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塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡 预览
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作者 王咏 毛箬青 +2 位作者 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期811-820,共10页
塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过A... 塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过AnnexinV-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,AnnexinV-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Westernblotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A PK-15细胞 细胞凋亡 流式细胞
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猪圆环病毒2型感染PK-15细胞差异表达miRNA和mRNA互作网络 预览
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作者 李畅 李静 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期115-125,共11页
旨在筛选猪圆环病毒2型感染猪肾上皮细胞(PK-15)后差异表达miRNA和mRNA,并探究miRNA和mRNA之间的互作关系。使用茎环定量PCR检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组之间的差异表达水平以发现差异表达miRNA,分析PCV2感染后第12小... 旨在筛选猪圆环病毒2型感染猪肾上皮细胞(PK-15)后差异表达miRNA和mRNA,并探究miRNA和mRNA之间的互作关系。使用茎环定量PCR检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组之间的差异表达水平以发现差异表达miRNA,分析PCV2感染后第12小时的蛋白质组学研究结果(GEO登录号:GSE71945)以获得差异表达mRNA,并分析差异表达miRNA和mRNA之间的互相作用关系。结果显示,在PCV2感染后第12小时miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p等表达量显著性变化,使用miRecords预测其靶基因,分别发现7105、9741、7451、7183、7971、8793个靶基因;PCV2感染后第12小时共有158个差异表达mRNA,分属于多种细胞结构成分并参与多条重要的细胞生物途径,且差异miRNA的靶基因和差异mRNA之间有大量的交集基因。上述结果表明,PCV2感染能导致细胞内多种miRNA差异表达,造成miRNA的靶基因表达紊乱,进而影响细胞正常的生命进程。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 PK-15细胞 MIRNA MRNA 互作关系
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猪波形蛋白的原核表达及其对口蹄疫病毒浸染PK-15细胞的作用 预览
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作者 令瑛 马雪青 +7 位作者 李平花 张婧 李坤 付元芳 冯若飞 马忠仁 卢曾军 刘在新 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期12-19,共8页
为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行... 为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪波形蛋白 原核表达 口蹄疫病毒 PK-15细胞
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镉通过引发氧化应激和线粒体损伤诱导PK-15细胞凋亡 被引量:4
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作者 董峰 杨佳 +3 位作者 李向阳 吴琼 张少英 王兰 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第11期1185-1193,共9页
镉(cadmium,Cd)是一种生物累积性的有毒重金属元素,能够在肾组织大量蓄积并引起肾发生病变和功能损伤。前期研究证实,Cd处理能够引起猪肾PK-15细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高和细胞死亡,但详细机制有待进一步... 镉(cadmium,Cd)是一种生物累积性的有毒重金属元素,能够在肾组织大量蓄积并引起肾发生病变和功能损伤。前期研究证实,Cd处理能够引起猪肾PK-15细胞的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高和细胞死亡,但详细机制有待进一步研究。本研究以PK-15细胞为研究对象,通过CCK-8检测、透射电镜观察、DCFH-DA标记、JC-1染色、彗星实验和流式细胞术等研究手段,分别检测Cd处理后的细胞活性、形态变化、ROS生成、线粒体膜电位Δψm、DNA损伤及细胞凋亡情况。CCK-8实验结果显示,CdCl2处理后PK-15细胞活性下降,且呈时间和剂量依赖性;形态学观察发现,CdCl2处理引起PK-15细胞皱缩、变圆,细胞核固缩、染色质凝聚,线粒体肿胀、线粒体嵴减少或消失;荧光染色和流式细胞术检测结果显示,CdCl2处理引起PK-15细胞内ROS水平升高、线粒体膜电位Δψm下降和DNA损伤,最终导致细胞凋亡。Western印迹结果显示,CdCl2处理组中促凋亡蛋白质Bax表达量上调,抑凋亡蛋白质Bcl-2表达量下调,并且CdCl2处理组检测到了活化状态的裂解胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)。此外,ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(Nacetyl-L-cysteine,NAC)缓解了CdCl2引起的线粒体损伤、DNA损伤和细胞凋亡。综上所述,Cd通过引发氧化应激和线粒体损伤诱导PK-15细胞凋亡。 展开更多
