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羊IL-2和OrfV-F1L基因疫苗联合免疫小鼠的免疫应答研究
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作者 李婷 包细明 +7 位作者 鲜思美 张益 饶体宇 吴伯梅 张友 刘嫒 李鹏飞 闵德省 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期924-931,共8页
为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(I... 为评价pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答,分别将pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L、pVAX1空载体、PBS对照组通过后腿肌肉注射的方式免疫KM系小鼠,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ和TNF-α)、Th2型(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平均显著高于pVAX1-F1L组,与pVAX1组、PBS组相比差异极显著(P<0.01);pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6和IL-10细胞因子水平均显著高于pVAX1组和PBS组,与pVAX1-F1L组相比差异不显著(P>0.05);且pVAX1-F1L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-F1L组、pVAX1组和PBS组(P<0.01)。结果表明,pVAX1-IL-2和pVAX1-F1L联合免疫小鼠,能诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫,pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能促进Th1型细胞因子的分泌。 展开更多
关键词 IL-2 OrfV F1L基因 核酸疫苗 免疫应答
羊口疮病毒B2L基因密码子偏好性分析 预览
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作者 张静 陈翠英 +1 位作者 李静静 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2019年第8期100-103,共4页
B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的主要囊膜蛋白,为重要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对B2L基因运用Visual Gene Developer生物信息学软件,分析其在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性,... B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的主要囊膜蛋白,为重要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对B2L基因运用Visual Gene Developer生物信息学软件,分析其在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性,从而选择一个最适表达系统,以增加B2L蛋白的表达量。分析表明,B2L基因在昆虫杆状病毒表达系统中会得到更好的表达,这为B2L基因表达系统的选择提供了参考。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 密码子 外源表达 偏好性
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口疮病毒ORFV125蛋白抑制宿主细胞凋亡的研究
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作者 彭建伟 田宏 +2 位作者 杨学财 蔡葵蒸 郑海学 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期717-721,共5页
分析显示,口疮病毒(ORFV)125蛋白的3D结构及其结构域与Bcl-2家族蛋白高度相似。为了探索ORFV125蛋白是否具有Bcl-2蛋白的抑制细胞凋亡作用,本研究通过构建ORFV125基因单个结构域突变体质粒BH1、BH2、BH3、BH4和缺失BH1、BH2、BH3、BH... 分析显示,口疮病毒(ORFV)125蛋白的3D结构及其结构域与Bcl-2家族蛋白高度相似。为了探索ORFV125蛋白是否具有Bcl-2蛋白的抑制细胞凋亡作用,本研究通过构建ORFV125基因单个结构域突变体质粒BH1、BH2、BH3、BH4和缺失BH1、BH2、BH3、BH4结构域的突变体质粒,分别将不同质粒分别转染到293T细胞后培养24 h和72 h时通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用。结果,在转染质粒的细胞培养到第24小时的细胞早期凋亡率低于5%,细胞晚期凋亡率低于6%;在转染质粒的细胞培养到第72小时的细胞早期凋亡率高于20%,细胞晚期凋亡率低于4%;而在同一时间点比较,各个的突变体之间的凋亡效果没有显著性差异。以上结果表明,ORFV125蛋白及其突变体具有抑制凋亡的作用,但随着凋亡时间的持续凋亡效果更加明显,这为进一步开展ORFV125蛋白的研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 绵羊 山羊 口疮病毒 ORFV125蛋白 突变体 细胞凋亡
