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多形拟杆菌肝素酶I的SUMO融合表达及酶学特性分析
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作者 张川 张悦 +3 位作者 丁啸虎 李中媛 宋亚囝 罗学刚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期1318-1330,共13页
【目的】克隆多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron) Heparinase I基因,在大肠杆菌(Escherichiac。")中进行基因工程表达获得重组酶SUMO-Bt-HepI和Bt-HepI,并研究其酶学特性。【方法】对B.thetaiotaomicron肝素酶I (Bt-HepI)... 【目的】克隆多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron) Heparinase I基因,在大肠杆菌(Escherichiac。")中进行基因工程表达获得重组酶SUMO-Bt-HepI和Bt-HepI,并研究其酶学特性。【方法】对B.thetaiotaomicron肝素酶I (Bt-HepI)的基因序列进行密码子优化,PCR扩增得到目的基因,构建表达载体pET-28a-Bt-HepI和pE-SUMO-Bt-HepI,并转化至E. colt Rosetta (DE3)进行表达,分别得到重组产物Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI,以肝素钠为底物研究两者的酶学性质。【结果】SDS-PAGE检测显示Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI的分子量大小分别约为42.5 kDa和55 kDa。与Bt-HepI相比,融合SUMO-Tag后的肝素酶I比酶活提高了 48.9%。酶学性质表明:Bt-HepI和SUMO-Bt-HepI的最适pH和温度均为pH 9、45℃,二者在pH 5-9都具有很好的稳定性,但pH<5时,SUMO-Bt-HepI的耐酸性明显高于Bt-HepI0同时,在温度低于50 ℃时,SUMO-Bt-HepI的比酶活高于Bt-Hepl。此外,Ca^2+和Mg^2+对重组肝素酶I具有明显的促进作用,而CU^2+、Mr^2+、Zt^2+则表现出一定的抑制作用,提示在多形拟杆菌肝素酶I的结构中除了存在已知的Ca2+结合位点外,可能还存在Mg2+的结合位点。【结论】本研究首次将多形拟杆菌来源的肝素酶I和SUMO-Tag进行了融合表达,使其比酶活得到了显著的提高,为其生产应用奠定了基础。 展开更多
关键词 多形拟杆菌 肝素酶I SUMO-Tag 融合表达 酶学性质
盘尾丝虫ASP1蛋白佐剂活性区不同标签融合表达与佐剂活性比较 预览
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作者 胡威 卢会鹏 +4 位作者 张晓凯 李洋洋 张鑫宇 夏晓莉 孙怀昌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第3期44-50,共7页
为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,... 为了探明纯化标签对盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1(activation-associated secreted protein 1,ASP1)佐剂活性的影响,将其佐剂活性区PR-1编码序列分别与类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)、ELK16自聚肽或His标签进行融合表达,用相变循环、离心洗涤和镍亲和层析进行融合蛋白纯化;将ELP与传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因片段进行融合表达,用蛋白酶切除ELP标签后与不同标签融合PR-1免疫小鼠,两次免疫后不同时间采血分离血清,采用ELISA检测VP2特异IgG、IgG1和IgG2c滴度,用试剂盒检测免疫小鼠血清的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10浓度。结果显示,ELP-PR1、ELK-PR1、His-PR1和ELP-VP2融合蛋白在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化蛋白纯度大于90%;3种标签融合PR-1均能增强免疫小鼠的抗原特异IgG、IgG1和IgG2应答,并能刺激小鼠产生IFN-γ、TNF-α、IL-6或IL-10细胞因子。在3种PR-1融合蛋白中,ELP-PR1的佐剂活性最强,ELK-PR1与不完全弗氏佐剂相当。本研究探索了不同纯化标签对PR-1免疫佐剂活性的影响,为传染性法氏囊病新型亚单位疫苗佐剂研制提供思路。 展开更多
关键词 盘尾丝虫活化相关分泌蛋白1 PR-1佐剂活性区 融合标签 佐剂
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基于Spyligase技术的禽流感血凝素H5HA10多聚体抗原的高效制备 预览
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作者 贾宾 陈慧心 +3 位作者 韩莹倩 郭玉堃 邵科宇 郭豫杰 《江西农业学报》 CAS 2019年第3期1-9,共9页
利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促... 利用Spyligase技术在H5HA10序列的C端和N端分别加上SpyTag和KTag序列,并分别与His6-ArsC、His6-PAS200、His6-XTEN、His6-PEAT、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、SiTag3-PAS200、SiTag3-XTEN和SiTag3-ArsC促溶标签相连,成功构建了含9种不同促溶性标签的H5HA10重组表达载体,同时构建了1种含有Cherry标签的Spyligase重组表达载体。将这10种重组载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和SDS-PAGE分析,筛选出可以显著促进H5HA10重组蛋白表达的融合标签ArsC。通过优化诱导表达条件,在大量诱导表达、纯化后成功获得了高纯度的H5HA10和Spyligase重组蛋白,最终在PCT缓冲体系中, Spyligase促使H5HA10重组蛋白的蛋白聚合,形成了环化单体、三聚体、六聚体以及九聚体。 展开更多
关键词 Spyligase技术 流感血凝素H5HA10 原核表达 融合标签 多聚体
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拟南芥AtIDD4与3×Flag融合蛋白表达植株的构建及其鉴定 预览
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作者 吴嘉 杨红玉 +4 位作者 乔菊香 张国斌 陈俊丞 黄琼 王云月 《西南林业大学学报》 CAS 北大核心 2019年第4期89-95,共7页
