在裸鼠体内对人宫颈癌细胞的生长抑制作用。方法NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染至人宫颈癌细胞CaSki;应用Westernblot检测NK4在细胞培养基中的分泌表达情况;检测3组肿瘤细胞(CaSki、CaSki/LUC和CaSki/NK4)体外生长速度;种植3组肿瘤细胞至裸鼠皮下,比较其在裸鼠体内的生长速度。结果在CaSki/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(CaSki和CaSki/LUC)细胞中无表达。3组肿瘤细胞体外生长曲线无统计学差异(P〉0.05)。1周后CaSki/NK4细胞接种的肿瘤生长缓慢,CaSki和CaSki/LUC细胞接种的肿瘤生长迅速,两组比较P〈0.05。结论本研究观察到在裸鼠体内NK4能抑制宫颈癌种植瘤的生长,因此NK4是一个潜在的治疗宫颈癌的新策略。 展开更多
关键词 NK4 子宫肿瘤 基因治疗
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NK4基因转染对裸鼠肝癌移植瘤生长的影响 预览
11
作者 李松林 刘新莉 +1 位作者 李霏 尹元琴 《现代肿瘤医学》 CAS 2012年第11期2255-2258,共4页
目的:构建稳定表达NK4的LM3肝癌细胞系,建立裸鼠肝癌模型,观察肿瘤生长情况,并探讨NK4抑制肿瘤可能的机制。方法:构建携带NK4基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP,转染LM3细胞构建稳定表达NK4的细胞系,分组建立裸鼠肝癌皮下移植... 目的:构建稳定表达NK4的LM3肝癌细胞系,建立裸鼠肝癌模型,观察肿瘤生长情况,并探讨NK4抑制肿瘤可能的机制。方法:构建携带NK4基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES-EGFP,转染LM3细胞构建稳定表达NK4的细胞系,分组建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型。测量肿瘤瘤体的体积,重量,采用免疫组化等方法观察肿瘤微血管密度,瘤体中MMP-9的表达。结果:接种肝癌细胞28天后,NK4组裸鼠移植瘤体积为(1.28±0.25)cm3,明显小于对照组与空载体组(2.15±0.58)cm3和(2.06±0.51)cm3(P〈0.01)。NK4组瘤重为(1.17±0.78)g,显著低于对照组和空载体组(3.69±1.92)g和(3.52±1.68)g(P〈0.01)。NK4转染组的肿瘤血管密度为(10.25±3.85),显著低于对照组和空载体组(2 6.5 6±7.6 2)和(24.37±8.34)。NK4组瘤体中MMP-9表达明显减少。结论:转染NK4基因可以显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长,其作用机制可能是通过抑制肿瘤内新生血管的形成和肿瘤细胞的侵袭。 展开更多
关键词 肝癌 移植瘤 NK4 裸鼠 基因转染
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NK4基因转染对裸鼠卵巢癌腹水瘤生长影响及其机制的探讨
12
作者 王冬冬 王晓黎 +3 位作者 霍乃晨 蔡峰 陈英汉 张淑兰 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2012年第12期1071-1073,共3页
目的在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4cDNA片段,研究NK4在裸鼠体内对人卵巢癌的治疗作用。方法 NK4和荧光霉素(luciferase)表达质粒分别转染人卵巢癌细胞SKOV-3,稳定转染后,得到SKOV-3/NK4细胞和对照(SKOV-3/LUC)细胞。检测NK4在细胞... 目的在人卵巢癌细胞SKOV-3中转染NK4cDNA片段,研究NK4在裸鼠体内对人卵巢癌的治疗作用。方法 NK4和荧光霉素(luciferase)表达质粒分别转染人卵巢癌细胞SKOV-3,稳定转染后,得到SKOV-3/NK4细胞和对照(SKOV-3/LUC)细胞。检测NK4在细胞培养基中的表达情况以及经不同培养基(SKOV-3、SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4培养基上清)培养后SKOV-3细胞中c-Met和磷酸化-c-Met的表达,检测三组肿瘤细胞(SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4)体外生长速度,建立裸鼠卵巢癌腹水瘤模型,用Kaplan-Meier方法比较SKOV-3/LUC和SKOV-3/NK4细胞接种形成腹水瘤的裸鼠的累积生存率的差异。结果在SKOV-3/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞中无表达。