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金柑花蕾酵母双杂交cDNA文库构建及评价
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作者 苏玲 李彬 +3 位作者 王青 胡颖 罗聪 何新华 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期3169-3173,共5页
为了探索金柑花发育的分子机制并研究与金柑花发育相关重要基因编码的蛋白质之间的相互作用,本研究以融安金柑不同生长时期的花蕾为材料,采用SMART技术构建了cDNA文库,对该文库进行了鉴定评价。经检测,所构建的cDNA文库滴度为2.83×... 为了探索金柑花发育的分子机制并研究与金柑花发育相关重要基因编码的蛋白质之间的相互作用,本研究以融安金柑不同生长时期的花蕾为材料,采用SMART技术构建了cDNA文库,对该文库进行了鉴定评价。经检测,所构建的cDNA文库滴度为2.83×10^8cfu/mL,文库库容为1.42×10^10cfu,重组率为97.91%,插入的双链cDNA片段长度主要分布在250~2 000 bp之间。结果表明,该文库达到了建库标准,理论上涵盖了全部与融安金柑花蕾发育相关的基因,为后续利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白提供了物质基础。 展开更多
关键词 金柑 CDNA文库 SMART技术 酵母双杂交技术
人包皮成纤维细胞酵母双杂交均一化cDNA文库的构建
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作者 王龙江 魏庆宽 +7 位作者 黄炳成 李瑾 尹昆 刘功振 崔勇 徐超 肖婷 孙慧 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第1期23-26,共4页
目的构建人包皮成纤维细胞(HFF)酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础。方法复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,对其进行均一化处理后,利用SfiI酶切,酶切后... 目的构建人包皮成纤维细胞(HFF)酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础。方法复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,对其进行均一化处理后,利用SfiI酶切,酶切后的ds cDNA连接pGADT7-SfiI三阅读框表达载体,连接产物转化至大肠埃希菌HST08,构建cDNA初级文库,进行库容检测和插入片段的PCR鉴定。提取文库质粒转化至酵母Y187中,制备HFF细胞Y187酵母文库。结果 HFF细胞总RNA的A260/A280值为2.02,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到28S和18S核糖体特异性条带且二者亮度之比为2∶1,提取的RNA完整、质量良好。3种读码框库容分别为1.4×10~6 CFU/ml、1.8×10~6 CFU/ml和2.0×10~6 CFU/ml,重组率为99%。cDNA文库外源基因插入片段长度700~2 000bp。制备的HFF细胞酵母cDNA文库库容量为2.5×10~7 CFU/ml。结论构建的HFF细胞酵母双杂交cDNA文库具有较高的库容量和重组率,可用于弓形虫蛋白与HFF宿主细胞互作蛋白的筛选。 展开更多
关键词 弓形虫 CDNA文库 蛋白互作
肝片吸虫cDNA文库构建及诊断候选抗原基因筛选
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作者 刘天 李新 +4 位作者 宫鹏涛 张西臣 杨举 李赫 李建华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第1期27-31,共5页
目的构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,筛选肝片吸虫病候选诊断抗原基因。方法构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,利用感染肝片吸虫绵羊血清对该文库进行初筛和复筛。挑取阳性噬菌斑,PCR扩增后测序,对测序结果进行生物信息学分析... 目的构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,筛选肝片吸虫病候选诊断抗原基因。方法构建肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,利用感染肝片吸虫绵羊血清对该文库进行初筛和复筛。挑取阳性噬菌斑,PCR扩增后测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果成功构建了肝片吸虫成虫cDNA表达文库,初级文库库容约2×107pfu/800μl,插入片段长度为400bp~2 000bp,重组率约98%。共筛选和鉴定16个阳性噬菌斑,测序分析其中的2个为已报道的诊断抗原基因,4个为新发现的肝片吸虫病候选诊断抗原基因,10个为肝片吸虫未知抗原基因。结论成功构建了肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,筛选获得4个肝片吸虫病候选诊断抗原基因,为肝片吸虫病早期诊断和检测试剂盒的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 肝片吸虫 CDNA文库 免疫学筛选 候选诊断抗原基因
与马立克病病毒编码的miR-M31-3p互作的宿主靶基因筛选与鉴定 预览
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作者 张雅 滕蔓 +4 位作者 李会珍 朱志坚 刘豪丽 罗俊 张改平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期441-448,共8页
血清Ⅰ型马立克病病毒(MDV-1)编码26个病毒miRNA,前期研究发现这些miRNA可能在鸡马立克病肿瘤发生中发挥重要调控作用。为研究MDV-1编码的miRNA基因miR-M31-3p在病毒感染及致病过程中的作用机制,本研究利用杂交PCR方法构建宿主cDNA文库... 血清Ⅰ型马立克病病毒(MDV-1)编码26个病毒miRNA,前期研究发现这些miRNA可能在鸡马立克病肿瘤发生中发挥重要调控作用。为研究MDV-1编码的miRNA基因miR-M31-3p在病毒感染及致病过程中的作用机制,本研究利用杂交PCR方法构建宿主cDNA文库,对与miR-M31-3p互作的宿主候选靶基因进行初步筛选,结果获得了49个候选靶基因。通过双荧光素酶报告试验证实miR-M31-3p与鸡GNPAT、TCF12、FIGNL1、CNDP2、MGST1和CD99L2的3'-UTR在体外存在相互作用。进一步通过qRT-PCR分析显示:过表达miR-M31-3p的CEF中,上述6个候选基因mRNA转录水平均显著下调;当MDV感染CEF时,除CD99L2之外的5个候选靶基因的转录水平均显著下调,而在miR-M31-3p基因缺失的MDV株感染的CEF中这5个靶基因均正常转录。上述结果证实CNDP2、GNPAT、TCF12、FIGNL1和MGST1为与miR-M31-3p互作的宿主靶基因。本研究为进一步揭示miR-M31-3p调控MDV感染宿主的致病机制奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病病毒 miRNA miR-M31-3p 宿主靶基因 CDNA文库
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基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质
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作者 俎瑶琛 刘文文 +1 位作者 刘艳 王锡锋 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期226-234,共9页
