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首例RNA干扰药物问世及该领域技术演化历程
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作者 黄渊余 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2019年第3期313-322,共10页
近期,RNA干扰(RNAi)制药公司Alnylam开发的小干扰RNA(siRNA)药物ONPATTRO^TM(Patisiran)相继获得美国食品与药物管理局和欧盟委员会批准上市,用于治疗成人患者的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变.这是全球第一款RNA... 近期,RNA干扰(RNAi)制药公司Alnylam开发的小干扰RNA(siRNA)药物ONPATTRO^TM(Patisiran)相继获得美国食品与药物管理局和欧盟委员会批准上市,用于治疗成人患者的遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变.这是全球第一款RNAi药物,该事件标志着人类继小分子化合物、单克隆抗体蛋白类药物后,在前沿生物制药领域实现了新的突破,意味着RNAi疗法从基础研究到临床治疗的开发全过程首次贯通,具有里程碑式的意义.本文概述了该药物及适应症的基本情况,介绍了RNAi发现历史、作用机理与药物特征,RNAi药物的研发历程,以及该领域关键技术的最新研究进展. 展开更多
关键词 RNA干扰 干扰RNA ONPATTRO 药物递送.稳定化修饰
siRNA可降低IL-1β刺激椎间盘细胞所致凋亡敏感性 预览
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作者 韩敦富 尹荷珊 +4 位作者 王延 王鹏云 汪震 魏超 时明 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第1期64-68,共5页
目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h... 目的明确siRNA是否可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,并初步探讨其机制。方法用阴性对照siRNA转染原代大鼠腰椎间盘细胞后,用含10ng/mlIL-1β的1%胎牛血清(FBS)培养基和被转染椎间盘细胞共培养,分别在4、8、16、32h检测其对Fas受体(Fas)表达的影响。利用Fas-siRNA和阴性对照siRNA分别对原代大鼠椎间盘细胞进行转染48h后,实验分组和处理:共分5组,N、N-20ng、N-IL为阴性对照siRNA转染细胞,Si-20ng、Si-IL为Fas-siRNA2转染的细胞。N为对照组,只加1%FBS培养基;N-20ng和Si-20ng在1%FBS培养基培养8h后,更换为含20ng/mlFas配体(FasL)的1%FBS培养基;NIL和Si-IL:与10ng/mlIL-1β在1%FBS培养基中培养8h后,更换为含20ng/mlFasL的1%FBS培养基;以上各组加入20ng/mlFasL后均继续培养24h,观察细胞的凋亡情况,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot分别检测FasmRNA和蛋白表达水平。结果①与10ng/mlIL-1β共培养的阴性对照siRNA转染细胞的FasmRNA在4h时开始升高,但32h时才出现统计学差异;而蛋白检测各时间点均未出现表达差异。②经IL-1β预处理的Si-IL、N-IL细胞组较相应的未经IL-1β预处理的Si-20ng、N-20ng细胞组,细胞凋亡率均升高;Fas-siRNA转染的Si-IL细胞组较阴性siRNA转染的N-IL细胞组的细胞凋亡率明显下降。③细胞凋亡率与Fas的表达具有相关性。结论siRNA可降低大鼠椎间盘细胞对IL-1β预刺激导致的凋亡敏感性,但其确切机制尚需进一步研究。 展开更多
关键词 椎间盘细胞 凋亡 SIRNA IL-1Β RNA干扰
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干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力 预览
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作者 陈钦桂 曾勉 +2 位作者 何婉媚 张莉珊 郑海崇 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2019年第5期673-679,共7页
背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法... 背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组。使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Westernblot检测β-catenin蛋白表达水平。结果与结论:①与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;②干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 成骨 诱导分化 慢病毒载体 foxM1基因 基因干扰 β-catenin 国家自然科学基金 叉头转录因子类 RNA干扰 骨髓 间质干细胞 细胞分化 成骨细胞 组织工程
