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敲低lncRNA SNHG16对胃癌细胞凋亡的影响及其机制 预览
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作者 周春欢 刘娟娟 +3 位作者 夏万松 夏英 万颖 黄海 《山东医药》 CAS 2019年第10期1-5,共5页
目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)核内小RNA宿主基因16(SNHG16)对胃癌细胞凋亡的影响及其机制。方法取人胃癌高分化细胞株AGS(以下称AGS细胞),体外传代培养。取传3代、对数生长期、生长状态良好的AGS细胞,随机分为空白对照组、阴性对... 目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)核内小RNA宿主基因16(SNHG16)对胃癌细胞凋亡的影响及其机制。方法取人胃癌高分化细胞株AGS(以下称AGS细胞),体外传代培养。取传3代、对数生长期、生长状态良好的AGS细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组、si-SNHG16组。si-SNHG16组、阴性对照组分别转染si-SNHG16干扰序列、阴性对照序列,空白对照组不予转染。转染48 h,收集各组细胞,采用qRT-PCR法验证si-SNHG16干扰效率以及敲低lncRNA SNHG16后p53基因表达;采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术、Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡情况;采用Western blotting法检测p53、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达;采用酶标仪检测Caspase-3酶活性。结果与空白对照组、阴性对照组比较,si-SNHG16组转染48 h lncRNA SNHG16相对表达量明显降低、p53基因相对表达量明显升高,细胞凋亡率和细胞凋亡数均明显增加,p53蛋白及凋亡相关蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达均明显上调,而Bcl-2表达明显下调,且Caspase-3酶活性明显增加(P均<0.05)。阴性对照组与空白对照组上述指标比较P均>0.05。结论敲低lncRNA SNHG16可促进胃癌细胞凋亡,其机制可能与激活p53信号通路下游凋亡相关蛋白表达,继而启动细胞凋亡程序有关。 展开更多
关键词 胃癌 长链非编码RNA 核内小RNA宿主基因16 RNA干扰技术 P53 细胞凋亡
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基因治疗的现状与临床研究进展
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作者 李春辉 胡泊 +1 位作者 翁郁华 黄渊余 《生命科学仪器》 2019年第4期3-12,共10页
基因治疗在恶性肿瘤、代谢疾病、感染性疾病、遗传病及罕见病治疗方面有着非常重要的意义。广义的基因治疗一般包括基于质粒DNA、RNA干扰(RNA interference,RNAi)和信使RNA(messenger RNA, mRNA)等技术。20世纪90年代,基于质粒DNA的基... 基因治疗在恶性肿瘤、代谢疾病、感染性疾病、遗传病及罕见病治疗方面有着非常重要的意义。广义的基因治疗一般包括基于质粒DNA、RNA干扰(RNA interference,RNAi)和信使RNA(messenger RNA, mRNA)等技术。20世纪90年代,基于质粒DNA的基因治疗发展迅速,直到1999年9月出现了第一个基因治疗受试病人的死亡案例,使得该领域进入沉寂期。与此同时,基于反义核酸技术、RNAi技术的研究与应用迅速崛起。1998年,Andrew Fire和Craig C. Mello首次发现并提出RNAi的概念,并于2006年获得诺贝尔奖。近些年,基于mRNA的基因疗法开始成为重要的研究热点和发展方向,利用mRNA作为疫苗和药物来预防、诊断和治疗某些疾病正逐渐成为制药企业关注的焦点。该综述分别介绍了(1)基因治疗的发展历程;(2)RNAi工作原理、发展历程、现存问题及面临挑战等;(3)mRNA基因治疗技术的发展历程、优势、递送方式、面临的问题等,同时还总结了目前全球小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)药物、mRNA药物临床研究现状及该领域关键技术的最新进展。 展开更多
关键词 基因治疗 RNA干扰 小干扰RNA MRNA 递送系统 临床研究进展
树形分子在siRNA递送载体中的应用 预览
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作者 蔡龚莉 陈裕 +4 位作者 林舒婷 朱丹丹 董怡文 李宁 刘潇璇 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期274-288,共15页
基于小干扰核酸分子(siRNA)的RNA干扰技术作为极具潜力的治疗策略吸引了越来越多的学术界和工业界的关注,如何实现siRNA的临床转化日渐成为生物医药领域的研究热点。然而,转化成功与否很大程度上依赖于安全高效的siRNA递送系统。树形分... 基于小干扰核酸分子(siRNA)的RNA干扰技术作为极具潜力的治疗策略吸引了越来越多的学术界和工业界的关注,如何实现siRNA的临床转化日渐成为生物医药领域的研究热点。然而,转化成功与否很大程度上依赖于安全高效的siRNA递送系统。树形分子作为一种新型的大分子,具有精确可控的化学结构、可供修饰的末端基团以及纳米尺寸等独特的物理化学性质,广泛应用于siRNA的递送。本文归纳和总结了不同种类的树形分子在siRNA递送领域的研究进展,为后续树形分子用于siRNA递送的研究提供思路。 展开更多