为了利用染色质免疫共沉淀技术研究转录因子AtIDD4蛋白与下游DNA的互作,通过构建35S-AtIDD4CDS-3×Flag农杆菌原核表达载体,利用农杆菌花浸法将35S-AtIDD4CDS-3×Flag结构转入野生型拟南芥中,实现ATIDD4和3×Flag标签的共... 为了利用染色质免疫共沉淀技术研究转录因子AtIDD4蛋白与下游DNA的互作,通过构建35S-AtIDD4CDS-3×Flag农杆菌原核表达载体,利用农杆菌花浸法将35S-AtIDD4CDS-3×Flag结构转入野生型拟南芥中,实现ATIDD4和3×Flag标签的共表达和超表达。结果表明:通过PCR扩增、DNA测序、实时荧光定量RT-PCR等方法对转基因突变体进行鉴定,3×Flag标签与AtIDD4共表达,同时AtIDD4基因的表达量显著提高。 展开更多
关键词 3×Flag 融合标签 农杆菌 转基因 拟南芥
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三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响 预览
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作者 文继锋 申欢欢 +4 位作者 龚永平 易可可 杨智捷 邓英 颜其贵 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第7期1073-1078,共6页
大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表... 大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的 VP 6、 VP 7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。 展开更多
关键词 大熊猫轮状病毒(GPRV) VP6-VP7蛋白 融合标签 醛缩酶
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重组角质细胞生长因子(KGF)的原核表达及优化 预览
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作者 田顺立 郑春阳 《安徽农业科学》 CAS 2018年第33期71-74,共4页
[目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMO-K... [目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子(KGF)的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因,按照大肠杆菌的密码子偏好性,将其进行密码子优化。使用BL21(DE3)菌株表达KGF(ΔN23)、SUMO融合的SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF(ΔN23),并测试不同表达温度(37、23℃)对KGF(ΔN23)表达结果的影响。[结果]在BL21(DE3)菌株中,37℃表达时KGF(ΔN23),SUMO-KGF(ΔN23)和Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)的表达量都较高,其中可溶性蛋白表达量KGF(ΔN23)<SUMO-KGF(ΔN23)<Fh8-SUMO-KGF(ΔN23)。降低诱导温度为23℃后,3种KGF的表达量都显著降低,但是可溶性蛋白的占比显著提高,均接近100%。[结论]降低诱导温度能够促进KGF的可溶性表达,但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达能够提高KGF在37℃表达时可溶性蛋白占比,其中融合Fh8-SUMO标签的KGF表达量和可溶性蛋白占比较高。 展开更多
关键词 角质细胞生长因子(KGF) 原核表达系统 密码子优化 融合表达 标签蛋白
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O型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及纳米样结构观察
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作者 郭玉堃 明胜利 +2 位作者 郭婉莹 杨国宇 郭豫杰 《解剖学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期118-123,共6页
目的本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到13... 目的本实验旨在高效表达可溶性的O型口蹄疫病毒VP1蛋白,并形成纳米样颗粒。方法根据O型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV O/MYA/7/98株的VP1蛋白基因,并进行截短和优化,共73个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Fn)基因片段,将O型口蹄疫病毒VP1蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒VP1蛋白-铁蛋白基因片段,命名为Se Fnt16798。构建了Se Fnt16798融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、Ce HSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选高效可溶性表达的Se Fnt16798融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果实验成功构建9个Se Fnt16798表达载体;9个标签中,MBP与Se Fnt16798蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-Se Fnt16798重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-Se Fnt16798形成了纳米样颗粒。结论本实验建立了稳定获得Se Fnt16798重组蛋白质的方法。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 VP1蛋白 铁蛋白 融合标签 纳米颗粒 电子显微镜 大肠埃希菌
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析
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作者 郭玉堃 郭婉莹 +2 位作者 明胜利 郭豫杰 杨国宇 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第4期609-617,共9页