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沉默IFN-γR表达对大鼠BMMSCs免疫调节能力的影响
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作者 兰绍阳 谭梅傲 +3 位作者 陶双友 蔡佳仲 康锦花 陈斌 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期559-564,共6页
目的:通过沉默大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)干扰素γ受体(IFN-γR)基因表达,研究抑制IFN-γ信号通路对大鼠BMMSCs免疫调节能力的影响。方法:根据大鼠IFN-γR基因序列,构建沉默IFN-γR基因的重组慢病毒shIFNγR-LV,并转染大鼠BMMSCs,沉... 目的:通过沉默大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)干扰素γ受体(IFN-γR)基因表达,研究抑制IFN-γ信号通路对大鼠BMMSCs免疫调节能力的影响。方法:根据大鼠IFN-γR基因序列,构建沉默IFN-γR基因的重组慢病毒shIFNγR-LV,并转染大鼠BMMSCs,沉默大鼠BMMSCs的IFN-γR基因表达;混合淋巴细胞培养实验分别检测对照组、BMMSCs阴性对照(BMMSC-NC)组和BMMSC-shIFNγR组淋巴细胞的活力和炎症因子浓度。结果:构建的慢病毒shIFNγR-LV能显著降低大鼠BMMSCs的IFN-γR mRNA表达;混合淋巴细胞培养实验显示,相对BMMSC-NC组,BMMSC-shIFNγR组抑制淋巴细胞活力的作用减弱(P<0.05)。混合淋巴细胞培养体系中,BMMSC-NC组肿瘤坏死因子α浓度低于BMMSC-shIFNγR组,而白细胞介素10浓度高于BMMSC-shIFNγR组(P<0.05)。结论:利用RNA干扰技术能有效沉默大鼠BMMSCs的IFN-γR基因表达,并能显著降低BMMSCs的调节免疫功能。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 干扰素Γ RNA干扰 免疫调节
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唇腭裂相关基因IRF6基因沉默促进细胞增殖和迁移并抑制上皮间质转化
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作者 赵远锋 文杰 +1 位作者 周天鸿 邹奕 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期296-303,共8页
干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)基因突变在单纯型和综合征型唇腭裂中均有报导。然而,其基因突变如何导致了唇腭裂的病理发生目前尚不清楚。本文以培养细胞为模型,研究了IRF6基因沉默对细胞增殖、迁移、凋亡以及... 干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)基因突变在单纯型和综合征型唇腭裂中均有报导。然而,其基因突变如何导致了唇腭裂的病理发生目前尚不清楚。本文以培养细胞为模型,研究了IRF6基因沉默对细胞增殖、迁移、凋亡以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,从而探讨唇腭裂形成的可能的分子病理机制。采用分子克隆技术构建IRF6真核过表达载体;设计合成IRF6基因特异siRNA,成功构建IRF6基因沉默和过表达细胞模型;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)检测转染siRNA-IRF6质粒48 h时,发现IRF6的mRNA和蛋白质表达均降低2倍;CCK8法检测转染siRNA-IRF6后,对细胞增殖能力提高1.98倍;划痕法观察转染siRNA-IRF6质粒72 h后检测细胞的迁移能力,比对照组增强2.36倍;利用Western印迹、qRT-PCR检测EMT标志性分子E-钙黏着蛋白(E-cadherin),发现过表达IRF6后EMT有显著降低。与对照相比,E-钙黏着蛋白表达下调3.57倍;流式细胞技术检测IRF6时未发现对细胞凋亡有影响。在体外培养细胞模型中,IRF6基因沉默显著促进了细胞的增殖和迁移,抑制EMT发生。提示IRF6这一唇腭裂相关基因有可能通过影响上述细胞事件,而导致唇腭裂的病理发生。 展开更多
关键词 唇腭裂 干扰素调节因子6 RNA干扰 上皮间质转化
反义寡核苷酸治疗的分子影像技术进展 预览
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作者 孔繁磊 刘思耘 +4 位作者 张宝平 石喻 赵相轩 赵周社 郭启勇 《医学综述》 2019年第3期556-560,565共6页
反义寡核苷酸治疗在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力。同时,反义寡核苷酸治疗药物在生物体内转运至靶点发挥作用过程中也面临许多障碍,并存在一些不可预期的不良反应。分子影像技术可以对反义寡核苷酸治疗的生物进程进行成像,并对治疗... 反义寡核苷酸治疗在许多疾病的治疗中具有巨大的潜力。同时,反义寡核苷酸治疗药物在生物体内转运至靶点发挥作用过程中也面临许多障碍,并存在一些不可预期的不良反应。分子影像技术可以对反义寡核苷酸治疗的生物进程进行成像,并对治疗效果进行监测,对于优化反义寡核苷酸治疗至关重要。目前,多种分子影像模式已经应用在反义寡核苷酸治疗相关的研究上,每一个成像方式都有其独特的优势,但同样也有其固有的缺陷,多模态成像成为未来发展的趋势。 展开更多