关键词 RNA干扰 小干扰RNA 树形分子
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IQ结构域的GTP酶激活蛋白1基因短发卡RNA重组质粒的构建及表达
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作者 邓青 杨成园 +5 位作者 王安彦 牛仕诗 郝跃鹏 寇俊婷 孙雪娇 王晓霞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第8期858-861,共4页
目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mRNA序列为靶向设计合成含有... 目的构建特异性针对人IQ结构域的GTP酶激活蛋白1(IQ-domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)基因短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的重组质粒,检测其在人食管癌KYSE150细胞中的表达。方法以人IQGAP1 mRNA序列为靶向设计合成含有shRNA序列的寡核苷酸,克隆至真核表达载体GV102中,构建重组质粒IQGAP1-shRNA,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆测序鉴定。用脂质体2000介导IQGAP1-shRNA转染KYSE150细胞作为IQGAP1-shRNA干扰组,同时设转染载体GV102为对照组,RT-PCR及Western blot法检测IQGAP1基因的干扰效果。结果经测序鉴定,重组质粒IQGAP1-shRNA构建正确。IQGAP1-shRNA干扰组及对照组转染KYSE150细胞均可见绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),两组转染效率分别为(76±5. 780)%和(83±3. 851)%。IQGAP1-shRNA干扰组IQGAP1 mRNA转录水平和蛋白表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(P <0. 001),表达抑制率分别为(82±2. 424)%及(77±2. 791)%。结论成功构建了IQGAP1-shRNA真核表达质粒,能特异性降低食管癌KYSE150细胞中IQGAP1基因的表达,为进一步研究IQGAP1基因在食管癌中的功能及靶向治疗作用奠定了基础。 展开更多
关键词 IQ结构域的GTP酶激活蛋白1 短发卡RNA RNA干扰 重组质粒 食管癌
首例RNA干扰药物问世及该领域技术演化历程
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作者 黄渊余 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第3期313-322,共10页
近期,RNA干扰(RNAi)制药公司Alnylam开发的小干扰RNA(siRNA)药物ONPATTRO^TM(Patisiran)相继获得美国食品与药物管理局和欧盟委员会批准上市,用于治疗成人患者的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变.这是全球第一款RNA... 近期,RNA干扰(RNAi)制药公司Alnylam开发的小干扰RNA(siRNA)药物ONPATTRO^TM(Patisiran)相继获得美国食品与药物管理局和欧盟委员会批准上市,用于治疗成人患者的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变.这是全球第一款RNAi药物,该事件标志着人类继小分子化合物、单克隆抗体蛋白类药物后,在前沿生物制药领域实现了新的突破,意味着RNAi疗法从基础研究到临床治疗的开发全过程首次贯通,具有里程碑式的意义.本文概述了该药物及适应症的基本情况,介绍了RNAi发现历史、作用机理与药物特征,RNAi药物的研发历程,以及该领域关键技术的最新研究进展. 展开更多
关键词 RNA干扰 小干扰RNA ONPATTRO 药物递送.稳定化修饰
siRNA可降低IL-1β刺激椎间盘细胞所致凋亡敏感性 预览 被引量:1
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作者 韩敦富 尹荷珊 +4 位作者 王延 王鹏云 汪震 魏超 时明 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期64-68,共5页
目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h... 目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h检测其对Fas受体(Fas)表达的影响。利用Fas-siRNA和阴性对照siRNA分别对原代大鼠椎间盘细胞进行转染48h后,实验分组和处理:共分5组,N、N-20ng、N-IL为阴性对照siRNA转染细胞,Si-20ng、Si-IL为Fas-siRNA2转染的细胞。N为对照组,只加1%FBS培养基;N-20ng和Si-20ng在1%FBS培养基培养8h后,更换为含20ng/mlFas配体(FasL)的1%FBS培养基;NIL和Si-IL:与10ng/mlIL-1β在1%FBS培养基中培养8h后,更换为含20ng/mlFasL的1%FBS培养基;以上各组加入20ng/mlFasL后均继续培养24h,观察细胞的凋亡情况,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot分别检测FasmRNA和蛋白表达水平。结果①与10ng/mlIL-1β共培养的阴性对照siRNA转染细胞的FasmRNA在4h时开始升高,但32h时才出现统计学差异;而蛋白检测各时间点均未出现表达差异。②经IL-1β预处理的Si-IL、N-IL细胞组较相应的未经IL-1β预处理的Si-20ng、N-20ng细胞组,细胞凋亡率均升高;Fas-siRNA转染的Si-IL细胞组较阴性siRNA转染的N-IL细胞组的细胞凋亡率明显下降。③细胞凋亡率与Fas的表达具有相关性。结论siRNA可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,但其确切机制尚需进一步研究。 展开更多