磷酸化-c-Met在SKOV-3/NK4培养基培养的SKOV-3细胞中被抑制,而在对照(SKOV-3和SKOV-3/LUC)细胞培养基培养的SKOV-3细胞中正常表达。c-Met表达在各组差异无统计学意义。三种细胞体外生长曲线比较差异无统计学意义(P〉0.05)。腹腔内接种SKOV-3/LUC细胞的裸鼠,均产生腹腔内种植肿瘤伴腹水形成,于50 d内相继死亡,而接种SKOV-3/NK4细胞的裸鼠生存期均大于70 d,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论SKOV-3/NK4细胞在培养基中大量分泌NK4蛋白,NK4能抑制人卵巢癌细胞c-Met受体磷酸化。在裸鼠体内NK4通过抗血管生成作用抑制卵巢癌细胞腹腔内种植瘤的生长和腹水形成,提高累积生存率,改善预后。NK4可作为卵巢癌基因治疗的新方法。 展开更多
关键词 卵巢癌 NK4 基因治疗 累计生存率
NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用 预览
13
作者 沈蓉蓉 郑筱娇 +5 位作者 赵行 岑东 罗建平 吕建新 裴仁治 滑世轩 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期 42-45,共4页
目的探讨NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用及其机制。方法采用NK4基因重组质粒pVITRO2-NK4转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小。8周后获取瘤组织,分别采用免疫组化和脱氧核糖核酸末端... 目的探讨NK4基因转染对裸鼠人淋巴瘤移植瘤的抑制作用及其机制。方法采用NK4基因重组质粒pVITRO2-NK4转染的Raji细胞建立裸鼠皮下人淋巴瘤移植瘤模型,动态监测裸鼠体重和肿瘤大小。8周后获取瘤组织,分别采用免疫组化和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡和微血管密度(microvessel density,MVD),并进行相关分析。结果 NK4基因转染组裸鼠移植瘤体积明显小于对照组(P〈0.01),而对照组间差异无显著性(P〉0.05);各组间裸鼠体重降低,差异无显著性(P〈0.01)。NK4基因转染组的淋巴瘤细胞AI值达237±10.94,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组的AI值分别为79.7±30.8和81.7±22.2,NK4基因转染组明显高于对照组(P〈0.001),而对照组间差异无显著性(P〉0.05);NK4基因转染组MVD为4.7±1.52,而质粒pVITRO2转染组和未转染Raji组MVD分别为12.0±1.00和10.66±1.53,NK4基因转染组明显低于对照组(P〈0.001),而对照组间差异无显著性(P〉0.05)。结论 NK4基因转染可明显抑制裸鼠人淋巴瘤移植瘤的生长,其可能通过抑制肿瘤血管新生和促肿瘤细胞凋亡而发挥其效应。 展开更多
关键词 淋巴瘤 移植瘤 NK4 基因转染 裸鼠
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NK4基因转染对人宫颈癌细胞CaSki生物学特性的影响 预览
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作者 王晓黎 王冬冬 +1 位作者 赖亚新 林蓓 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期 38-41,共4页
目的通过在人宫颈癌细胞CaSki中转染NK4cDNA片段,研究NK4对人宫颈癌的潜在治疗作用。方法将NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人宫颈癌细胞CaSki。采用Westernblot检测细胞培养基中NK4蛋白以及经不同培养基(CaSki,CaSki/LUC及CaSki... 目的通过在人宫颈癌细胞CaSki中转染NK4cDNA片段,研究NK4对人宫颈癌的潜在治疗作用。方法将NK4和荧光霉素表达质粒分别稳定转染人宫颈癌细胞CaSki。采用Westernblot检测细胞培养基中NK4蛋白以及经不同培养基(CaSki,CaSki/LUC及CaSki/NK4培养上清)培养后CaSki细胞中c—Met和磷酸化c—Met的表达。采用MTT法绘制细胞生长曲线。采用细胞划痕实验检测NK4对细胞转移的作用。结果在CaSki/NK4培养基中有NK4蛋白表达,对照细胞(CaSki,CaSki/LUC)中无表达。磷酸化c—Met的表达在CaSki/NK4培养基培养的CaSki细胞中被抑制,而在对照细胞(CaSki,CaSki/LUC)培养基培养的CaSki细胞中正常表达。各组c—Met表达无差异。3种细胞体外生长曲线差异无统计学意义(P〉0.05)。细胞划痕实验结果表明,CaSki/NK4划痕区域的细胞个数明显少于CaSki和CaSki/LUC。结论NK4能抑制人宫颈癌细胞c—Met受体磷酸化.并能押制宫颈癌细胞体外活动能力。 展开更多