关键词 RNA干扰 反义寡核苷酸治疗 分子影像
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siRNA沉默POLE2基因表达对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 预览
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作者 李娜苗 张莹莹 +4 位作者 范亚莉 赵钰玲 董娅 白洁 李建英 《现代肿瘤医学》 CAS 2019年第1期35-40,共6页
目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切... 目的:构建DNA聚合酶εB亚基(POLE2)基因重组慢病毒载体,并检测其在非小细胞肺癌(NSCLC)中的功能。方法:RT-PCR技术检测POLE2基因在A549、NCI-H1975、NCI-H1299细胞中的表达。设计并合成针对POLE2 siRNA靶序列的寡核苷酸单链,退火、酶切后产生GV115-shPOLE2慢病毒载体。该载体含有绿色荧光蛋白(GFR),经聚合酶链式反应(PCR)筛选出阳性克隆并测序鉴定。将GV115-shPOLE2、Helper1.0、Helper2.0质粒共感染包装293T细胞,包装成假病毒颗粒并感染非小细胞肺癌A549细胞,经免疫印迹法(Western blot)检测筛选POLE2 siRNA有效靶点,从而进行细胞功能学实验。CCK-8法检测POLE2基因沉默对于细胞增殖能力的影响;克隆形成实验检测POLE2基因沉默对细胞克隆形成能力的影响;Casepase3/7检测POLE2基因沉默对细胞凋亡的影响。结果:RT-PCR结果证实POLE2基因在三株细胞中表达丰度均为高表达。PCR和测序结果显示,GV115-shPOLE2慢病毒载体构建正确,经Western blot法证明POLE2 siRNA对于POLE2的外源表达有明显沉默作用,是有效靶点。慢病毒转染A549细胞后细胞增殖明显减缓,细胞克隆数减少,凋亡细胞数增多,与转染阴性对照病毒的A549细胞组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi技术沉默POLE2基因表达后,POLE2 siRNA明显抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖。 展开更多
关键词 慢病毒转染 基因 非小细胞肺癌 RNA干扰
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大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响 预览
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作者 宋衍秋 毛用敏 +1 位作者 秦勤 丛洪良 《天津医药》 CAS 北大核心 2019年第2期122-126,226-227共6页
目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列... 目的构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列,构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒,测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组(Normal组),空载慢病毒组(Lv-rAdrb3-shRNA-control组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组(Lv-rAdrb3-shRNA-1组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组(Lv-rAdrb3-shRNA-2组),感染5 d后,收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白,Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达,Western blot检测rAdrb3蛋白表达。结果构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,滴度均为2×10~8TU/mL。慢病毒感染大鼠VSMC 72 h后,感染效率可达80%。与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、65.27%(P<0.05);与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、70.04%(P<0.05)。结论成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。 展开更多
关键词 受体 肾上腺素能β3 RNA干扰 慢病毒 慢性心力衰竭 血管平滑肌细胞
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褐飞虱GSK-3调控糖原与海藻糖代谢的潜在功能 预览
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作者 丁艳娟 刘永康 +4 位作者 罗雨嘉 邓颖梅 徐红星 唐斌 徐彩娣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1237-1246,共10页