电子显微镜技术在羊口疮病毒研究中的应用进展 预览
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作者 陈元翠 张益 +3 位作者 鲜思美 李鹏飞 钱林 张友 《贵州畜牧兽医》 2018年第2期32-37,共6页
电子显微镜技术是一种可以用来观察病毒粒子形态、大小、结构等特征的技术。通过直接从感染组织、分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查观察病毒粒子,根据病毒粒子的结构特征判断病原体,从而作出诊断,此外还... 电子显微镜技术是一种可以用来观察病毒粒子形态、大小、结构等特征的技术。通过直接从感染组织、分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查观察病毒粒子,根据病毒粒子的结构特征判断病原体,从而作出诊断,此外还可以观察病毒感染细胞的动态过程(形态发生过程)。羊口疮病毒属于痘病毒科、副痘病毒属的成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,病毒粒子呈砖形或椭圆形的线团样,病毒粒子表面呈特征性的管状条索斜形交叉,呈编织样外观。文章就电子显微镜的特点及使用电子显微镜观察羊口疮病毒的研究进展进行综述。 展开更多
关键词 电子显微镜 羊口疮病毒 研究进展
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羊口疮024基因的表达、多抗制备及亚细胞定位
5
作者 苏莉 俞赵荣 +7 位作者 杨侃侃 王元红 钟灵毓 崔佣楸 张高峰 张谦 王勇 李永东 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2018年第10期1117-1121,共5页
目的克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以... 目的克隆表达羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)024基因,制备多克隆抗体,检测其免疫原性,并对其进行亚细胞定位分析。方法根据GenBank中羊口疮病毒024基因序列设计引物,进行PCR扩增。将其亚克隆至表达载体,构建原核重组质粒pGEX-6P-1-024以及真核重组质粒pEGFP-N1-024。将原核重组质粒转化Rosetta (DE3)细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定024蛋白的表达情况。纯化后的024蛋白免疫BALB/c雌鼠,获得血清并制备多克隆抗体,进行Western-blot分析。将构建的真核质粒转染MDBK细胞,24h后通过免疫荧光观察其在细胞中的表达及亚细胞定位。结果 SDS-PAGE结果表明,羊口疮病毒024基因在Rosetta (DE3)细胞中正确表达,大小为59kDa。Western-blot结果表明024蛋白能与制备的多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。荧光显微镜下结果表明024蛋白转染MDBK细胞后主要在细胞质中表达。结论本实验为后续深入研究ORFV 024基因功能和致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 024基因 表达 多克隆抗体 亚细胞定位
羊口疮病毒强毒株与传90代毒株毒力相关基因的序列比较 预览 被引量:1
6
作者 张静 仲亮 +4 位作者 李智 李秀男 范峻豪 刘春羽 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2018年第7期95-100,共6页
为比较羊口疮病毒(ORFV)强弱毒株毒力相关基因序列,将分离自山东省某发病羊场的强毒株ORFV/QD/2015,在山羊皮肤成纤维细胞上连续传90代,然后将ORFV/QD/2015强毒株和传90代后毒株的质粒测序结果与已经公布的9组ORFV全基因序列中的ORF02... 为比较羊口疮病毒(ORFV)强弱毒株毒力相关基因序列,将分离自山东省某发病羊场的强毒株ORFV/QD/2015,在山羊皮肤成纤维细胞上连续传90代,然后将ORFV/QD/2015强毒株和传90代后毒株的质粒测序结果与已经公布的9组ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因进行比对。结果显示:ORFV/QD/2015强毒株与公布毒株毒力相关基因的同源性高,而传90代毒株与其同源性有所降低。将强毒株与传90代毒株4组毒力相关基因的核苷酸进行比对,发现其基因编码氨基酸均发生了多处变异,其中ORF020发生了7处,ORF112发生了52处,ORF117发生了14处,ORF127发生了15处。比对后发现,核苷酸与编码氨基酸变异最多的为ORF112基因,最少的为ORF020基因。两毒株间的抗原指数也有明显变异。研究认为,ORFV毒力相关基因的变异可能与其毒力有很大联系,这个变化可能与传代过程中基因发生多处变异有关,也可能是这些毒力基因共同作用的结果。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 毒力相关基因 序列比对
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羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达 预览
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作者 张静 范峻豪 +3 位作者 刘春羽 赵一 温永俊 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2018年第10期95-98,共4页