关键词 椎间盘细胞 凋亡 SIRNA IL-1Β RNA干扰
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微小RNA-384通过下调多效生长因子表达抑制胰腺癌细胞增殖及浸润
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作者 符常波 聂磊 +1 位作者 殷涛 吴东德 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1048-1051,共4页
目的观察微小RNA(miRNA,miR)-384在胰腺癌组织及癌旁组织、胰腺癌细胞株中的表达及其与胰腺癌临床病理特殊的关系及其对癌细胞株增殖、迁移等的影响,探讨其作用机制。方法查询生物信息预测miR-384可能靶向结合多效生长因子(PTN)的mRNA,... 目的观察微小RNA(miRNA,miR)-384在胰腺癌组织及癌旁组织、胰腺癌细胞株中的表达及其与胰腺癌临床病理特殊的关系及其对癌细胞株增殖、迁移等的影响,探讨其作用机制。方法查询生物信息预测miR-384可能靶向结合多效生长因子(PTN)的mRNA,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测2016年3月至2018年12月湖北省肿瘤医院67例胰腺癌组织标本或穿刺标本中癌及癌旁组织中miR-384及PTN的表达,用携带miR-384的腺病毒转染胰腺癌细胞株PANC-1/MIAPaCa-2,PT-PCR技术检测转染前后miR-384、PTNmRNA表达量,蛋白质印迹法(Westernblot)检测转染前后PTN蛋白变化,通过噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell小室检测转染前后PANC-1/MIAPaCa-2增殖、迁移及侵袭能力变化。应用SPSS19.0统计软件和GraphPadPrism8.0进行数据处理和统计分析,数据以均值±标准差(Mean±SD)表示。miR-384在癌组织和癌旁组织间表达量的比较采用配对样本的t检验。结果miR-384在胰腺癌组织及癌旁组织中相对表达量分别为0.0037±0.0009、0.0065±0.0022,差异有统计学意义(t=6.177,P<0.01),并与神经浸润及淋巴结转移明显相关(χ^2=4.750、13.400,P<0.05)。将胰腺癌组织分为miR-384低表达组及高表达组,PTNmRNA相对表达量分别为0.073±0.028、0.045±0.001,差异有统计学意义(t=2.082,P<0.05)。转染腺病毒后,与阴性对照组比较,PANC-1细胞中miR-384表达提高11.69倍(t=28.600,P<0.01),PTNmRNA及PTN蛋白则分别降至19.02%(t=31.200,P<0.01)、38.00%(t=16.200,P<0.01),MIAPaCa-2细胞中miR-384表达提高14.95倍(t=21.300,P<0.01),PTNmRNA及PTN蛋白分别降至15.02%(t=13.300,P<0.01)、13.74%(t=13.500,P<0.01),差异有统计学意义。两种细胞株增殖、迁移、侵袭能力均下降,而重组人PTN蛋白处理可逆转此情况。结论miR-384在胰腺癌中具有明显抑制肿瘤作用,其机制可能是通过靶向结合PTNmRNA下调PTN表达实现。 展开更多
关键词 胰腺癌 多效生长因子 侵袭转移 RNA干扰 微小RNA-384
纳米技术在害虫绿色防控领域的应用与展望
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作者 闫硕 沈杰 《应用昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期617-624,共8页
近些年,纳米技术在农业领域发展迅猛,推动了传统农业在交叉学科领域的不断发展和深化。目前已利用纳米载体实现了四个方面的功能与应用:纳米载体携带外源dsRNA突破害虫体壁屏障,调控害虫生长发育;纳米载体携带专性病毒DNA毒杀非寄主害虫... 近些年,纳米技术在农业领域发展迅猛,推动了传统农业在交叉学科领域的不断发展和深化。目前已利用纳米载体实现了四个方面的功能与应用:纳米载体携带外源dsRNA突破害虫体壁屏障,调控害虫生长发育;纳米载体携带专性病毒DNA毒杀非寄主害虫,扩大病毒防治谱;纳米载体携带Bt毒蛋白高效杀死非敏感害虫,治理害虫抗药性;纳米载体携带杀虫剂提升利用率、降低使用量、拓展防治谱。本文结合最新研究进展,重点介绍了纳米技术在害虫绿色防控领域的研究进展和应用现状,并对纳米技术在绿色防控领域的研究与应用作了展望。 展开更多
关键词 纳米材料 RNA干扰 BT毒蛋白 核型多角体病毒 纳米杀虫剂
下调WRAP53基因表达对人食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖和凋亡的影响 预览
