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家畜防御素体内组织表达及体外表达研究进展 预览
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作者 魏薇 李海军 +2 位作者 王鑫 张齐政 曹贵方 《畜牧与饲料科学》 2019年第4期52-57,共6页
防御素是广泛分布于动物、植物、昆虫体内的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,在动物免疫调节及植物自身防御方面扮演着重要的角色。对防御素的概念、类型、结构特征、作用机理进行了综述,总结了防御素在牛、马、羊、猪、鹿、骆驼... 防御素是广泛分布于动物、植物、昆虫体内的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,在动物免疫调节及植物自身防御方面扮演着重要的角色。对防御素的概念、类型、结构特征、作用机理进行了综述,总结了防御素在牛、马、羊、猪、鹿、骆驼等家畜体内组织表达及体外表达研究进展,并对防御素在未来生物制药和畜牧饲料生产方面的应用前景进行了展望。 展开更多
关键词 家畜 防御素 组织表达分布 体外表达
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体外受精-胚胎移植对早期胎盘黏着斑激酶信号通路的影响 预览
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作者 赵亮 孙丽芳 +7 位作者 郑秀丽 刘静芳 郑蓉 王颖 杨蕊 张蕾 于丽 张晗 《北京大学学报:医学版》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期151-158,共8页
目的:研究辅助生殖中体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术对早期胎盘滋养层细胞黏着斑激酶(focal adhension kinase,FAK)信号通路基因表达的影响,探讨IVF-ET技术对早期胎盘发育和功能的影响。方... 目的:研究辅助生殖中体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术对早期胎盘滋养层细胞黏着斑激酶(focal adhension kinase,FAK)信号通路基因表达的影响,探讨IVF-ET技术对早期胎盘发育和功能的影响。方法:收集IVF-ET来源的于7~8周经超声引导下减胎获得的胎盘绒毛组织作为研究组,对照组采用自然妊娠双胎7~8周人工流产术中获得的胎盘绒毛组织。利用美国Affymetrix HG-U133 Plus 2.0基因芯片对两组胎盘绒毛组织进行芯片杂交分析,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证其中8个差异表达基因,选取差异表达基因进行无监督聚类分析和生物信息学分析。结果:获得4例IVF-ET减胎绒毛组织和4例自然妊娠人工流产绒毛组织进行基因芯片检测。与自然妊娠组相比,IVF-ET组FAK信号通路中有32个基因差异表达,差异表达倍数≥2,其中12个基因上调,20个基因下调。经qRT-PCR验证,IVF-ET与自然妊娠早期胎盘绒毛中的8个FAK信号通路基因表达确实存在差异,与基因芯片检测结果一致。FAK信号通路基因定位显示,IVF-ET来源胎盘绒毛组织FAK信号通路上游基因表达受到影响,胎盘滋养层细胞通过基因表达代偿维持FAK信号通路功能基本正常。结论:IVF-ET来源和自然妊娠来源的早期胎盘FAK信号通路存在基因表达差异,差异表达基因涉及多种FAK信号通路关键功能,影响IVF-ET胎盘绒毛早期发育和功能,同时胎盘滋养层细胞通过改变相关基因表达来代偿IVF-ET技术本身的干扰,以维持FAK信号通路正常功能,满足胎盘绒毛和胎儿发育需要。 展开更多
关键词 受精 体外 胚胎移植 滋养层 黏着斑激酶 基因表达
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百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定 预览
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作者 刘超 冯勇 +2 位作者 董笑笑 张忠明 朱辉 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期22-27,共6页
为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统... 为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统,表达并纯化到10个LjE2:His融合蛋白。经体外泛素化及Western blot分析,在10个LjE2中有9个具有泛素结合酶活性,1个(LjE2-5)未检测到泛素结合酶活性。 展开更多