关键词 PK-15细胞 活性氧 线粒体膜电位 细胞凋亡
猪细小病毒致PK-15细胞病变的荧光显微镜和电镜观察 预览
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作者 方振华 沈振国 孙倩 《现代畜牧科技》 2017年第7期1-2,4共3页
利用荧光显微镜、扫描和透射电镜对猪细小病毒病(PPV)感染的PK-15细胞进行形态结构观察。结果显示,PPV能诱导猪肾(PK-15)细胞发生典型病变,病变程度随感染时间而加剧。被感染的细胞皱缩、变圆,细胞核浓染、碎裂;超微结构表现为细胞... 利用荧光显微镜、扫描和透射电镜对猪细小病毒病(PPV)感染的PK-15细胞进行形态结构观察。结果显示,PPV能诱导猪肾(PK-15)细胞发生典型病变,病变程度随感染时间而加剧。被感染的细胞皱缩、变圆,细胞核浓染、碎裂;超微结构表现为细胞微绒毛消失,有较多的球状突起;粗面内质网严重扩张,线粒体嵴肿胀、模糊不清,核染色质固缩并边集于核膜,在胞核和胞浆内有较多子代病毒聚集;感染的后期出现了细胞膜凹陷包裹胞质成分的凋亡小体,胞浆中细胞器空泡化严重,细胞核碎裂。本研究从细胞水平上了解PPV的致病过程,为其致病机理的研究奠定理论基础。 展开更多
关键词 猪细小病毒 PK-15细胞 细胞病变 超微结构
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猪细小病毒感染PK-15细胞后TLRs转录时相的变化 预览 被引量:1
6
作者 周雍 靳晓慧 +4 位作者 李炳晓 景亚星 韩丽 张利卫 魏战勇 《河南农业大学学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期201-206,共6页
研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达水平变化情况,为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转... 研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达水平变化情况,为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转录时相变化。结果显示,PPV感染PK-15细胞后,TLR1在PPV感染后3h表达上调,约为对照组细胞的3.1倍,其他时段均低于正常水平;TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平;TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表达上调,TLR10分别在在3h和36 h表达上调,其他时段均不同程度的降低;而TLR2和TLR9 mRNA表达水平在感染后24 h开始升高,并于48 h达到峰值,分别为对照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9在mRNA水平显著上调,PPV感染可能通过TLR2和TLR9受体介导感染。 展开更多
关键词 猪细小病毒 TOLL样受体 PK-15细胞 转录时相
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PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究 预览 被引量:1
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作者 华涛 冯磊 +7 位作者 张雪花 唐波 常晨 刘国阳 吴培培 陈丽 张道华 侯继波 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第2期474-480,共7页
为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×10^5 ce... 为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×10^5 cells/mL的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1L反应器放大至3L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3d细胞密度可达34.3×10^5 cells/mL。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PcV2增殖效价10^7.25TCID50/mL。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 PK-15细胞 微载体 消化放大 猪圆环病毒2型 悬浮培养
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篮式反应器发酵PCV过程中连续收获病毒的可行性研究 预览
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作者 赵立民 《兽医导刊》 2017年第4期211-211,215共2页
应用NBS篮式细胞反应器高密度培养PK-15细胞,接种PCV病毒后,采取边补加维持液边收获病毒液的方式,最终收获相当于反应器约3倍体积的高滴度病毒抗原,生产效率明显提升,证明该工艺具备可行性。
关键词 反应器 片状载体 PK-15细胞 PCV 连续收毒
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猪圆环病毒2型疫苗对母猪繁殖性能及其胎儿感染的影响 预览
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作者 黎先伟 D. M. Madson 《兽医导刊》 2017年第7期55-56,共2页
猪圆环病毒2型(PCV2)为圆环病毒科圆环病毒属成员,由Tischer于1974年首先在PK-15细胞中发现。该病毒粒子含有单股负链环状DNA,相对分子量5.8×102,无囊膜,不具有血凝活性,基因组全长大约为1.7kb。PCV2有3个公认的基因型,分... 猪圆环病毒2型(PCV2)为圆环病毒科圆环病毒属成员,由Tischer于1974年首先在PK-15细胞中发现。该病毒粒子含有单股负链环状DNA,相对分子量5.8×102,无囊膜,不具有血凝活性,基因组全长大约为1.7kb。PCV2有3个公认的基因型,分别是PCV2a、PCV2b和PCV2c。猪圆环病毒感染的临床表现多种多样,包括肺炎、腹泻、消瘦和母猪繁殖障碍。猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)主要用来描述与PCV2感染有关的多系统的临床疾病。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪圆环病毒感染 母猪繁殖障碍 繁殖性能 PK-15细胞 胎儿 疫苗 PCV2