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作者 杨新彬 洪厚松 +2 位作者 刘太省 张金野 饶旭光 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第17期2688-2692,共5页
目的检测食管鳞状细胞癌中WRAP53蛋白的表达,探讨下调自然反义转录本WRAP53基因表达对人食管鳞状细胞癌EC109细胞的增殖与凋亡的影响。方法采用免疫印迹法检测WRAP53蛋白在食管鳞状细胞癌细胞株中的表达情况,并用免疫组织化学技术检测8... 目的检测食管鳞状细胞癌中WRAP53蛋白的表达,探讨下调自然反义转录本WRAP53基因表达对人食管鳞状细胞癌EC109细胞的增殖与凋亡的影响。方法采用免疫印迹法检测WRAP53蛋白在食管鳞状细胞癌细胞株中的表达情况,并用免疫组织化学技术检测85例食管鳞状细胞癌组织以及正常食管黏膜上皮中的WRAP53蛋白的表达,将特异性siWRAP53作用于食管鳞状细胞癌细胞株EC109细胞使其WRAP53表达下调,MTT法检测WRAP53表达下调对食管鳞状细胞癌细胞株EC109增殖的影响,免疫印迹法检测WRAP53表达下调对凋亡蛋白BAX的影响。结果食管鳞状细胞癌细胞系(EC109,EC9706,KYSE150和KYSE180)均能检测到WRAP53蛋白的表达,食管鳞状细胞癌组织中WRAP53蛋白的阳性表达明显高于正常食管黏膜上皮组织(P<0.001),WRAP53表达下调能抑制EC109细胞的增殖,同时增加EC109细胞BAX蛋白的表达。结论WRAP53蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达升高,下调WRAP53可抑制食管癌EC109细胞的增殖和促进EC109细胞的凋亡。 展开更多
关键词 食管鳞状细胞癌 WRAP53 RNA干扰技术 增殖 凋亡
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携带NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其评价 预览
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作者 郭莉霞 殷钟意 郑旭煦 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期14-17,共4页
构建稳定表达 NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默 NMU2R 表达的高滴度重组腺相关病毒。首先设计合成 NMU2R shRNA,退火形成双链与pAAV-ZsGreen-shRNA质粒 Bam H I和 Hin d III双酶切产物相连接构建形成质粒pAAV-ZsG... 构建稳定表达 NMU2R shRNA的重组腺相关病毒载体,制备并纯化靶向性沉默 NMU2R 表达的高滴度重组腺相关病毒。首先设计合成 NMU2R shRNA,退火形成双链与pAAV-ZsGreen-shRNA质粒 Bam H I和 Hin d III双酶切产物相连接构建形成质粒pAAV-ZsGreen-r NMU2R shRNA,经双酶切和测序鉴定证实,重组质粒克隆正确,将重组质粒转染到AAV-293包装细胞中包装成腺相关病毒载体,成功制备重组腺相关病毒rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA,经测定纯化所得rAAV5病毒滴度为1×10^12 vg/mL。最后将rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA感染大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12,检测 NMU2R shRNA基因沉默效果,利用空病毒载体pAAV-ZsGreen-shRNA作对照,Real-time PCR及Western Blot方法测得 NMU2R mRNA及蛋白表达水平与对照组相比显著下降。综上,成功构建了高滴度携带 NMU2R shRNA重组腺相关病毒载体rAAV5-ZsGreen-r NMU2R shRNA。 展开更多
关键词 neuromedin U 2受体 RNA干扰 重组腺相关病毒
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靶向TRIM29基因的siRNA通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡 预览
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作者 任晓晖 王洪波 +1 位作者 郭庆 赵娜 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1445-1450,共6页
目的:探讨沉默TRIM29基因表达对鼻咽癌细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响。方法:将人鼻咽癌5-8F细胞分为空白组、阴性对照(NC)组(转染阴性对照siRNA)和si-TRIM29组(转染TRIM29的特异性siRNA),通过CCK-8法检测si-TRIM29转染5-8F细胞0~96 ... 目的:探讨沉默TRIM29基因表达对鼻咽癌细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响。方法:将人鼻咽癌5-8F细胞分为空白组、阴性对照(NC)组(转染阴性对照siRNA)和si-TRIM29组(转染TRIM29的特异性siRNA),通过CCK-8法检测si-TRIM29转染5-8F细胞0~96 h的细胞活力。通过流式细胞术及Western blot分别检测si-TRIM29转染5-8F细胞48 h的细胞凋亡率及TRIM29、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、t-AKT和p-AKT的蛋白水平。