【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3)调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱(Nilaparvata lugens)体内对糖... 【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3)调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱(Nilaparvata lugens)体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点(pI);然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射ds GFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶(trehalase,TRE)活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组ds GFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类 展开更多
关键词 褐飞虱 RNA干扰 糖原合成酶激酶3 糖原与海藻糖代谢 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
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脉冲电磁场促进成骨细胞成熟分化依赖于初级纤毛-PI3K/AKT途径 预览
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作者 任茜 周建 +1 位作者 王鸣刚 陈克明 《北京大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期245-251,共7页
目的:研究脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields, PEMF)促进大鼠成骨细胞成熟分化是否与初级纤毛和PI3K/AKT途径相关,探讨PEMF促进骨形成的作用机制。方法:用酶解法获取新生SD大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts, ROB), 50... 目的:研究脉冲电磁场(pulse electromagnetic fields, PEMF)促进大鼠成骨细胞成熟分化是否与初级纤毛和PI3K/AKT途径相关,探讨PEMF促进骨形成的作用机制。方法:用酶解法获取新生SD大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts, ROB), 50 Hz、0.6 mT PEMF处理0、0.5、1、1.5和2 h后检测磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)蛋白表达量及初级纤毛长度和发生率的变化情况;用LY294002阻断PI3K/AKT信号途径,观察PEMF促进ROB成骨性分化是否受到影响;以RNAi法干扰IFT88的基因表达以抑制初级纤毛发生,观察PEMF激活的PI3K/AKT信号途径及ROB的成骨性分化是否受到影响。成骨性分化指标包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,real-time PCR法和Western blot法检测的成骨性相关基因BMP-2、COL-1和OSX的基因表达量,以及钙化结节数量等。结果:经PEMF处理0、0.5、1、1.5、2 h后,ROB的PI3K、AKT蛋白表达量升高( P <0.01),初级纤毛变长;其中PI3K在0.5 h时蛋白表达量达到最高,随着PEMF处理时间增加,蛋白表达量降低;AKT在0.5 h和1.5 h时蛋白表达量较高。用PI3K阻断剂LY294002阻断PI3K/AKT信号途径后,PEMF不再能提高成骨细胞中ALP 活性和成骨性相关基因BMP-2、COL-1、OSX的基因表达量,但在阻断前PEMF能增加ROB中ALP活性和成骨性相关基因的表达;RNAi干扰初级纤毛发生后,PEMF不再能增加PI3K的蛋白表达量,说明初级纤毛干扰后,PEMF不能激活PI3K/AKT信号途径;其次,PEMF提高ALP活性的作用消失,也不能提高BMP-2、COL-1和OSX的基因表达量,其增加ROB钙化结节形成能力的作用也消失,说明初级纤毛干扰后,PEMF促进成骨细胞成熟矿化的能力消失。结论: PEMF通过成骨细胞表面的初级纤毛激活了PI3K/AKT信号途径,进而发挥了骨形成活性的促进作用。 展开更多
关键词 脉冲电磁场 成骨细胞 RNA干扰 PI3K
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腺病毒介导短发夹RNA沉默Nkx2.5基因对乳鼠心肌细胞的影响
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作者 杨安康 谌晶晶 +3 位作者 罗强 张健 杨媚 黄从新 《中国心脏起搏与心电生理杂志》 2019年第1期39-44,共6页