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病毒组织细胞培养方法及注意事项 预览
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作者 靳芹 《中国动物保健》 2016年第4期63-64,共2页
细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。本文以猪乙型脑炎病毒在猪肾上皮细胞(PK-15细胞)增殖培养为例,介绍一下病毒的细胞培养方法,和一些注意事项。
关键词 细胞培养 PK-15细胞
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猪伪狂犬病毒感染PK15细胞对细胞凋亡及相关凋亡因子的影响 被引量:3
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作者 肖熹玉 邱先帅 +3 位作者 张浩 任常宝 黄红亮 唐兆新 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期553-557,共5页
为研究PRV感染PK-15细胞对其细胞凋亡及相关凋亡因子的影响,本试验采用体外细胞培养技术在不同时间点收集细胞、应用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性、流式细胞仪测定细胞凋亡率、实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因caspase-3,Bcl-2,... 为研究PRV感染PK-15细胞对其细胞凋亡及相关凋亡因子的影响,本试验采用体外细胞培养技术在不同时间点收集细胞、应用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性、流式细胞仪测定细胞凋亡率、实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因caspase-3,Bcl-2,Bax和Bcl-xl的表达情况。结果显示,PRV感染24 h后可明显抑制细胞的增殖,这种抑制与时间密切相关,与感染剂量无显著差异。流式细胞仪检测也显示PRV能明显提高其凋亡率,PT-PCR显示PRV感染后caspase-3,Bax表达量明显上调,Bcl-xl,Bcl-2表达量明显下调。结果表明,PRV在感染过程中对细胞的生长的影响与时间紧密联系,能够诱发细胞凋亡,Bax,Bcl-2,Bcl-xl,caspase-3,起着重要的调控作用。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 PK-15细胞 MTT 细胞凋亡
山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定 预览 被引量:3
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作者 朱玲云 张正学 +6 位作者 郑龙龙 刘萍丹 毕峻龙 赵谦 刘佳 杨贵树 尹革芬 《动物医学进展》 北大核心 2016年第12期113-117,共5页
为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后... 为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRVgD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp-837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 PCR鉴定 PK-15细胞 基因分析 山羊
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三种益生菌菌株与PK-15细胞共培养抗TGEV作用 预览
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作者 魏萍 刘文娜 王辉辉 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期60-67,共8页
为模拟猪肠道内环境,探究益生菌与细胞共培养抗TGEV作用,利用Transwell小室在体外建立益生菌与PK-15细胞共培养,通过台盼蓝染色,检测PK-15细胞存活率。结果表明,当益生菌菌体浓度102 cfu·mL-1≤c≤1012 cfu·mL-1,共培... 为模拟猪肠道内环境,探究益生菌与细胞共培养抗TGEV作用,利用Transwell小室在体外建立益生菌与PK-15细胞共培养,通过台盼蓝染色,检测PK-15细胞存活率。结果表明,当益生菌菌体浓度102 cfu·mL-1≤c≤1012 cfu·mL-1,共培养时间为1和3 h;当共培养时间1 h≤t≤24 h,益生菌菌体浓度为102、104、106和108 cfu·mL-1时,PK-15细胞存活率较高,益生菌与PK-15细胞共培养成立。采用MTT比色法检测对TGEV抑制率,结果显示,益生菌菌体浓度约为102~108 cfu·mL-1,共培养时间为1~24 h时对TGEV抑制率均达90%以上。此外,益生菌与PK-15细胞共培养的TGEV平均滴度较低。 展开更多
关键词 益生菌 PK-15细胞 共培养 抗TGEV
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猪伪狂犬病毒Fa株侵染对PK-15细胞microRNAs表达谱的影响
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作者 刘鹏娟 乔小改 +6 位作者 李萍 黄剑波 卓秀萍 方和俊 邓益超 徐志文 朱玲 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期2010-2018,共9页