10μmol/L的PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002及si-TRIM29单独或联用处理细胞,细胞分为空白组、LY294002组和LY294002+si-TRIM29组,流式细胞术检测3组细胞凋亡率。结果:转染TRIM29 siRNA的5-8F细胞TRIM29蛋白表达明显低于空白组(P<0.05)。和空白组比较,si-TRIM29组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白的水平明显升高,Bcl-2和p-AKT蛋白的水平明显降低(P<0.05)。LY294002组的细胞凋亡率高于空白组,而LY294002+si-TRIM29组的细胞凋亡率高于LY294002组(P<0.05)。结论:沉默TRIM29基因表达可通过抑制PI3K/AKT信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡。 展开更多
关键词 鼻咽癌 TRIM29基因 PI3K/AKT信号通路 细胞凋亡 RNA干扰
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大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响 预览
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作者 宋衍秋 毛用敏 +1 位作者 秦勤 丛洪良 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期122-126,226-227共6页
目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列... 目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列,构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒,测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组(Normal组),空载慢病毒组(Lv-rAdrb3-shRNA-control组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组(Lv-rAdrb3-shRNA-1组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组(Lv-rAdrb3-shRNA-2组),感染5 d后,收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白,Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达,Western blot检测rAdrb3蛋白表达。结果构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,滴度均为2×10~8TU/mL。慢病毒感染大鼠VSMC 72 h后,感染效率可达80%。与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、65.27%(P<0.05);与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、70.04%(P<0.05)。结论成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。 展开更多
关键词 受体 肾上腺素能β3 RNA干扰 慢病毒 慢性心力衰竭 血管平滑肌细胞
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SFRP1基因沉默抑制人胃黏膜上皮GES-1细胞失巢凋亡 预览
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作者 汤晓琳 杨丹 +1 位作者 吕鑫 沈薇 《中国老年学杂志》 CAS 北大核心 2019年第16期4034-4038,共5页
目的观察RNA干扰沉默分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1基因对人胃黏膜上皮细胞(GES)-1失巢凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法应用SFRP1基因小干扰RNA(siRNA)转染处理GES-1后,分别采用Realtime RT-PCR和Western印迹检测SFRP1 mRNA和蛋白表达... 目的观察RNA干扰沉默分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1基因对人胃黏膜上皮细胞(GES)-1失巢凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法应用SFRP1基因小干扰RNA(siRNA)转染处理GES-1后,分别采用Realtime RT-PCR和Western印迹检测SFRP1 mRNA和蛋白表达。细胞悬浮培养应用Poly-HEMA方法。采用流式细胞术和Calcein AM/EthD-1荧光双染法检测细胞失巢凋亡,软琼脂集落实验检测细胞非锚定生长状态,免疫荧光和Western印迹实验检测SFRP1沉默后Wnt通路中β-catenin的定位及表达,Realtime RT-PCR检测β-catenin靶基因c-Myc和CyclinD1 mRNA表达。结果与对照组比较,siRNA-891组中SFRP1 mRNA和蛋白表达明显被抑制。siRNA-891组细胞失巢凋亡率明显下降(P<0.05),EthD-1荧光染色的失巢凋亡细胞数目明显减少(P<0.05),软琼脂集落形成数目明显增多(P<0.05)。siRNA-891组中β-catenin蛋白表达水平明显增加,其靶基因c-Myc mRNA和CyclinD1 mRNA表达明显增高(P<0.01)。结论SFRP1siRNA可抑制GES-1细胞失巢凋亡,使其失巢凋亡敏感性下降,激活Wnt分子通路可能是其机制之一。 展开更多