B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His... B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的结构蛋白,也是病毒的保护性抗原,可以刺激机体产生强烈的抗病毒反应。为表达出高可溶性的B2L蛋白并检测其免疫原性,将羊口疮病毒B2L基因进行密码子偏爱性优化设计,并截取抗原性高、疏水性好的区域,构建了His-tag融合可溶性标签的表达重组载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的His融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTAagarose亲和纯化后,进行Western-blot验证。结果显示,经过SDS-PAGE和Western-blot鉴定的目的条带分子质量与预期大小相符。本试验成功在上清中表达和纯化出B2L基因编码蛋白。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 截短表达 密码子优化
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羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立
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作者 王海峰 张七斤 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1282-1286,1306共6页
羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFV VIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的... 羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFV VIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的检测,并进行了后续的临床检测。结果显示,利用优化的LAMP染色法,将呈现绿色的阳性组与橙色的阴性组区分开。对扩增的质粒和阳性对照样品的检测呈现出了阳性条带,而对山羊痘、绵羊痘、牛传染性鼻气管炎和牛副流感3型病毒的检测并无阳性条带。优化的LAMP检测ORFV的灵敏度比传统PCR高出1000倍。对15份临床样品检测的结果表明,优化的LAMP电泳和染色法对ORFV的检出率均为100%,与传统PCR检测结果相一致。上述结果表明优化的LAMP对ORFV的检测具有特异性、高灵敏性且更加方便等优点,从而更适用于现场的高效检测。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 环介导等温扩增技术 临床检测
口疮病毒112基因的原核表达及生物信息学分析
9
作者 冯倩 吴锦艳 +6 位作者 王光祥 陈妍 杜国玉 李玲霞 尚佑军 张志东 刘湘涛 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第7期811-817,共7页
为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a(+)-ORFV 112,... 为了确证口疮病毒112基因的免疫学特性,本研究参考Gen Bank载录的口疮病毒NZ2株112基因序列设计1对特异性引物,通过PCR扩增口疮病毒112全基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)中,将测序正确的重组质粒命名为p ET-28a(+)-ORFV 112,并转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导重组ORFV 112蛋白表达,并分别进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定,并运用生物信息学软件对口疮病毒112蛋白的性质和结构进行预测分析。结果表明,ORFV 112基因的大小约为861 bp;通过重组表达的融合蛋白大小约为40 ku;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应原性。预测分析表明,ORFV 112蛋白分子式为C1357H2155N367O451S11,理论等电点(PI)为4.68,消光系数为23 295,脂肪指数为81.78,总平均疏水性(GRAVY)为-0.383,其二级结构主要以α-螺旋(29.37%)和无规则卷曲(40.56%)构成。本研究为深入研究口疮病毒112蛋白结构与功能及该蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 口疮病毒 ORFV 112基因 原核表达 生物信息学分析
羊口疮病毒上海流行株的分离鉴定及其保护性抗原基因遗传进化分析 被引量:1
10
作者 陈晓 李丽 +6 位作者 葛雷 李垚 戴建军 王书全 张树山 吴彩凤 张德福 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期655-661,共7页