【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证... 【目的】分析猪伪狂犬病毒Fa株(PRV-Fa)侵染对猪肾传代细胞PK-15 microRNAs(miRNAs)表达谱的影响。【方法】利用Illumina高通量测序技术,鉴定感染和非感染PRV-Fa的PK-15细胞的miRNAs;筛选并利用实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)验证差异表达miRNAs;对差异miRNAs进行靶基因预测和Gene ontology(GO)分析。【结果】在感染和未感染PK-15细胞中分别检测到384个和405个miRNAs,其中感染PRV-Fa后差异表达的miRNAs共127个(60个上调,67个下调)。荧光定量结果显示差异miRNAs的表达趋势与高通量测序结果一致。GO分析显示,miRNAs广泛参与信号传导、细胞代谢、免疫反应、基因表达等生物学进程,其中miR-10b、miR-16、miR-18a、miR-19b、miR-20a、miR-145-5p、miR-146a、miR-181a、miR-499-5p等miRNAs与免疫相关。在靶基因调控网络图中,ssc-miR-30a-5p与ssc-miR-30d处于关键位置。研究鉴定出5个新的病毒编码miRNAs,其中PRV-miR-LLT2与PRV-miR-LLT4靶向PRV早期蛋白基因EPO。【结论】伪狂犬病毒Fa株感染对PK-15细胞编码miRNAs有显著影响。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 MICRORNAS 高通量测序 PK-15细胞
猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定 预览
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作者 周景明 刘芳冰 +3 位作者 祁艳华 张改平 栗宁 王爱萍 《安徽农业科学》 CAS 2016年第10期160-162,186共4页
[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PC... [目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E0蛋白 增强型绿色荧光蛋白 PK-15细胞
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低血清培养PK-15细胞及其增殖猪圆环病毒2型的研究 预览 被引量:1
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作者 张瑞永 管宇 +4 位作者 吴信明 梅建国 姚春阳 沈志强 雷连成 《动物医学进展》 北大核心 2016年第9期16-20,共5页
依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞... 依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞能完全适应且生长状态良好;当血清浓度降至10mL/L时,传代1次细胞无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96h各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用该低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种PCV-2后,通过荧光抗体染色测定病毒滴度。结果显示,低血清培养的PCV-2病毒滴度为106.5TCID50/mL,与常规条件培养的PCV-2对照(病毒滴度为106.375 TCID50/mL)差别不明显,表明该体系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15细胞低血清培养PCV-2体系,为PCV-2的相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PK-15细胞 低血清培养基 猪圆环病毒2型 增殖 间接免疫荧光
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猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究 预览 被引量:1
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作者 张新晨 赵其岭 +4 位作者 陈萌萌 孙嘉瑞 鲍恩东 张书霞 吕英军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期2008-2016,共9页
【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、... 【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY11-7082(混合抑制剂)组。BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5μmol BX795、5μmol BAY11-7082、0.5μmol BX795+5μmol BAY 11-7082预先处理1 h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72 h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA 含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P〈0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA 含量在48 h显著升高(P〈0.01),TLR9的表达量在48、72 h显著升高(P〈0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA 含量在48 h显著升高(P〈0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P〈0.01),RIG-1的mRNA 含量在72 h显著升高(P〈0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA 含量在48 h显著升高(P〈0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P〈0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比无显著性差异(P〉0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比明显下降(P〈0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。 展开更多
关键词 PCV2 PK-15细胞 IFN-Β 信号通路 接头蛋白
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PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库构建及鉴定 预览 被引量:2