目的探讨腺病毒介导短发夹RNA下调Nkx2.5基因表达对体外培养大鼠乳鼠心肌细胞(NRVMs)的影响。方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离NRVMs,随机分为阴性对照组(NC组)和实验组。实验组转染携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列(短发夹RNA,shRNA... 目的探讨腺病毒介导短发夹RNA下调Nkx2.5基因表达对体外培养大鼠乳鼠心肌细胞(NRVMs)的影响。方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离NRVMs,随机分为阴性对照组(NC组)和实验组。实验组转染携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列(短发夹RNA,shRNA)和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒Ad-Nkx2.5-shRNA-GFP,NC组转染等量的仅携带GFP的对照组腺病毒Ad-GFP。以不同感染复数(MOI)转染细胞选取最适MOI,按最适MOI转染NRVMs 48h后,采用实时荧光聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测Nkx2.5沉默效果,保证沉默效果之后,检测起搏细胞发育相关转录因子(Tbx3、Tbx18、Shox2和Isl1)、起搏相关离子通道超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)和缝隙链接蛋白40(Cx40)mRNA和蛋白水平变化,采取免疫荧光法检测HCN4蛋白的表达。结果分离培养的原代NRVMs 48h呈现成簇搏动,α-actin检测心肌纯度达0.91±0.01,转染NRVMs的最适MOI=20,构建的病毒可有效下调Nkx2.5水平(P<0.05);下调心肌细胞Nkx2.5水平后,起搏细胞发育相关转录因子、HCN4表达水平升高(P<0.05),心室肌相关缝隙连接蛋白Cx40表达水平下降(P<0.05)。荧光显微镜观察实验组红色荧光即离子通道HCN4表达强于对照组。结论下调Nkx2.5可将NRVMs重编程为起搏样细胞。 展开更多
关键词 心血管病学 腺病毒载体 RNA干扰 NKX2.5 心肌细胞 生物起搏
肢体和心脏发育基因在前列腺癌中的表达
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作者 朱东风 王雷 赫志强 《中华男科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期22-28,共7页
目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa ... 目的:探讨肢体和心脏发育(LBH)基因的表达在前列腺癌中的作用。方法:采用实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫组化(IHC)和Western印迹方法检测20例前列腺癌与正常前列腺组织中LBH的表达;构建si RNA-1、si RNA-2和阴性对照序列转染PC-3、LNCa P前列腺癌细胞以沉默LBH的表达,采用CCK-8、Transwell小室法观察细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:q PCR检测结果显示前列腺癌组织中LBHm RNA表达水平明显高于正常前列腺组织(4. 8±2. 4 vs 1. 8±1. 1,P=0. 032);IHC结果显示LBH蛋白在前列腺癌组织中表达阳性率为90. 0%(18/20),正常前列腺组织中为15. 0%(3/20),差异具有统计学意义(P=0. 006);Western印迹结果也显示前列腺癌组织中LBH表达显著高于正常前列腺组织(3. 5±1. 2 vs 1. 3±0. 6,P=0. 019)。干扰LBH表达后,PC-3和LNCa P细胞的增殖能力均显著下降,96 h时,PC-3细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值显著低于阴性对照组(1. 2±0. 1、1. 1±0. 1 vs 1. 8±0. 2,P <0. 01);LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组的A450值也显著低于阴性对照组(1. 4±0. 2、1. 1±0. 2 vs 1. 9±0. 2,P <0. 01)。细胞迁移实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(55. 5±6. 4)、(44. 9±4. 5)个vs (175. 6±25. 8)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(40. 2±8. 2)个vs (125. 3±13. 5),P <0. 05]。细胞侵袭实验显示,si RNA转染PC-3细胞后,si RNA-1和si RNA-2组透过基底膜的细胞数显著低于阴性对照组[(82. 5±7. 5)、(68. 4±5. 5)个vs (138. 2±10. 7)个,P <0. 05];LNCa P细胞中si RNA-1和si RNA-2组也显著低于阴性对照组[(46. 4±5. 8)、(23. 1±6. 2)个vs (92. 1±10. 5)个,P <0. 05]。结论:高表达的LBH可能在前列腺癌的发病过程中发挥重要作用,可作为前列腺癌治疗的潜在靶标。 展开更多
关键词 前列腺癌 肢体和心脏发育基因 RNA干扰 细胞增殖 细胞迁移 细胞侵袭
慢病毒介导HIF-1α 沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响