为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱... 为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计,构建了GP5/M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的GP5/M融合蛋白。重组蛋白通过NiNTAAgarose亲和纯化,免疫家兔,对获得的免抗GP5/M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示,成功构建10个GP5/M表达载体,10个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP—GP5/M重组蛋白质;通过免疫家兔,检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明,试验成功建立了稳定获得GPS/M重组蛋白质的方法,初步鉴定了重组蛋白的免疫效力,为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。 展开更多
关键词 PRRSV GP5/M蛋白 融合标签 免疫原性 中和抗体
O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及电镜检测
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作者 郭玉堃 郭婉莹 +2 位作者 明胜利 杨国宇 郭豫杰 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第7期1265-1271,共7页
本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白,并通过电镜检测,以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列,得到FMDVO/GER/Wup/82株的衣壳蛋白基因,并进行截短和优化,共133个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmone... 本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白,并通过电镜检测,以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列,得到FMDVO/GER/Wup/82株的衣壳蛋白基因,并进行截短和优化,共133个氨基酸;同时,从肠道沙门菌(Salmonella enterica)中分离得到135个氨基酸铁蛋白(Ferritin)基因片段,将O型FMDV衣壳蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了FMDV衣壳蛋白-铁蛋白基因片段,命名为SeFntl6599。构建了SeFnt16599融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、7-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的SeFnt16599融合蛋白。重组蛋白通过Ni—NTA Agarose亲和纯化,进行电镜检测。结果表明,成功构建9种SeFnt16599表达载体;9个标签中,MBP与SeFnt16599蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP—SeFnt16599重组蛋白质;电镜结果显示,MBP—SeFnt16599形成了纳米样颗粒。本试验建立了稳定获得SeFnt16599重组蛋白质的试验方法,为FMDV衣壳蛋白新型结构疫苗的开发及后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 衣壳蛋白 铁蛋白 融合标签 可溶性 纳米颗粒
利用EDA融合标签高效表达猪圆环病毒2型壳蛋白(英文)
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作者 郭婉莹 申欢欢 +1 位作者 刘起涛 郑悦亭 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 北大核心 2018年第2期183-188,共6页
原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表... 原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表达量低等问题。因此,通过使用各种融合标签以增加目的重组蛋白的表达量和溶解性成为有效的方法。本研究通过使用3种融合标签(EDA标签、MBP标签和GST标签)以获得表达量高的可溶性重组表达猪圆环病毒2型壳蛋白;并比较3种融合标签对该蛋白表达量、溶解性和稳定性的影响。研究结果表明,EDA标签可以显著提高重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,并且能够增强该蛋白的稳定性;MBP标签可增强重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,但是不能改善该蛋白的稳定性;GST标签能够增强该重组表达蛋白的表达量,但是不能增强该蛋白的溶解性和稳定性。本研究将EDA作为PCV2-CP蛋白的融合标签,显著提高PCV2-CP-EDA重组蛋白的表达量和增强该重组蛋白的稳定性,为病毒蛋白的可溶性重组表达提供了一种新的融合标签。 展开更多
关键词 重组表达 融合标签 EDA 猪圆环病毒2型壳蛋白
A型口蹄疫病毒1D蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达、纯化及电子显微镜检测
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作者 郭玉堃 明胜利 +2 位作者 郭婉莹 杨国宇 郭豫杰 《解剖学报》 CSCD 北大核心 2017年第6期726-731,共6页
目的 本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法 根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(C... 目的 本实验旨在表达出高可溶性的A型口蹄疫病毒1D蛋白,并通过电子显微镜检测,以期望形成纳米样颗粒。方法 根据A型口蹄疫病毒核酸序列,得到FMDV A/GDMM/CHA/2013株的1D蛋白基因,并进行截短和优化,共132个氨基酸;同时,从结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)中分离得到135个氨基酸的铁蛋白(Fn)基因片段,将A型口蹄疫病毒1D蛋白与铁蛋白串联,设计并合成了口蹄疫病毒1D蛋白-铁蛋白片段,命名为CcFnt166AS。构建了CcFnt166AS融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDSPAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的CcFnt166AS融合蛋白。重组蛋白通过NiNTA Agarose亲和纯化,进行电子显微镜检测。结果 成功构建9种CcFnt166AS表达载体;9个标签中,MBP与CcFnt166AS蛋白相融合的可溶表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-CcFnt166AS重组蛋白质;电子显微镜结果显示,MBP-CcFnt166AS形成了纳米样颗粒。结论 本实验建立了稳定获得CcFnt166AS重组蛋白质的方法。 展开更多
关键词 A型口蹄疫病毒 1D蛋白 铁蛋白 融合标签 可溶性 纳米颗粒 电子显微术 大肠埃希菌
鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析
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作者 李赛赛 郭玉堃 +3 位作者 舒静超 曾磊 郭婉莹 郭豫杰 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2017年第12期2281-2287,共7页
为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别... 为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS—PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1:12800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白 融合标签 可溶性表达 LS3蛋白笼纳米颗粒 免疫原性
新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测
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作者 张伟强 郭豫杰 +3 位作者 李赛赛 王月影 陈丽颖 杨国宇 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期848-855,共8页
目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUM... 目的检测新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,及其免疫活性。方法采用融合表达的方法将HN蛋白基因分别与Grifin、谷胱甘肽S移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Nus A、小泛素样相关修饰物(SUMO)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、蛋白G(protein G)、γ-晶状体蛋白(γ-crystallin)、Ars C、Ppi B 10种融合标签基因采用柔性接头进行连接,构建10个重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,将这10个重组质粒分别转入大肠杆菌BL21中,用不同条件进行诱导表达,经SDS-PAGE检测并选出最佳诱导蛋白表达的条件,筛选出能够显著促进HN蛋白可溶性表达的标签,并用Western blotting对所表达蛋白的含量进行定性分析,同时纯化的重组蛋白用Western blotting和间接ELISA验证其免疫原性。结果成功构建了10个不同融合标签的HN融合蛋白表达载体,筛选出融合标签麦芽糖结合蛋白(MBP)能够显著促进HN蛋白可溶性表达,且Western blotting显示所表达重组蛋白的表达量是最多的。经Western blotting和间接ELISA验证重组HN蛋白具有良好的免疫原性。结论融合标签MBP可以显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。 展开更多
关键词 新城疫病毒 血凝素-神经氨酸酶 融合标签 柔性接头 免疫印迹法 间接ELISA
基于ZigBee和TAG数据融合的生态环境监测系统 预览 被引量:1
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作者 宁菲菲 任洪庆 《微处理机》 2015年第5期27-31,共5页
针对目前生态环境监测工作智能化水平低、实时监管能力差等问题,设计了一个生态环境监测系统。系统采用以CC2530芯片为核心的传感器节点,构建基于ZigBee协议的无线传感器网络,通过ZigBee网络对监测区域内的生态数据信息进行自动采集... 针对目前生态环境监测工作智能化水平低、实时监管能力差等问题,设计了一个生态环境监测系统。系统采用以CC2530芯片为核心的传感器节点,构建基于ZigBee协议的无线传感器网络,通过ZigBee网络对监测区域内的生态数据信息进行自动采集和传送,然后经由GPRS网络将数据传送至中央监控中心进行存储显示。系统实现了对生态数据的实时远程查看和管控,同时,在无线传感器网络内采用基于TAG算法的数据融合策略。模拟结果表明:该数据融合策略的应用有效减少了网络中的数据传输量,从而达到降低节点能耗、延长网络生命期的目的。 展开更多
关键词 ZIGBEE协议 无线传感器网络 TAG算法 数据融合 CC2530芯片 生态环境监测
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小分子泛素相关修饰物SUMO及其融合表达 预览 被引量:1
15
作者 陈相剑 项灵娇 +1 位作者 严雪妮 林陈水 《氨基酸和生物资源》 CAS 2015年第3期21-24,共4页
小分子泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一类具有高度保守序列的低分子量蛋白。在蛋白质的融合表达中,SUMO作为融合标签得到了广泛应用。与其他传统融合标签如谷胱甘肽-S-转移酶、二硫键形成蛋白A、硫氧还蛋白... 小分子泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是一类具有高度保守序列的低分子量蛋白。在蛋白质的融合表达中,SUMO作为融合标签得到了广泛应用。与其他传统融合标签如谷胱甘肽-S-转移酶、二硫键形成蛋白A、硫氧还蛋白等相比,SUMO具有防止蛋白降解、促进蛋白折叠、能被SUMO蛋白酶专一性识别切割并在目的蛋白上不会留下氨基酸残基等优点。本文综述SUMO融合蛋白及其配套的SUMO蛋白酶在融合表达中的优势和应用。 展开更多
关键词 SUMO SUMO蛋白酶1 融合标签 融合表达
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利用SUMO技术表达可溶性的拟南芥AtRD22蛋白 预览 被引量:4
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作者 唐玉林 米子岚 +1 位作者 钟活权 江年琼 《深圳大学学报:理工版》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期610-616,共7页
为了体外获得可溶性的拟南芥AtRD22蛋白,以拟南芥叶片提取的总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)为模版,反转录获得AtRD22的全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,c DNA),分别构建AtRD22的原核重组表达载体p ET3... 为了体外获得可溶性的拟南芥AtRD22蛋白,以拟南芥叶片提取的总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)为模版,反转录获得AtRD22的全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,c DNA),分别构建AtRD22的原核重组表达载体p ET32a-RD22和p SUMO-RD22,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行AtRD22蛋白的表达.在0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dithiogalactopyranoside,IPTG)诱导下,探索不同培养温度和诱导时间对可溶性蛋白表达的影响.结果表明,在实验条件下,转化p ET32a-RD22的重组菌表达AtRD22蛋白的总量高于转化p SUMO-RD22的重组菌,但后者的可溶性AtRD22蛋白表达量明显高于前者.当诱导温度为28或16℃,时间分别为6.0或8.0 h以上时,转化p SUMO-RD22的重组菌中可溶性目的蛋白的表达量相对较大.为进一步在体外研究AtRD22蛋白质的结构和功能奠定了基础. 展开更多