关键词 NK4 宫颈癌 基因治疗
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利用Gateway技术构建重组腺病毒pAd-NK4 预览 被引量:6
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作者 阙文忠 陈君敏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期 462-467,共6页
目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该... 目的利用Gateway技术构建含人肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体。方法以含有HGF/NK4基因的质粒为模板PCR扩增NK4基因,将回收的NK4PCR产物片段克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-6获得重组质粒pYr-adshuttle-6-NK4。从该重组质粒上,利用LR同源重组将NK4-IRES-EGPF表达框转移至腺病毒骨架质粒pAD/BL-DEST,获得重组腺病毒质粒pAd-NK4-IRES-EGFP。该质粒经pacI线性化后转染293包装细胞,获得重组腺病毒rAd-NK4-IRES-EGFP。采用TCID 50(tissue cell infectiousdosage 50,TCID 50)法测定重组腺病毒滴度。重组腺病毒分别经酶切和PCR等方法进行鉴定。荧光显微镜观察转染效果。结果证实腺病毒载体中含有NK4基因的目的片段;病毒滴度为6.3×1011 PFU.L-1;荧光显微镜发现该重组腺病毒能在HEK293细胞中高效的表达。结论利用Gateway技术可以快速地构建同时表达NK4蛋白和绿色荧光的重组腺病毒,为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。 展开更多
关键词 腺病毒 GATEWAY技术 人肝细胞生长因子 NK4 基因治疗 肿瘤
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HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒表达系统的构建与鉴定
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作者 黄桂填 肖焕擎 +3 位作者 曾山崎 徐波 蔡文松 李书华 《广州医学院学报》 2011年第2期102-105,111共5页
目的:构建靶向结肠癌细胞的人端粒酶逆转录酶HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定。方法:根据GenBank中的HTERT启动子(HTERTp)序列设计引物,以人胚肾293细胞提取基因组DNA为模板,PCR扩增HTERTp,并将HTERT... 目的:构建靶向结肠癌细胞的人端粒酶逆转录酶HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定。方法:根据GenBank中的HTERT启动子(HTERTp)序列设计引物,以人胚肾293细胞提取基因组DNA为模板,PCR扩增HTERTp,并将HTERTp序列克隆入pDC312质粒中,构建成HTERTp调控的腺病毒质粒pSG—HTERTp;NK4 cDNA酶切并回收克隆至pSG—HTERTp载体中,构建成pSG—HTERTp/pA—NK4穿梭质粒,脂质体法在293细胞中包装重组腺病毒;噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒;RT-PCR检测NK4基因的转录;Western Blot检测NK4蛋白的表达。结果:成功构建出成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,滴度为4.5×10^9空斑形成单位(pfu)/mL,且PCR扩增及western bolt电泳均呈阳性表达。结论:成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,为进一步研究NK4基因的作用机制打下实验基础。 展开更多
关键词 人端粒酶逆转录酶启动 NK4基因 腺病毒
NK4基因的克隆及其在Raji细胞中的表达 预览 被引量:4
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作者 滑世轩 岑东 +3 位作者 赵行 吕建新 涂植光 裴仁治 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期 970-975,共6页