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作者 李国平 刘丽璇 +3 位作者 蒲泽锦 胡敏敏 黄聪武 吴灵飞 《武汉大学学报:医学版》 CAS 2019年第1期27-32,104共7页
目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病... 目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/LCoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用WesternBlot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。WesternBlot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③WesternBlot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。 展开更多
关键词 慢病毒 SHRNA RNA干扰 HEPG2细胞 HIF-1Α
RNA干扰abcg-5基因对犬弓首蛔虫感染性的影响
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作者 罗永莉 江艾耘 +4 位作者 胡志刚 李相兰 杨晓迪 旷策嫣 周荣琼 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期390-397,共8页
为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(ATP-binding cassette G5,abcg-5)的功能,通过体外合成Tc-abcg-5基因的特异性siRNA,利用RNAi技术对T.canis的成虫和虫卵进行干扰。结果显示,干扰24、48h后siRNA-744组T... 为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)腺苷三磷酸结合盒G5基因(ATP-binding cassette G5,abcg-5)的功能,通过体外合成Tc-abcg-5基因的特异性siRNA,利用RNAi技术对T.canis的成虫和虫卵进行干扰。结果显示,干扰24、48h后siRNA-744组Tc-abcg-5的相对表达量比siRNA-1020组和siRNA-432组显著性降低,表明siRNA-744有较高的沉默效率。采用电穿孔法和浸泡法对siRNA-744的递送效率进行比较,结果显示浸泡法更有利于将siRNA-744导入到T.canis虫卵内。用siRNA-744经浸泡法干扰T.canis感染性虫卵,经口灌服小鼠,感染后第7天对小鼠的脑、肝和肺组织进行病理学研究,结果显示RNA干扰使T.canis感染性虫卵的感染力下降,从而降低了肺、肝的病变程度。研究表明Tc-abcg-5基因可能通过影响虫卵的发育从而参与T.canis的生长、发育过程。 展开更多
关键词 犬弓首蛔虫 abcg-5基因 RNA干扰
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甜菜内向整流K^+通道BvAKT1基因RNAi载体的构建
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作者 伍国强 刘海龙 +2 位作者 李胜胜 蔺丽媛 谢玲玲 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期112-118,共7页
植物细胞质中维持较高的K^+/Na^+是植物抵御盐胁迫的有效策略之一。内向整流K+通道AKT1(Arabidopsis K^+transporter)在这一过程中发挥着重要作用。本研究以嗜盐作物甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗为材料,提取其根总RNA,采用RT-PCR方法扩... 植物细胞质中维持较高的K^+/Na^+是植物抵御盐胁迫的有效策略之一。内向整流K+通道AKT1(Arabidopsis K^+transporter)在这一过程中发挥着重要作用。本研究以嗜盐作物甜菜(Beta vulgaris L.)幼苗为材料,提取其根总RNA,采用RT-PCR方法扩增得到甜菜K^+通道BvAKT1基因的RNAi靶片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法构建了由CaMV 35S启动子驱动、含BvAKT1基因片段反向重复序列的RNAi (RNA interference)植物表达载体pART-BvAKT1-RNAi,采用冻融法将其分别导入根癌农杆菌GV3101和发根农杆菌LBA9402,对揭示BvAKT1在甜菜K^+吸收及离子稳态平衡中的作用研究具有推动作用。 展开更多
关键词 甜菜 内向整流K^+通道 K^+吸收 RNA干扰
花绒寄甲成虫3条Mthl基因及Mth-like 2-5干扰效果研究 预览
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作者 李小辉 张正青 +3 位作者 胡宏焰 单聪聪 Dinh Ngoc Hien 李孟楼 《西北林学院学报》 CSCD 北大核心 2019年第2期170-178,共9页