关键词 百脉根 泛素结合酶 体外泛素化 原核表达系统
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甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的外源表达及酶活力测定 预览
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作者 陈祎 张伟 +1 位作者 赵丹 郭巍 《北京农学院学报》 2019年第1期34-38,共5页
【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标.【方法】以pMD19-T-Secda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到Secda2a基因.构建原核表达载体pET-28a-Secda2a,... 【目的】为了研究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA2a的酶学性质,探索其对甜菜夜蛾幼虫发育过程的影响,为甜菜夜蛾的生物防治提供新靶标.【方法】以pMD19-T-Secda2a重组质粒为模板,PCR扩增得到Secda2a基因.构建原核表达载体pET-28a-Secda2a,IPTG诱导蛋白表达.利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建重组转座载体pFastBac HT A-Secda2a,脂质体转染昆虫细胞Sf9,Western blot对SeCDA2a重组蛋白进行分析,以对硝基苯胺为底物利用分光光度计测定其酶活力.【结果】Secda2a在大肠杆菌和Sf9中均成功表达61 kDa的重组蛋白,与预测分子量大小相符.IPTG终浓度为0.50mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.昆虫细胞Sf9表达的重组蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57U/mL.【结论】本研究实现甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因Secda2a的外源表达,测定重组蛋白SeCDA2a的酶活力. 展开更多
关键词 甜菜夜蛾 几丁质脱乙酰酶 外源表达 酶活测定
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小鼠黏蛋白1(MUC1)基因的体外转录及其在NIH/3T3细胞中的表达
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作者 林煊 陈鹤丹 +6 位作者 谢颖 曾柱 胡祖权 贾义 王赟 谭承建 刘丽娜 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第10期896-901,共6页
目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引... 目的体外转录获得小鼠黏蛋白1(MUC1) mRNA并在NIH/3T3细胞中表达。方法通过反转录PCR从小鼠4T1细胞中扩增MUC1基因,然后插入真核表达载体pc DNA3. 1(+)中构建重组表达载体pc DNA3. 1(+)-MUC1。双酶切鉴定正确后,以该质粒为模板,下游引物中引入血凝素标签(HA TAG)序列,PCR扩增MUC1-HA TAG融合基因片段,然后克隆至表达载体pc DNA3. 1(+),重组载体经双酶切鉴定和DNA序列测定后作为模板,PCR扩增获得含T7启动子和MUC1-HA TAG融合基因片段的PCR产物作为体外转录模板,通过体外转录、加尾、纯化最终获得修饰的MUC1 mRNA。通过多种转染试剂将体外转录MUC1-HA TAG mRNA转入NIH/3T3细胞,Western blot法检测融合蛋白MUC1-HA TAG的表达。结果反转录PCR扩增的MUC1基因长度约为1900 bp,酶切鉴定和序列分析证实MUC1-HA TAG融合基因已成功插入pc DNA3. 1(+)质粒。插入序列与Gen Bank中小鼠的MUC1基因序列完全一致,HA TAG正确插入MUC1下游,读框正确。Western blot法分析证实体外转录修饰的MUC1-HA TAG mRNA能在NIH/3T3细胞中表达。结论体外转录修饰的小鼠MUC1-HA TAG mRNA能在哺乳动物NIH/3T3细胞中翻译表达。 展开更多
关键词 黏蛋白1(MUC1) 体外转录 蛋白表达
三七皂苷单体对成骨细胞增殖和矿化功能的影响 预览
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作者 林天骥 邵莉 +1 位作者 柳毅 陈建治 《口腔医学》 CAS 2018年第2期127-131,共5页