为了解上海地区羊口疮病毒(ORFV)流行毒株的分子生物学特性与遗传变异情况,采集疑似0RFV感染的羔羊唇部结痂组织,应用PCR、MDBK细胞分离培养、电子显微镜观察、间接免疫荧光技术等方法,进行分离鉴定,并对这2个分离毒株保护性抗原... 为了解上海地区羊口疮病毒(ORFV)流行毒株的分子生物学特性与遗传变异情况,采集疑似0RFV感染的羔羊唇部结痂组织,应用PCR、MDBK细胞分离培养、电子显微镜观察、间接免疫荧光技术等方法,进行分离鉴定,并对这2个分离毒株保护性抗原基因F1L、B2L进行克隆与序列分析。结果表明,成功分离到2株ORFV,将其分别命名为ORFuF416、ORFV-F429。其中,2株分离株F1L基因与参考毒株核苷酸序列同源性分别为95.2%~99.4%,推导氨基酸序列与参考毒株氨基酸序列同源性分别为94.4%~99.4%,遗传进化树分析均显示2株均属于同一分支,且与福建株FJ—YX(KC568410)亲缘关系最近。但与相关参考毒株相比,分离株FIL基因编码的氨基酸在44~66位不存在核苷酸的缺失,表明上海流行株与FJ—YX株存在一定的变异。2株分离株B2L基因与参考毒株核苷酸序列同源性为96.7%~99.6%,氨基酸序列同源性为94.7%~98.9%,且在遗传进化树上均与广西株GX—YB(JQ904793)有较近的亲缘关系,但与中国疫苗株(JQ904789)亲缘关系较远。表明从上海地区分离得到的2个毒株与流行于中国南方地区的0RFV毒株有较近的亲缘关系,但分离株的FIL基因和B2L基因存在一定变异。 展开更多
关键词 ORFV 分离鉴定 F1L基因 B2L基因 进化分析
羊IL-2基因和羊口疮病毒B2L基因真核表达重组质粒联合免疫小鼠的效果评价 预览 被引量:1
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作者 鲜思美 李鹏飞 +5 位作者 冯将 刘嫒 李婷 包细明 张益 张素辉 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第8期663-667,共5页
为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免... 为评价羊白介素2(IL-2)基因和羊口疮病毒(OrfV)B2L基因真核表达重组质粒联合接种小鼠的免疫效果,本研究将pVAX1-B2L、pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2及空载体pVAX1和PBS对照组通过肌肉注射的方式免疫KM小鼠,并采用ELISA方法和MTT方法检测免疫小鼠的体液和细胞免疫反应。结果表明,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体效价和IL-2水平均显著高于pVAX1-B2L免疫组,与pVAX1和PBS对照组相比差异极显著(p〈0.01)。而且pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2免疫组的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L免疫组、空载体pVAX1组和PBS对照组(p〈0.01)。因此,pVAX1-B2L+pVAX1-IL-2联合免疫KM小鼠可以诱导特异性体液免疫和细胞免疫,并且IL-2具有免疫佐剂的作用,为进一步将其用于Orf的防制奠定了基础。 展开更多
关键词 OrfV B2L基因 IL-2 基因疫苗 联合免疫
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表达羊口疮病毒B2L基因重组腺病毒的构建及鉴定 预览 被引量:3
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作者 王勇 杨侃侃 +8 位作者 王元红 俞赵荣 潘飞 崔佣楸 苏莉 钟灵毓 徐前明 蒋书东 李永东 《扬州大学学报:农业与生命科学版》 北大核心 2017年第3期6-10,共5页
为构建表达羊口疮病毒(ORFV)B2L基因的重组腺病毒,提取实验室保存的ORFV AH-F10临床分离株的病毒核酸,PCR扩增B2L基因,将其克隆至穿梭载体中,再将重组穿梭质粒pHBAd-ORFV-B2L与骨架载体质粒pHBAdBHGloxΔE1利用脂质体共转染HEK293细胞... 为构建表达羊口疮病毒(ORFV)B2L基因的重组腺病毒,提取实验室保存的ORFV AH-F10临床分离株的病毒核酸,PCR扩增B2L基因,将其克隆至穿梭载体中,再将重组穿梭质粒pHBAd-ORFV-B2L与骨架载体质粒pHBAdBHGloxΔE1利用脂质体共转染HEK293细胞,转染后48h收获包装成功的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L,对rAdORFV-B2L进行病毒滴度测定及遗传稳定性鉴定。结果表明:构建获得的重组腺病毒rAd-ORFV-B2L病毒滴度达到107.9 TCID50·μL~(-1)。Western-blot检测结果表明rAd-ORFV-B2L在体外能够表达B2L蛋白,且能够与ORFV多抗血清发生特异性反应。RT-PCR检测结果表明,连续传代的rAd-ORFV-B2L能够稳定表达外源蛋白B2L。该研究为后续腺病毒疫苗的动物保护试验奠定基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 重组腺病毒 构建 鉴定
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羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及鉴定 预览 被引量:2
13
作者 李智 仲亮 +3 位作者 白银荣 代兄 应海刚 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2017年第9期102-106,共5页