关键词 蛋白质工程 拟南芥AtRD22 融合标签 小泛素相关修饰物 基因克隆 原核表达
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PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达
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作者 杨丰旭 田晶 +2 位作者 高鹏 许国旺 张卓然 《中国微生态学杂志》 CAS CSCD 2014年第6期627-630,共4页
目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b(+)制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-En... 目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b(+)制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PHD2 In-Fusion技术 Nus·Tag 大肠埃希菌
融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展 预览 被引量:6
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作者 吴珊珊 朱芸 +1 位作者 陈珊珊 何冰芳 《化工进展》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期993-998,共6页
融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋... 融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白折叠中的作用,其中大多数功能较强的融合标签(如MBP和NusA)作为分子伴侣帮助重组蛋白正确折叠从而提高蛋白质可溶性。此外,阐述了实际应用中常用的组合标签和标签的去除。最后提出了融合标签在大规模生产可溶性蛋白质中的应用前景、面临的挑战,以及今后研究的方向。 展开更多
关键词 生物技术 蛋白 溶解性 融合标签 重组蛋白质 可溶性表达 纯化
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大肠杆菌系列融合表达载体的构建 预览 被引量:3
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作者 张飞飞 王瑞青 +2 位作者 朱宇鹏 马超 尚广东 《南京师大学报:自然科学版》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期97-102,共6页
许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(... 许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和rrF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP—hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60%,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择. 展开更多
关键词 融合表达载体 融合标签 伴侣蛋白 TEV N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶
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全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性 被引量:2
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作者 李俊毅 彭林 +2 位作者 唐存多 邬敏辰 金坚 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第4期515-520,共6页
目的在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serumalbumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性。方法在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠... 目的在毕赤酵母中表达全长甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)(1-34)与人血清白蛋白(Human serumalbumn,HSA)的融合蛋白PTH(1-34)-HSA,并检测其活性。方法在质粒pPIC9K-PTH(1-34)2-HSA的基础上设计引物,引入6His标签及肠激酶酶切位点,从该质粒中扩增6His-EK-PTH(1-34)-HSA基因,插入pPIC9K载体中,构建重组表达质粒pPIC9K-6His-EK-PTH(1-34)-HSA,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白通过两步亲和层析纯化和肠激酶酶切,获得全长的PTH(1-34)-HSA融合蛋白;检测融合蛋白对UAMS-32P成骨细胞增殖活力、碱性磷酸酶活性以及RANKL和OPG基因转录水平的影响。结果重组表达质粒经测序证实构建正确;表达的6His-PTH(1-34)-HSA融合蛋白相对分子质量约70 000,可与PTH抗体和HSA抗体特异性结合,发酵获得的融合蛋白的浓度为200 mg/L;纯化的融合蛋白可与抗PTH、HSA和6His标签抗体特异性结合,经肠激酶酶切后,该蛋白失去了与6His抗体反应的能力,保持了与PTH和HSA抗体结合的能力;酶切后的全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白保持了PTH的生物活性,能促进UAMS-32P成骨细胞的增殖活力,提高细胞的碱性磷酸酶的活性,上调细胞RANKL基因的转录水平以及抑制OPG基因的转录水平。结论成功在毕赤酵母中表达了全长PTH(1-34)-HSA融合蛋白,有望提高PTH的成药性。 展开更多
关键词 甲状旁腺激素 人血清白蛋白 融合蛋白 组氨酸标签 肠激酶 生物活性
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