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作者 李珣 陈思宇 +1 位作者 胡传活 王晓晔 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期726-730,共5页
【目的】构建PK-15细胞酵母双杂交三框eDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(dscDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处... 【目的】构建PK-15细胞酵母双杂交三框eDNA文库,为深入研究猪伪狂犬病病毒(PRV)与宿主细胞间的相互作用机制打下基础。【方法】提取PK-15细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成全长的双链cDNA(dscDNA),并对其进行均一化和SfiI酶切处理。,处理后的dscDNA分别连接3种阅读框pGADT7-SfiI载体,将连接产物转化至大肠杆菌BH5α构建三框cDNA初级文库,取三框cDNA初级文库进行混合扩增,通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集文库细菌提取文库质粒。【结果】3种读码框cDNA文库的库容量分别为3.0×10^6,2.0×10^6和2.0×10^6CFU,文库实际扩增基数〉150万CFU;一号和三号读码框的基因重组率均为100%,二号读码框的基因重组率大于93%。cDNA文库外源基因插入片段长度在500~3000bp。cDNA文库质粒浓度约1.0mg/mL,质粒收获量约3.0mg。【结论】构建的PK-15细胞酵母双杂交三框cDNA文库具有较高的重组率和库容量,符合酵母双杂交筛选要求,可用于研究PRV与PK-15细胞间的相互作用机制。 展开更多
关键词 PK-15细胞 酵母双杂交 三框cDNA文库 均一化 猪伪狂犬病病毒(PRV)
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猪流行性腹泻病毒感染PK-15细胞miRNA的差异表达分析 被引量:1
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作者 黄剑波 郎巧利 +3 位作者 李新琼 徐志文 朱玲 周远成 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期465-471,共7页
为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diahorrea virus,PEDV)对猪肾传代细胞PK-15miRNA表达谱的影响,将PEDV感染PK-15细胞后,提取总RNA,进行高通量测序,构建感染与未感染PEDV的PK-15细胞的miRNA表达谱,并进行差异性分析,对表达... 为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diahorrea virus,PEDV)对猪肾传代细胞PK-15miRNA表达谱的影响,将PEDV感染PK-15细胞后,提取总RNA,进行高通量测序,构建感染与未感染PEDV的PK-15细胞的miRNA表达谱,并进行差异性分析,对表达差异显著的miRNA进行heatmap聚类分析及GO(Gene ontology,GO)分子功能(Molecular function,MF)分析,选取10个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行了验证。结果发现,显著性差异表达的miRNA有214个,其中175个miRNA表达上调,39个miRNA表达下调。Heatmap聚类分析表明,病毒组绝大部分差异表达的miRNA较对照组表达量上调,少部分下调。GO分析表明,miRNA广泛参与结合、蛋白结合、蛋白激酶活性、转移酶活性、含磷基团转移、磷酸转移酶活性等生物作用。RT-qPCR验证的各miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致。结果表明,猪流行性腹泻病毒感染对PK-15细胞编码的miRNA表达水平有显著影响,从而对进一步研究治疗PEDV的miRNA制剂提供新思路。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 miRNA表达谱 PK-15细胞
猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达及其对伪狂犬病病毒的抑制 被引量:1
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作者 王鹏 郑兆鑫 刘明秋 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期1-7,共7页
目的: 研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒 (PRV)具有抑制作用.方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪 Mx1和牛Mx1 基因,并克隆到pcDNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转... 目的: 研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒 (PRV)具有抑制作用.方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪 Mx1和牛Mx1 基因,并克隆到pcDNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转染的方法将其分别导入到PK-15细胞,从mRNA水平和蛋白质水平鉴定重组质粒在细胞内的表达情况,然后用细胞毒性试剂盒检测这两种蛋白是否对PK-15细胞具有毒性.之后,通过荧光定量PCR检测猪 Mx1和牛Mx1 在攻毒后不同时间、不同攻毒剂量的条件下对PRV的抑制情况,并观察100TCID50病毒攻击细胞72h后的病变程度.结果: 成功克隆了猪 Mx1和牛Mx1 基因,经mRNA水平和蛋白质水平证实,两种重组质粒在PK-15细胞内能够正常表达.从荧光定量PCR和细胞病变的角度来看,细胞内表达的Mx1蛋白对PRV具有显著性的抑制(P 〈0.001).结论: 猪 Mx1和牛Mx1 基因在PK-15细胞中表达的Mx1 蛋白能够抑制PRV在胞内的复制. 展开更多
关键词 猪Mx1 牛Mx1 PK-15细胞 伪狂犬病病毒
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