[目的]获取羊口疮病毒B2L基因编码蛋白。[方法]根据GenBank上羊口疮病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增B2L全基因序列,然后将扩增的B2L基因克隆到PMD18-T载体上;对构建的重组克隆质... [目的]获取羊口疮病毒B2L基因编码蛋白。[方法]根据GenBank上羊口疮病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增B2L全基因序列,然后将扩增的B2L基因克隆到PMD18-T载体上;对构建的重组克隆质粒(PMD18-T-B2L)经过测序鉴定后,将目的基因亚克隆到PET-32a(+)原核表达载体上,获得重组表达质粒PET-32a-B2L,然后通过双酶切和测序进行鉴定;将重组菌于37℃、终浓度含1mMIPTG的LB培养基中,诱导表达3h后进行SDS-PAGE分析;表达的目的蛋白经过层析纯化后,进行WesternBlot鉴定。[结果]原核表达重组质粒构建成功;SDS-PAGE鉴定发现目的条带的分子量与预期大小相符;纯化的目的蛋白经WesternBlot鉴定正确,表明蛋白表达成功。[结论]本研究成功构建了羊口疮病毒B2L基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了B2L蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立打下了基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 原核表达
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羊口疮病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息学分析 预览 被引量:1
14
作者 李智 仲亮 +5 位作者 张静 刘春羽 范俊豪 王海峰 牛云雷 张七斤 《中国动物检疫》 CAS 2017年第3期91-96,共6页
为分析羊口疮病毒(ORFV/QD/2015株)B2L基因的分子特征,预测其编码蛋白的生物学功能,对其B2L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学相关软件及方法,对扩增所得的基因进行序列分析,并对其编码蛋白的二级结构、细胞抗原表位、... 为分析羊口疮病毒(ORFV/QD/2015株)B2L基因的分子特征,预测其编码蛋白的生物学功能,对其B2L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学相关软件及方法,对扩增所得的基因进行序列分析,并对其编码蛋白的二级结构、细胞抗原表位、三级结构、跨膜结构域和信号肽等进行预测和分析。结果显示:ORFV/QD/2015株B2L基因序列长1 137 bp,编码379个氨基酸;该毒株与其他12株羊口疮病毒参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,氨基酸序列同源性为96.8%~99.2%。系统进化分析显示,ORFV/QD/2015株与2015年分离到的ORFV/Shaan Xi/2015/China株亲缘关系最近;B2L基因编码蛋白二级结构以α-螺旋区域和β-折叠区域所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个细胞优势抗原表位,无跨膜区域,无信号肽区域;三级结构呈弯曲状螺旋结构。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 生物信息学分析 蛋白结构预测
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免疫共沉淀联合质谱技术筛选宿主因子CypB的互作蛋白
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作者 张頔 赵魁 +5 位作者 周艳龙 赵宇航 钟嘉伟 崔珊珊 高丰 宋德光 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期905-908,共4页
为探讨亲环蛋白B(cyclophilin B,CypB)促进羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)复制增殖的机制,以ORFV早期感染MDBK细胞为试验材料,利用免疫共沉淀技术筛选与CypB互作的蛋白。免疫共沉淀产物的Western blot和SDS-PAGE的分析结果显示,... 为探讨亲环蛋白B(cyclophilin B,CypB)促进羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)复制增殖的机制,以ORFV早期感染MDBK细胞为试验材料,利用免疫共沉淀技术筛选与CypB互作的蛋白。免疫共沉淀产物的Western blot和SDS-PAGE的分析结果显示,在大小约为25 000处可见有明显的差异条带。切下该差异蛋白条带进行质谱鉴定分析,将获得的原始质谱数据使用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能(MS/MS Ions Search)进行搜索鉴定,初步筛选获得6个可能与CypB相互作用的病毒相关蛋白。为进一步深入研究CypB在ORFV早期侵染过程中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 羊传染性脓疱病毒 CypB 免疫共沉淀 质谱分析 互作蛋白
口疮病毒020基因的克隆、表达及多抗制备 被引量:2
16
作者 王勇 赵玉洁 +8 位作者 杨侃侃 殷冬冬 白彩霞 潘飞 梅跃辉 颜秀梅 王君 徐前明 蒋书东 《安徽农业大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期780-783,共4页
羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据GenBank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至pET-... 羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据GenBank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 kDa。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 020基因 克隆 原核表达 多克隆抗体