为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱c DNA文库进行了筛选。将BYSMV N基因构建到诱饵载体p DHB1上进行表达检... 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱c DNA文库进行了筛选。将BYSMV N基因构建到诱饵载体p DHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体p DHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选p PR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱c DNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。 展开更多
关键词 灰飞虱 大麦黄条点花叶病毒 酵母双杂交 cDNA文库 互作蛋白
中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建 预览
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作者 孙莉 岳金金 +3 位作者 费东亮 李明 马鸣潇 宋铭忻 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期572-577,共6页
【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶... 【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。 展开更多
关键词 中华蜜蜂 cDNA 文库 滴度 酵母双杂交 FullCoV技术 蛋白质相互作用
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SPF鸡肝脏细胞cDNA文库的构建及鉴定
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作者 卢恒 谢芝勋 +5 位作者 谢丽基 黄莉 黄娇玲 王盛 张艳芳 曾婷婷 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期2498-2502,共5页
旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线... 旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化进酵母Y187感受态,以同源重组的方式在酵母细胞内构建鸡肝脏酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,成功构建含有1.70×10~7个重组子的SPF鸡肝脏细胞cDNA文库,插入片段多数在0.4~2.0 kb之间,重组率达100%,重组子中平均插入的片段长度为1.0 kb,文库滴度为1.30×10~7 cfu/mL。结果表明,该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为进一步筛选此文库与ARV相互作用的宿主蛋白以及研究其功能提供了数据依据。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 SPF鸡肝 cDNA文库 酵母双杂交 SMART技术
利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白 预览
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作者 王磊 李冉辉 +4 位作者 邓湘赢 戴佩 李玲玲 罗丹 曾焱华 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期38-43,共6页
从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa... 从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考。 展开更多
关键词 生殖支原体 黏附蛋白 酵母双杂交 CDNA文库
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鲫脑组织细胞系酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用 预览
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作者 许晨 周勇 +5 位作者 史玉恒 范玉顶 刘文枝 江南 赵建青 曾令兵 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2019年第1期27-32,共6页
为深入研究鲤疱疹病毒II型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2ORF25... 为深入研究鲤疱疹病毒II型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2ORF25编码蛋白为诱饵,与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交,筛选与其互作的GiCB细胞受体。结果显示:GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×10^6CFU/μg,滴度为1.24×10^6CFU/mL,PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5kb左右。将表达CyHV-2ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后,筛选得到与ORF25编码蛋白相互作用蛋白的阳性克隆,为进一步研究CyHV-2的感染机制奠定了前期基础。 展开更多
关键词 酵母双杂交 鲫脑组织细胞cDNA文库 鲤疱疹病毒II型ORF25编码蛋白 蛋白质的互作
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猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建 预览
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作者 李慧春 陈鹏飞 +12 位作者 李先斌 丁思嘉 王康 张文超 杨德强 李林 徐晶晶 虞凌雪 姜一峰 高飞 于海 童光志 周艳君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第2期19-24,共6页
猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,... 猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrierDNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECscDNA文库其库容量为1.3×10^8pfu/mL,插入cDNA片段长度为250~2500bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECscDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪小肠上皮细胞 酵母双杂交cDNA文库
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鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选 预览
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作者 叶丽娜 谢芝勋 +8 位作者 谢丽基 王盛 邓显文 谢志勤 范晴 黄娇玲 曾婷婷 张艳芳 罗思思 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1362-1368,共7页
【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds ... 【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×10^6CFU,文库滴度为3.1×10^8 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARV σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 σA蛋白 CDNA文库 互作蛋白 酵母双杂交