筛选花绒寄甲成虫高表达的mthl基因,注射目标基因dsRNA,以确定干扰效果并解析其功能。合成花绒寄甲成虫目标基因mthl保守序列的dsRNA,分别注射0.3、1.2μg/μL和4.8μg/μL的dsRNA,利用实时荧光定量PCR技术检测目标基因的表达量,记录处... 筛选花绒寄甲成虫高表达的mthl基因,注射目标基因dsRNA,以确定干扰效果并解析其功能。合成花绒寄甲成虫目标基因mthl保守序列的dsRNA,分别注射0.3、1.2μg/μL和4.8μg/μL的dsRNA,利用实时荧光定量PCR技术检测目标基因的表达量,记录处理组虫体的体重、存活率和雌虫产卵情况。从花绒寄甲转录组数据库中分别鉴定出Mthlike11、Mth-like 2-4、Mth-like2-5基因。注射目标基因Mth-like 2-5的长度约400bp的dsRNA,对目标基因表达干扰效果显著,但干扰过程中雌雄虫均具有应激表达反应。其中0.3μg/μL低浓度dsRNA对目标基因干扰效果差,应激高表达反应明显;1.2μg/μL中等浓度dsRNA对目标基因有显著的干扰效果,应激高表达反应弱、引起的体重下降和死亡率较小,雌虫产卵期推迟;4.8μg/μL高浓度dsRNA干扰效果显著,引起的体重下降和死亡率较高,雌虫难以产卵。注射Mth-like 2-5dsRNA可影响Mth-like2-5基因的正常表达和转录,随dsRNA浓度增大和处理后时间的延长,目标基因表达量、雌雄成虫体重明显降低,死亡率增高,雌成虫产卵期推迟或难以产卵。 展开更多
关键词 花绒寄甲成虫 Mthl基因 Mth-like 2-5基因 RNA干扰
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蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达 预览
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作者 生欣 王俊华 +3 位作者 刘月华 郜双林 谢夏丹 范芳 《中国现代医学杂志》 CAS 2019年第1期15-22,共8页
目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链... 目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(hUVECs)稳定表达。方法①聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;②以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的hUVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(hUVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。③通过qRT-PCR与Western blotting检测分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果①插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。②病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×10^8、2×10^8和1×10^8TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。③干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P<0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代hUVECs中稳定表达。 展开更多
关键词 蓬乱蛋白2/Wnt蛋白质类 慢病毒载体 内皮细胞 RNA干扰 过表达
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多靶向沉默里氏木霉碳代谢阻遏物对纤维素酶活性和表达的调控研究
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作者 邓嘉雯 高云雨 +3 位作者 刘旭坤 张珂珂 钟路遥 田生礼 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期730-743,共14页
【目的】构建多靶向siRNA表达载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1、CRE2、CRE3和CRE4进行同时多靶向siRNA干扰,以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。【方法】根据此前研究筛选出沉默cre1、cre2、cre3和cre4基因的4个最佳siRN... 【目的】构建多靶向siRNA表达载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子CRE1、CRE2、CRE3和CRE4进行同时多靶向siRNA干扰,以研究其对里氏木霉纤维素酶基因表达的调控作用。【方法】根据此前研究筛选出沉默cre1、cre2、cre3和cre4基因的4个最佳siRNA序列,设计并构建了A多靶向表达载体,另根据cre1、cre2、cre3和cre4基因中所含有的5个共有序列设计并构建了B多靶向表达载体,将两者转化至里氏木霉QM9414。经筛选后分别在48 h和120 h对各转化子进行纤维素酶酶活力测试(CMC活力测试和滤纸酶酶活力测试)及利用qPCR检测相关基因的表达。【结果】通过RT-qPCR测定结果表明,两种表达载体均可同时抑制里氏木霉的分解代谢物阻遏基因cre1、cre2、cre3和cre4的表达,纤维素酶活力比出发菌株明显升高,多靶向抑制菌株的CMC酶活和滤纸酶活比出发菌株平均提高了1.95倍和2.66倍。纤维素酶基因cbh1和egl1的表达水平比出发菌株也有明显提升,平均提高了3.83倍和3.95倍。纤维素酶相关基因xyr1的表达水平与出发菌株相比也明显上升,平均提高了2.78倍。【结论】多靶向沉默里氏木霉的碳代谢阻遏蛋白有利于解除葡萄糖效应,提高非还原糖的利用,从而提高纤维素酶的产量,使纤维素酶的表达得到更大的提升,为里氏木霉表达纤维素酶在分解代谢物阻遏基因调控方面提供了实验依据和新的技术思路。 展开更多