目的观察三七皂苷单体(Notoginsenoside R1,NGR1)和成骨细胞之间的相关性。方法将成骨前体细胞MC3T3-E1培养于含有10%FBS(GibcoTMInvitrogen)的α-MEM培养基中,通过在各培养孔中加入不同体积质量的三七皂苷单体来研究体外三七皂苷... 目的观察三七皂苷单体(Notoginsenoside R1,NGR1)和成骨细胞之间的相关性。方法将成骨前体细胞MC3T3-E1培养于含有10%FBS(GibcoTMInvitrogen)的α-MEM培养基中,通过在各培养孔中加入不同体积质量的三七皂苷单体来研究体外三七皂苷单体对成骨细胞的影响,检测方法为:荧光定量法检测细胞增殖情况;比色法检测细胞成骨分化的ALP活性情况;ELISA对各组OCN含量进行检测;RT-PCR检测,将β-actin表达作为内参照依据,校准各基因的临床表达水平情况。结果同一时间点各体积质量的三七皂苷单体均呈现开口向下的抛物线状作用趋势,即在50 mg/L时显著促进细胞增殖,随后效果下降,超过100 mg/L则抑制细胞增殖(P〈0.05);体积质量在50 mg/L时三七皂苷单体可显著促进ALP活性,随着体积质量的升高达到峰值后下降;早期三七皂苷单体上调OCN表达并无显著差异,7 d后其上调OCN表达量呈现体积质量依赖效应递增趋势;相关基因表达方面,三七皂苷单体在体积质量为50 mg/L时,对Runx2和OCN的基因表达均有较为明显促进作用,达到平台期后促进作用趋于稳定。结论从成骨细胞增殖数量、碱性磷酸酶活性、骨钙素表达量等方面证实了一定体积质量的三七总皂苷单体对成骨细胞增殖的促进作用。 展开更多
关键词 三七皂苷单体 体外培养 成骨细胞 基因表达
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家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析
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作者 蒋诗梦 钟杨生 +3 位作者 林碧敏 陈芳艳 严会超 林健荣 《蚕业科学》 CSCD 北大核心 2018年第2期242-248,共7页
家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质... 家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。 展开更多
关键词 家蚕翅原基 体外培养 蜕皮激素 Shotgun质谱 BmHMGS基因 表达特征
棉铃虫气味结合蛋白HarmOBP16的组织表达谱及配基结合特性分析 预览
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作者 李兆群 张帅 +2 位作者 周淑芬 雒珺瑜 崔金杰 《昆虫学报》 CSCD 北大核心 2017年第8期891-899,共9页
【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味... 【目的】揭示棉铃虫Helicoverpa armigera气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因Harm OBP16的组织表达谱及其重组蛋白与气味化合物的结合特性。【方法】基于棉铃虫触角转录组数据,利用PCR技术从棉铃虫成虫触角中PCR克隆气味结合蛋白基因,并进行生物信息学和系统进化分析;采用qPCR对其进行组织[头部(去除触角和喙)、胸部、腹部、足、翅、触角和喙]表达谱分析;进一步采用原核表达系统表达和纯化重组蛋白;最后采用荧光竞争结合实验测定该重组蛋白与85种候选气味物质的结合能力。【结果】从棉铃虫成虫触角中克隆得到一个Atypical OBP家族基因Harm OBP16(Gen Bank登录号:JQ753074),其开放阅读框长441 bp,编码146个氨基酸,推断的编码蛋白等电点为6.87,具有10个保守的半胱氨酸。组织表达谱结果表明,Harm OBP16在雌成虫翅中高表达。纯化后的重组蛋白Harm OBP16对植物花的挥发物香叶基丙酮(Ki=14.2μmol/L)、β-紫罗兰酮(Ki=15.2μmol/L)、辛醛(Ki=15.3μmol/L)、芳樟醇(Ki=16.8μmol/L)、(R)-(+)-柠檬烯(Ki=14.9μmol/L)和β-蒎烯(Ki=17.3μmol/L)有较强的结合能力。【结论】Harm OBP16可能在棉铃虫识别寄主植物的过程中发挥一定的作用,可为基于气味物质的棉铃虫引诱剂或驱避剂的研发提供潜在的分子靶标。 展开更多
关键词 棉铃虫 气味结合蛋白 组织表达谱 原核表达 荧光竞争结合实验
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眼镜蛇神经毒素研究进展 预览 被引量:3
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作者 蒋世强 潘能庆 +5 位作者 鄢航 贾银海 苏惠梅 刘伟 蒋和生 杨秀荣 《现代农业科技》 2017年第4期255-256,共2页