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Construction of Suppression Subtractive Hybridization Library for Testis of Male Tilapia Under the Stress of Methomyl 预览
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作者 Shunlong MENG Tao LIU +4 位作者 Chao SONG Cong ZHANG Liping QIU Jiazhang CHEN Pao XU 《农业生物技术:英文版》 CAS 2019年第3期73-77,共5页
[Objectives]This study was conducted to construct forward and reserve libraries of suppression subtractive hybridization (SSH) in the testis of male tilapia under the stress of methomyl by using SSH technology.[Method... [Objectives]This study was conducted to construct forward and reserve libraries of suppression subtractive hybridization (SSH) in the testis of male tilapia under the stress of methomyl by using SSH technology.[Methods]Using male tilapia as the test animal,the forward and reserve libraries of SSH in the testis of tilapia under the stress of methomyl were constructed by using the SSH technology.[Results]45 expressed sequence tags (ESTs) were obtained,and 25 expressed sequence tags were successfully noted,including 13 forward libraries and 12 reverse libraries.The genes with confirmed functions were classified into five types.Genes related to catalytic activity and cell characteristics were up-regulated,while genes related to structural molecule's activity and biological process were down-regulated.The expression amount of integrin β1 was up-regulated,while serine/threonine protein kinase pim-3,Ca^2+-ATPase,Na^+-K^+-ATPase and ribosomal protein L22 were down-regulated.[Conclusions]The research results could lay a foundation for revealing the molecular mechanism of methomyl's reproductive toxicity to tilapia. 展开更多
关键词 METHOMYL TILAPIA SUPPRESSION subtractive HYBRIDIZATION cDNA LIBRARY TESTIS
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Generation and characterization of expressed sequence tags (ESTs) from coralloid root cDNA library of Cycas debaoensis
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作者 Yunhua Wang Nan Li +1 位作者 Ting Chen Yiqing Gong 《植物多样性:英文版》 CSCD 2018年第5期245-252,共8页
关键词 双特异性核酸酶 植物学 生态系统 科学研究工作
黑斑蛙肝脏和脾脏组织cDNA文库的构建与测序 预览
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作者 刘正权 唐娟 +7 位作者 陆香君 刘文丽 蒋锦晓 吴应珠 王娇娇 牛丽丽 张杭君 贾秀英 《杭州师范大学学报:自然科学版》 CAS 2018年第6期591-596,共6页
为丰富黑斑蛙转录组信息,运用Illumina测序技术构建了黑斑蛙肝脏和脾脏组织的cDNA文库,并对其进行测序.经热带爪蟾blastx比对数据库比对,共得到11 626条非重复序列.经Genebank数据库blastx比对验证,获得了6 701条非重复序列.该结果为黑... 为丰富黑斑蛙转录组信息,运用Illumina测序技术构建了黑斑蛙肝脏和脾脏组织的cDNA文库,并对其进行测序.经热带爪蟾blastx比对数据库比对,共得到11 626条非重复序列.经Genebank数据库blastx比对验证,获得了6 701条非重复序列.该结果为黑斑蛙的生态毒理学研究提供了分子生物学信息. 展开更多
关键词 黑斑蛙 肝脏 脾脏 CDNA文库 ILLUMINA COG分类
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自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞全长cDNA文库的构建 预览
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作者 度尧 谢德胜 陈云天 《贵州医药》 CAS 2018年第11期1289-1291,1409共4页
目的 成功构建自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞cDNA文库,同时进行文库的鉴定。方法 分离自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞并提取总RNA,利用SMART技术构建全长cDNA文库并进行文库质量的鉴定,最后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑鉴定插... 目的 成功构建自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞cDNA文库,同时进行文库的鉴定。方法 分离自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞并提取总RNA,利用SMART技术构建全长cDNA文库并进行文库质量的鉴定,最后扩增文库并随机挑取10个噬菌斑鉴定插入片段大小。结果 构建的cDNA文库滴度为3.4×10^8 pfu/mL,重组率〉97%,文库经过扩增后滴度达6.6×10^11pfu/mL,插入片段长度在0.5-2.0kb之间,平均长度为1.25kb。结论 本文构建的自身免疫性肝炎患者外周血淋巴细胞cDNA文库符合建库要求,为进一步筛选、克隆其发病相关基因、探索发病机制奠定基础。 展开更多
关键词 自身免疫性肝炎 CDNA文库 基因
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米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选 预览 被引量:1
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作者 白凤麟1 段永红 +1 位作者 王志军 雷海英 《西北植物学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期598-606,共9页
阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米( Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART 技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7 为载体的酵母双杂交 cDNA 文库;依据 ZmCEN... 阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米( Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用SMART 技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7 为载体的酵母双杂交 cDNA 文库;依据 ZmCEN 基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7- ZmCEN )转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b (TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建 ZmCEN -pSPYNE 和 TON1b -pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用 Uniprot 和 KEGG 在线网站对互作蛋白进行 gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×10^7CFU,文库滴度5.36×10^8 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA 文库经测序和 Blast 比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO 注释显示互作蛋白参与的生物过程有 21 种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 ZmCEN SMART技术 CDNA文库 酵母双杂交 BIFC GO分析
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利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库 预览
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作者 李玲玲 余敏君 +5 位作者 邓湘赢 戴佩 朱翠明 罗丹 廖雅婷 曾焱华 《中南医学科学杂志》 CAS 2018年第5期478-481,共4页
利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库.Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将... 利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库.Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性.本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础. 展开更多
关键词 膜蛋白酵母双杂交 人尿道上皮细胞 CDNA文库
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香蕉cDNA文库构建及镉胁迫耐受基因的初步筛选
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作者 陈晓 叶玉妍 杨礼香 《分子植物育种》 CSCD 北大核心 2018年第22期7322-7328,共7页
为分离香蕉镉胁迫耐受相关基因,以香蕉为材料,用100μmol/L氯化镉处理诱导香蕉根系3 d,利用gateway技术构建香蕉c DNA文库。经检测,文库滴度为2.0×106 CFU/m L,库容量为8.0×106 CFU/m L,插入平均片段大于1 kb,片段分布在500~... 为分离香蕉镉胁迫耐受相关基因,以香蕉为材料,用100μmol/L氯化镉处理诱导香蕉根系3 d,利用gateway技术构建香蕉c DNA文库。经检测,文库滴度为2.0×106 CFU/m L,库容量为8.0×106 CFU/m L,插入平均片段大于1 kb,片段分布在500~2 000 bp,重组率为100%。将该文库质粒转入对Cd敏感的酵母突变株ycf1Δ,采用FOX技术(Full-length c DNA over-expression gene hunting system)进行筛选,同时进行酵母互补实验功能验证,获得1个能够恢复ycf1Δ对镉敏感表型的重组质粒,测序分析得到此重组质粒包含的cDNA全长序列是香蕉快速碱化因子(MaRALF)。结果认为此基因为香蕉体内编码Cd耐受的候选基因。本研究为香蕉MaRALF基因挖掘更多的功能及完善香蕉在逆境胁迫环境中的机理提供了理论依据。 展开更多
关键词 CDNA文库 镉胁迫 耐受基因 香蕉
大白菜雄性不育花蕾均一化cDNA文库的构建及评价
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作者 李真真 武佩琪 +4 位作者 程亚雄 宋红霞 李梅兰 侯雷平 许小勇 《植物生理学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期291-296,共6页
以大白菜pol型细胞质雄性不育系16C14花蕾为试验材料,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术合成cDNA,利用DSN(duplex-specific nuclease)对所得cDNA进行均一化处理,之后与pDONR~(TM)/Zeo载体重组并转... 以大白菜pol型细胞质雄性不育系16C14花蕾为试验材料,采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术合成cDNA,利用DSN(duplex-specific nuclease)对所得cDNA进行均一化处理,之后与pDONR~(TM)/Zeo载体重组并转化DH10B大肠杆菌菌株,构建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文库。经检测,文库滴度为3.2×10~6 cfu·mL^-1,库容量约为1.28×10~7 cfu,重组率97%,插入片段平均大小1.2 kb左右。随机挑选100个阳性菌斑进行测序,冗余度仅为3.7%,文库质量较高。本研究成功构建了大白菜胞质雄性不育系花蕾均一化cDNA文库,为进一步研究大白菜pol雄性不育相关分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 大白菜 细胞质雄性不育 pol型 CDNA文库 均一化
紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析 预览
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作者 晏云涛 吕瑞青 +4 位作者 石莲琴 杨建发 段纲 邹丰才 项勋 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第9期2347-2357,共11页
为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术(SSH)筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的... 为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术(SSH)筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因(Unigenes),其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。 展开更多
关键词 鸡柔嫩艾美耳球虫 紫茎泽兰 抑制消减杂交 CDNA文库 差异基因
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