关键词 分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)1 失巢凋亡 RNA干扰 Wnt/β-catenin信号通路
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pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA真核表达干扰载体构建与鉴定 预览
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作者 朱家佳 龙鼎新 《贵州医药》 CAS 2019年第5期675-678,共4页
目的利用RNA干扰技术构建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体,并在Hela细胞中鉴定。方法针对目的基因人的CAPNS1基因(NM_001749),设计shRNA序列,以pYr-Lvsh为载体,构建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体;干扰载体转染Hela细胞,利用荧光定量PCR检测CAPNS... 目的利用RNA干扰技术构建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体,并在Hela细胞中鉴定。方法针对目的基因人的CAPNS1基因(NM_001749),设计shRNA序列,以pYr-Lvsh为载体,构建pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体;干扰载体转染Hela细胞,利用荧光定量PCR检测CAPNS1mRNA表达情况;荧光分光光度检测calpain活性;Western-blot检测相关蛋白含量。结果结果发现,载体酶切及测序结果显示pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体构建成功;qPCR显示与对照组相比,shRNA组CAPNS1表达受到抑制,CAPNS1-sh的干扰效率为50.30%;calpain活性检测显示shRNA组calpain活性下降并且CAPNS1、calpain1和calpain2蛋白含量下降。结论结果表明pYr-Lvsh-CAPNS1-shRNA载体成功构建,并在Hela细胞中有效干扰CAPNS1表达。 展开更多
关键词 CAPNS1 RNA干扰 pYr-Lvsh 载体构建
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斯氏按蚊中Toll受体参与抵抗微生物感染和调控肠道菌群稳态 预览
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作者 孙佩璐 崔春来 +1 位作者 宋红生 王四宝 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期937-947,共11页
【目的】Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用。本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能。【方... 【目的】Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用。本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能。【方法】根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp.carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射AsToll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化。【结果】在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即AsToll1A,AsToll5A,AsToll6,AsToll7,AsToll8,AsToll9,AsToll10和AsToll11。通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,AsToll1A表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低。在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,AsToll1A和AsToll5A在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低。RNA干扰结果表明,AsToll1A或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多。而且,抑制AsToll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调。【结论】斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中AsToll1A和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态。 展开更多