目的:克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法:从人肝组织中提取总RNA,行RT—PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、EL... 目的:克隆NK4基因,构建其重组真核表达载体,并观察其在Raji细胞中的表达。方法:从人肝组织中提取总RNA,行RT—PCR获得NK4基因cDNA,与载体pVITRO2-mcs构建重组真核表达载体,转染Raji细胞。潮霉素B筛选后,采用实时荧光定量PCR、ELISA、细胞免疫组化和半固体培养等方法检测NK4基因在Raji细胞的表达,筛选稳定表达的细胞株。结果:NK4基因获成功克隆并构建了重组真核表达载体pVITRO2-mcs—NK4;转染NK4基因后的Raji细胞经RT—PCR发现存在特异性DNA片段。NK4基因在Raji细胞可稳定表达NK4mR—NA和蛋白,且可抑制Raji细胞的增殖、迁徙和侵袭。结论:NK4基因成功克隆并构建了重组真核表达载体,转染Raji细胞后表达稳定。 展开更多
关键词 基因 NK4 克隆 基因表达 RAJI细胞
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Biological effect of NK4 gene mediated by attenuated Salmonella typhimurium on hepatocellular carcinoma cell HepG2 预览
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作者 Xiaoqin Ha Ruifang Fan +4 位作者 Tongde Lv Yuebin Xu Ling Hui Xiaopeng Yang Qinhua Jia 《中德临床肿瘤学杂志:英文版》 CAS 2009年第12期 688-693,共6页
学习的目的是构造表示 NK4 基因的重新结合的稀释沙门氏菌 typhimurium 的稳定的紧张的目的,并且在 HepG2 房间的变形潜力上观察紧张的效果。NK4 cDNA 被 PCR 从 PCAGGS/hNK4 原生质标志孤立,并且代替的方法克隆进真核细胞的表示向量 ... 学习的目的是构造表示 NK4 基因的重新结合的稀释沙门氏菌 typhimurium 的稳定的紧张的目的,并且在 HepG2 房间的变形潜力上观察紧张的效果。NK4 cDNA 被 PCR 从 PCAGGS/hNK4 原生质标志孤立,并且代替的方法克隆进真核细胞的表示向量 pcDNA4。recombinant 原生质标志是转移电镀物品的进稀释沙门氏菌 typhimurium Ty21a 获得编码 NK4 基因(TPN ) 的 recombinant 紧张。同时,带 GFP 基因(TPG ) 的稀释沙门氏菌 typhimurium 也是的 recombinant 构造了。在 TPG 和 TPN 被变成 HepG2 房间以后, transfection 率和 NK4 蛋白质的表示水平被流动 cytometry 和 ELISA 检测,并且 HepG2 和 angiogenesis 的增长和迁居上的表示产品的效果被观察。结果 TPN 和 TPG 成功地被构造。在有 TPG 的 transfection 以后的 Fortyeight 小时,感染率是 82.58% ± 1.74% ,并且在上层清液的 NK4 蛋白质的表示水平是(181.5 ± 11.7 ) ng/6 × 10 个 <sup>5</sup> 房间。上层清液在 HepG2 细胞的 proliferative 活动有显然抑制的效果(P 【 0.05 ) ,并且能显然制止 hepatocyte 生长肿瘤细胞的调停因素的移植(P 【 0.01 ) 。肿瘤 angiopoiesis 上的表示产品的禁止的效果显然被观察(P 【 0.05 ) ,没有一种剂量效果关系。TPN 能有效地在 vitro 和快速的利息 NK4 蛋白质转移肿瘤房间的结论。表示产品能有效地禁止 hepatocellular 癌房间和肿瘤 angiopoiesis 的增长和迁居。 展开更多
关键词 鼠伤寒沙门氏菌 减毒沙门氏菌 HEPG2 肝癌细胞 介导 生物 基因
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共表达人B7—1和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定 预览 被引量:1
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作者 李敏雄 刘启才 +3 位作者 石慧 陈盛强 严小玲 陈德基 《现代临床医学生物工程学杂志》 2007年第2期 105-108,共4页