安徽地区羊口疮病毒VIR基因PCR检测及遗传进化分析 预览 被引量:1
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作者 侯宏艳 惠文巧 +2 位作者 张丹俊 赵瑞宏 胡晓苗 《中国草食动物科学》 CAS 2017年第1期4-6,共3页
采集安徽某地区两个山羊场中疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,采用PCR方法对毒力基因VIR进行了扩增,并获得了目的片段VIR-1和VIR-2。同时将PCR产物克隆至p MD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明,两个羊场的毒力基因VIR-1和VIR-2基... 采集安徽某地区两个山羊场中疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,采用PCR方法对毒力基因VIR进行了扩增,并获得了目的片段VIR-1和VIR-2。同时将PCR产物克隆至p MD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明,两个羊场的毒力基因VIR-1和VIR-2基因片段与参考毒株的相关基因核苷酸同源性分别为95.8%~100%和95.4%~99.6%。基因进化树比较显示,两分离株分别与美国AY424975.1株和甘肃KF916586.1株的亲缘关系最近。 展开更多
关键词 安徽 羊口疮病毒 VIR基因 遗传进化分析
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羊口疮病毒内蒙株的生物学特性 被引量:5
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作者 涂明亮 安维雪 +3 位作者 张志丹 李娜 庞方圆 张七斤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第8期1349-1353,共5页
为增强羊口疮病毒(ORFV)的基础理论研究及羊口疮的防控等工作,本研究通过将毒株接种羊睾丸细胞进行增殖培养、病毒粒子的形态学观察、超薄切片观察、动物回归、B2L和VIR基因序列的测定与分析等试验,对待检毒株(内蒙古分离株ORFV/n... 为增强羊口疮病毒(ORFV)的基础理论研究及羊口疮的防控等工作,本研究通过将毒株接种羊睾丸细胞进行增殖培养、病毒粒子的形态学观察、超薄切片观察、动物回归、B2L和VIR基因序列的测定与分析等试验,对待检毒株(内蒙古分离株ORFV/nm-w)进行了病毒学和分子生物学的特性研究。结果表明,本分离株能够引起羊睾丸细胞产生明显病变,病变开始出现和出现80%CPE的时间分别为接种后24和72h,病毒滴度TCID 50为10-6。5。病毒粒子为椭圆形,在细胞质内增殖,接种毒株的羊只出现典型的CE症状。扩增后的产物经序列分析表明,ORFV/nm-w分离株的B2L基因和VIR基因与GenBank已发布毒株的该序列之间核苷酸同源性分别为96.7%~98.8%,96.2~99.3%,且该分离株与中国陕西株和新疆株同源关系最近。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 ORFV/nm-W分离株 动物回归试验 生物学特征
羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析 预览 被引量:1
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作者 石正旺 刘华南 +1 位作者 胡永浩 郑海学 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1-5,10共6页
【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片... 【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性. 展开更多
关键词 羊口疮病毒 B2L基因 原核表达 纯化 反应原性分析
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羊口疮病毒ORF059基因的真核表达研究 预览 被引量:1
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作者 朱姝 庞峰 +7 位作者 李国华 李亚颖 彭冬梅 杨小健 聂鑫 曹瑞勇 王凤阳 杜丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第9期2291-2295,共5页
试验旨在扩增羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒... 试验旨在扩增羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,测序正确后瞬时转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果表明,ORF059基因片段大小为1 005bp;重组质粒pEGFP-ORF059-N1构建正确;转染pEGFP-ORF059-N1的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光;表达的融合蛋白大小约为64ku。本试验结果为进一步研究ORF059的作用机理奠定了基础。 展开更多
关键词 羊口疮病毒 ORF059基因 真核表达 NIH3T3细胞
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