关键词 斯氏按蚊 TOLL受体 球孢白僵菌 革兰氏阴性细菌 RNA干扰 肠道细菌
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RNA干扰HMGA2基因表达对人肾癌转移细胞株增殖与侵袭影响
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作者 宋玲玲 刘颖 +4 位作者 蒲琳 李凯 彭大帅 吕光耀 刘险锋 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 北大核心 2019年第12期836-841,共6页
目的用分子生物学研究肾癌形成和进展,可为临床治疗提供更可靠的依据,高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)是近年来研究热点之一。本研究观察HMGA2对肾癌细胞增殖和侵袭能力影响,为肾癌进一步临床研究提供依据。方法培养人... 目的用分子生物学研究肾癌形成和进展,可为临床治疗提供更可靠的依据,高迁移率族蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)是近年来研究热点之一。本研究观察HMGA2对肾癌细胞增殖和侵袭能力影响,为肾癌进一步临床研究提供依据。方法培养人肾癌细胞系786-O、769-P、人肾癌转移细胞系ACHN、人正常肾小管上皮细胞系HKC,研究分为3组,HMGA2-siRNA组、Mock-siRNA组和未转染组。利用RNA干扰技术,瞬时转染肾癌ACHN细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹法检测HMGA2mRNA及蛋白表达;MTT法检测干扰后ACHN细胞增殖能力;Transwell法检测干扰后ACHN细胞侵袭能力。结果786-O、769-P、ACHN和HKC细胞系HMGA2mRNA表达量分别为0.82±0.10、0.79±0.09、0.98±0.16和0.04±0.01,组内差异有统计学意义,F=63.36,P=0.002;4种细胞系中HMGA2蛋白表达量分别为0.80±0.09、0.75±0.08、0.94±0.10和0.06±0.02,组内差异有统计学意义,F=49.09,P=0.005。选择ACHN细胞作为后续研究:成功构建特异性沉默HMGA2表达的肾癌细胞株。在转染后24、48、72和96h,HMGA2-siRNA组细胞增殖速度分别为0.69±0.02、0.90±0.05、0.99±0.07和1.10±0.09,Mock-siRNA组细胞增殖速度分别为0.89±0.03、1.36±0.06、1.82±0.08和2.10±0.10,未转染组细胞增殖速度分别为0.91±0.02、1.50±0.06、1.91±0.10和2.20±0.12。HMGA2-siRNA组细胞增殖速度低于Mock-siRNA组和未转染组,F组别=630.724,P<0.001;F时间=566.968,P<0.001;F组别×时间=51.328,P=0.002。在转染后48h,HMGA2-siRNA组、Mock-siRNA组及未转染组穿过细胞数的比值分别为0.34±0.04,0.87±0.09和0.91±0.10,F=6.42,P=0.039。结论用HMGA2-siRNA干扰ACHN细胞,可抑制细胞增殖及侵袭能力,HMGA2基因在肾癌发生、发展中可能发挥“癌基因”作用,HMGA2基因及蛋白表达可能与肿瘤形成、进展和转移密切相关,有望成为肾癌治疗的一个重要靶点。 展开更多
关键词 肾癌 高迁移率族蛋白A2 RNA干扰 增殖 侵袭
肢体和心脏发育基因在前列腺癌中的表达
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作者 朱东风 王雷 赫志强 《中华男科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期22-28,共7页
目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa ... 目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa P前列腺癌细胞以沉默LBH的表达,采用CCK-8、Transwell小室法观察细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:q PCR检测结果显示前列腺癌组织中LBHm RNA表达水平明显高于正常前列腺组织(4. 8±2. 4 vs 1. 8±1. 1,P=0. 032);IHC结果显示LBH蛋白在前列腺癌组织中表达阳性率为90. 0%(18/20),正常前列腺组织中为15. 0%(3/20),差异具有统计学意义(P=0. 006);Western印迹结果也显示前列腺癌组织中LBH表达显著高于正常前列腺组织(3. 5±1. 2 vs 1. 3±0. 6,P=0. 019)。干扰LBH表达后,PC-3和LNCa P细胞的增殖能力均显著下降,96 h时,PC-3细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值显著低于阴性对照组(1. 2±0. 1、1. 1±0. 1 vs 1. 8±0. 2,P <0. 01);LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值也显著低于阴性对照组(1. 4±0. 2、1. 1±0. 2 vs 1. 9±0. 2,P <0. 01)。细胞迁移实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(55. 5±6. 4)、(44. 9±4. 5)个vs (175. 6±25. 8)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(40. 2±8. 2)个vs (125. 3±13. 5),P <0. 05]。细胞侵袭实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(82. 5±7. 5)、(68. 4±5. 5)个vs (138. 2±10. 7)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(23. 1±6. 2)个vs (92. 1±10. 5)个,P <0. 05]。结论:高表达的LBH可能在前列腺癌的发病过程中发挥重要作用,可作为前列腺癌治疗的潜在靶标。 展开更多