目的构建能同时表达B7—1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF/NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体... 目的构建能同时表达B7—1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF/NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd—NK4-B7—1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株。用RT-PCR检测感染细胞中B7-1和NK4基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrack—NK4-B7—1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF/NK4,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。制备的Ad—NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6d高水平的B7—1和NK4基因的表达,整体表达可持续2周。结论成功构建了同时表达B7.1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因,为进一步研究B7—1和NK4基因的功能及应用B7—1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材。 展开更多
关键词 腺病毒 B7—1基因 NK4基因 基因治疗
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Suppression of human colon tumor growth by adenoviral vector-mediated NK4 expression in an athymic mouse model 预览
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作者 Jian-Zheng Jie 《世界胃肠病学杂志:英文版(电子版)》 SCIE CAS CSCD 2007年第13期1938-1946,共9页
瞄准:调查 adenoviral 的镇压效果 NK4 的调停向量的表示, hepatocyte 生长因素(HGF ) 的一个对手,在在痴愚的人的结肠癌上,老鼠当模特儿探索把 NK4 用于癌症的可能性基因治疗。方法:一个人的结肠肿瘤模型被在痴愚的老鼠种的 LS17... 瞄准:调查 adenoviral 的镇压效果 NK4 的调停向量的表示, hepatocyte 生长因素(HGF ) 的一个对手,在在痴愚的人的结肠癌上,老鼠当模特儿探索把 NK4 用于癌症的可能性基因治疗。方法:一个人的结肠肿瘤模型被在痴愚的老鼠种的 LS174T 房间形成的肿瘤组织的下的培植开发。十五只忍受肿瘤的老鼠在 d 被使随机化进三个组( 5 在各个组织的 n =) 3 瘤内在肿瘤培植和老鼠以后被注射与缓冲磷酸盐saline ( PBS )或与为总数 5 注射在 6-d 间隔表示贝它牛乳糖( Ad-LacZ )或 NK4 ( rvAdCMV/NK4 )在里面的 recombinant 侵入人体气管粘膜的病菌每只老鼠。肿瘤尺寸在治疗期间被测量拉一条肿瘤生长曲线。在 d 26 在第一治疗以后,所有动物被牺牲,肿瘤组织化学地被移开到免疫检验增殖的房间原子抗原(PCNA ) ,微容器密度(由 CD31 代表了) ,并且 apoptotic 房间。在一个分开的实验, 15 只另外的痴愚的老鼠被采用由 LS174T 房间的腹膜内注射(ip ) 开发一个瘤转移模型。这些老鼠在 d 被使随机化进 3 个组(5 在各个组织的 n =) 1 在注射以后并且被 ip 对待 PBS 的注射,或 Ad-LacZ,或在为在每只老鼠的总数二注射的 6-d 间隔的 rvAdCMV/NK4。所有动物在 d 被牺牲 14 并且在腹的洞以内的传播肿瘤的数字和重量被测量。结果:人的冒号肿瘤的生长显著地在与 rvAdCMV/NK4 对待的痴愚的老鼠被压制(2537.4 +/- 892.3 mm3 ) 与任何一个 PBS 对待的那些相比(5175.2 +/- 1228.6 mm3 ) 或 Ad-LacZ (5578.8 +/- 1955.7 mm3 )(P 【 0.05 ) 。肿瘤生长抑制率象 51% 一样高。染色的 Immunohistochemical 揭示了在所有组把索引(11.2%在 PBS 组织的75.1%+/-对9.4%在 rvAdCMV/NK4 组织的69.3%+/-)标记的类似的 PCNA ,但是显著地降低微容器密度( 2.4 在 rvAdCMV/NK4 组织的 10.7 +/-或 3.5 在 Ad-LacZ 组织的 21.3 +/-, P 【 0.05 ),并且显著地更高的 apoptotic 索引(2.4%在 rvAdCMV/ 展开更多
关键词 结肠肿瘤 肿瘤生长抑制 腺病毒载体 介导 NK4表达 鼠模型
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