关键词 里氏木霉 RNA干扰 碳代谢阻遏物 纤维素酶
RNAi在害虫防治中应用的重要进展及存在问题 预览
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作者 胡少茹 关若冰 +1 位作者 李海超 苗雪霞 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期506-515,共10页
RNAi是目前最有可能应用于害虫绿色防控的新技术。2017年6月,美国环境署(EPA)批准了国际上第一例表达昆虫双链RNA(dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411,掀起了利用RNAi技术进行害虫防治研究新的热潮。但是,目前RNAi在害虫防治中的应用还存... RNAi是目前最有可能应用于害虫绿色防控的新技术。2017年6月,美国环境署(EPA)批准了国际上第一例表达昆虫双链RNA(dsRNA)的抗虫转基因玉米MON87411,掀起了利用RNAi技术进行害虫防治研究新的热潮。但是,目前RNAi在害虫防治中的应用还存在一些问题,例如有效靶标基因筛选和应用策略,鳞翅目昆虫对RNAi的敏感性以及双链RNA在环境中的稳定性等等。本文系统总结了RNA干扰现象发现20年来,该技术在害虫防治领域的研究及应用概况,并对RNAi技术应用的可行性、应用方法、存在问题和目前的一些解决办法进行了比较详细的综述。通过对近期研究结果的综合分析发现,dsRNA进入某些鳞翅目昆虫中肠或血淋巴后,被相关核酸酶降解可能是其RNAi效率较低的首要原因。通过对dsRNA进行脂质体修饰,纳米粒子包埋可以在一定程度上解决dsRNA降解的问题,进而提高RNAi效率。 展开更多
关键词 RNA干扰 害虫防治 基因功能 双链RNA 脂质体 纳米粒子
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近零磁场下干扰磁响应关键基因对褐飞虱寿命的影响 预览
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作者 贺静澜 张明 +3 位作者 刘瑞莹 万贵钧 潘卫东 陈法军 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期45-55,共11页
【目的】隐花色素(cryptochrome, Cry)和铁硫簇蛋白IscA(iron-sulfur cluster assembly,即MagR)是生物体内潜在的磁受体蛋白,本研究通过RNA干扰(RNAi)技术,分别敲减褐飞虱(Nilaparvata lugens)体内的磁响应关键基因NlCry1、NlCry2和NlMa... 【目的】隐花色素(cryptochrome, Cry)和铁硫簇蛋白IscA(iron-sulfur cluster assembly,即MagR)是生物体内潜在的磁受体蛋白,本研究通过RNA干扰(RNAi)技术,分别敲减褐飞虱(Nilaparvata lugens)体内的磁响应关键基因NlCry1、NlCry2和NlMagR,旨在探明近零磁场(near-zero magnetic field,NZMF)环境下,以上3种基因在褐飞虱寿命调节过程中的作用,从而间接探讨这3种基因对磁场的响应情况。【方法】采用RNAi技术,以实验室正常磁场环境下稳定饲养的短翅初羽化褐飞虱雌雄成虫为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制磁响应关键基因NlCry1、NlCry2和NlMagR,随后立即分别放入正常磁场(geomagnetic field,GMF)和近零磁场中,于每日相同时间观察记录试虫寿命。同时于注射后的1、2和3 d通过RNAiso Plus法提取GMF中褐飞虱雌成虫总RNA,反转录合成第一链DNA,后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测该基因的表达情况,以确定基因干扰效率。【结果】注射ds NlCry1后,褐飞虱雌雄成虫寿命在近零磁场和正常磁场间均无显著差异。注射ds NlCry2后,近零磁场中褐飞虱雌雄成虫寿命比正常磁场分别显著延长27.78%和50.04%;此外,与注射ds GFP处理相比,正常磁场下注射ds NlCry2的雌成虫寿命缩短,而近零磁场下注射ds NlCry2的雌成虫寿命延长,但二者差异均不显著;近零磁场和正常磁场下注射ds NlCry2的雄成虫寿命均缩短(25.41%和10.73%),且正常磁场下差异显著。近零磁场中,注射ds NlMagR的雌成虫寿命较注射ds GFP的寿命显著缩短了16.48%,而雄成虫寿命在磁场间、干扰处理间的差异均不显著。【结论】磁场变化下褐飞虱雌雄成虫体内3种磁响应关键基因对其寿命的调节功能存在差异。其中,NlCry2对磁场变化存在敏感响应,表现为敲减该基因与磁场变化的互作显著地影响雌雄成虫寿命,且表现出"性二型性";NlMagR也可对磁场变化产生明显响应,但该响 展开更多
关键词 磁场强度变化 褐飞虱 磁响应基因 RNA干扰 成虫寿命 磁生物学效应
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