关键词 前列腺癌 肢体和心脏发育基因 RNA干扰 细胞增殖 细胞迁移 细胞侵袭
CaMKⅡγ基因沉默对破骨细胞分化中NFATc1、TRAP、c-Src基因表达的影响 预览
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作者 刘梦楠 王会 +3 位作者 戚孟春 董伟 李任 孙红 《实用肿瘤学杂志》 CAS 2019年第4期294-299,共6页
目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)γ基因沉默对破骨细胞分化过程中活化T-细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)、非受体酪氨酸激酶(Cell-sarcoma receptor coa... 目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)γ基因沉默对破骨细胞分化过程中活化T-细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)、非受体酪氨酸激酶(Cell-sarcoma receptor coactivator,c-Src)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)基因表达的影响,探讨CaMKⅡγ在破骨细胞分化中的作用和分子机制。方法用慢病毒构建CaMKⅡγRNA干扰载体,转染RAW264.7细胞,实验分为A、B、C三组,分别为对照组、阴性载体组和干扰载体组;三组细胞转染12 h后,用50 ng RANKL诱导向破骨细胞分化;诱导5 d后收获细胞,采用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光化学检测三组细胞中NFATc1、TRAP、c-Src基因表达情况。结果 C组中NFATc1、TRAP、c-Src mRNA水平较A组分别下降了49.86%、43.65%和53.57%(P<0.001),蛋白水平分别下降了54.22%、46.75%和45.86%(P<0.001);而B组与A组比较无统计学差异(P>0.05)。免疫荧光化学检测C组上述基因荧光强度明显弱于A、B组,且破骨细胞生成明显少于A、B组。结论 CaMKⅡγRNA干扰显著抑制了NFATc1、TRAP、c-Src基因表达,提示CaMKⅡγ在破骨细胞分化中起着关键调控作用。 展开更多
关键词 钙调蛋白依赖性激酶Ⅱγ RNA干扰 活化T细胞核因子c1 非受体酪氨酸激酶 抗酒石酸酸性磷酸酶
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慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
抑制COL6A1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响
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作者 杨荣权 廖泽明 +1 位作者 蔡勇 王超 《临床泌尿外科杂志》 2019年第6期449-452,458共5页
目的:研究小干扰RNA抑制COL6A1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:设计合成靶向COL6A1基因的siRNA,采用阳离子脂质体试剂瞬时转染膀胱癌细胞株T24,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后COL6A1基因的沉默效... 目的:研究小干扰RNA抑制COL6A1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:设计合成靶向COL6A1基因的siRNA,采用阳离子脂质体试剂瞬时转染膀胱癌细胞株T24,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后COL6A1基因的沉默效果,评价siRNA设计的合理性及RNA干扰抑制COL6A1表达的有效性,分别在RNA干扰后第1、2、3天应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖状态,并绘制生长曲线,应用Transwell法检测各组膀胱癌侵袭能力。结果:靶向COL6A1的siRNA成功抑制了膀胱癌细胞株T24中COL6A1 mRNA及蛋白表达,COL6A1-siRNA组蛋白相对表达量为阴性对照组的14.1%,mRNA相对表达量为空白对照组的20.5%;MTT比色法显示COL6A1-siRNA组细胞增殖能力显著减弱(P<0.05),在第1、2、3天后重复检测,分别达到了空白对照组的75.6%、58.2%和49.4%;Transwell细胞迁移实验显示COL6A1-siRNA组细胞迁移能力明显减弱(P<0.05),穿膜细胞数为空白对照组的45.3%。结论:利用siRNA技术能有效降低COL6A1基因的表达,同时有效抑制T24细胞的体外增殖和侵袭的能力。 展开更多
关键词 膀胱癌 COL6A1 增殖 侵袭 RNA干扰
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