眼镜蛇毒神经毒素(Cobrotoxin,CT)是一种短链神经毒素,最早是从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到的。因其在镇痛和抗癌方面有着显著的效果而成为研究的热点,本文通过对近年来CT的结构、药理作用、镇痛、抗癌研究进展进行综述,旨在为各位研究... 眼镜蛇毒神经毒素(Cobrotoxin,CT)是一种短链神经毒素,最早是从台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到的。因其在镇痛和抗癌方面有着显著的效果而成为研究的热点,本文通过对近年来CT的结构、药理作用、镇痛、抗癌研究进展进行综述,旨在为各位研究者提供基础参考资料。 展开更多
关键词 眼镜蛇 神经毒素 药理作用 体外表达
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光质对白芨组培苗生理特性及酶基因表达的影响 预览 被引量:1
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作者 王自布 杨维 +1 位作者 陈建 彭风梅 《热带亚热带植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期665-670,共6页
为探讨光质对白芨(Bletilla striata)组培苗生长发育的影响,对不同光质下白芨组培苗的生长特征、抗氧化酶活性以及酶基因表达进行了研究。结果表明,蓝光和红光对白芨生长有显著促进作用,绿光的作用不明显。除了CAT外,不同光质处理白芨... 为探讨光质对白芨(Bletilla striata)组培苗生长发育的影响,对不同光质下白芨组培苗的生长特征、抗氧化酶活性以及酶基因表达进行了研究。结果表明,蓝光和红光对白芨生长有显著促进作用,绿光的作用不明显。除了CAT外,不同光质处理白芨的APX、POD、SOD活性均呈上升趋势,且黄光处理的白芨SOD和APX活性最高,红光处理的POD活性最高,绿光处理的抗氧化酶活性比其他光质的低,蓝光处理35-45 d对抗氧化酶基因表达具有促进作用。因此,红光和黄光促进白芨生根组培苗的长高和生根;不同光质处理总体上提高了白芨氧化酶活性;白芨抗氧化酶基因的表达在蓝光处理下最大。 展开更多
关键词 白芨 组培苗 抗氧化酶 基因表达
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非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备 预览 被引量:1
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作者 冯春燕 宋晓晖 +6 位作者 仇松寅 王淑娟 王彩霞 张永宁 邓俊花 吴绍强 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2016年第5期80-84,共5页
为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋... 为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 体外表达 单克隆抗体
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光质对离体培养条件下绿色棉纤维发育及黄酮合成的影响 预览
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作者 洪亮 张雷 +5 位作者 钱森和 孙旭 蔡永萍 林毅 高俊山 郭宁 《棉花学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期300-309,共10页
为探讨光质对绿色棉纤维生长发育和黄酮合成的影响,以绿色棉品种绿絮棉1号为材料进行离体培养,比较红光、黄光、蓝紫光、白光和暗处理条件下绿色棉胚珠鲜物质质量、纤维长度、纤维素含量、黄酮含量等生理和分子指标的差异。结果表明:... 为探讨光质对绿色棉纤维生长发育和黄酮合成的影响,以绿色棉品种绿絮棉1号为材料进行离体培养,比较红光、黄光、蓝紫光、白光和暗处理条件下绿色棉胚珠鲜物质质量、纤维长度、纤维素含量、黄酮含量等生理和分子指标的差异。结果表明:光处理能够促进胚珠鲜物质质量的增加,但抑制了纤维的伸长。在纤维发育前期,各光处理抑制了蔗糖合成酶活性和蔗糖合成酶基因表达;纤维发育后期,白光处理提高了蔗糖合成酶活性,促进了蔗糖合成酶基因表达。红光、黄光和蓝紫光处理显著提高了β-1,3-葡聚糖酶活性(10~20 DAC(Days after culture));红光、黄光和白光均能提高β-1,3-葡聚糖基因表达量,而蓝光则抑制了基因的表达。白光促进了纤维素的合成,而蓝紫光抑制了纤维素的合成。在纤维发育初期(10 DAC),蓝紫光抑制了黄酮合成及其关键酶基因表达;而在发育后期(30~40 DAC),白光处理能够促进黄酮的合成及其关键酶基因表达。可见,光质对绿色棉纤维发育及黄酮合成具有一定的影响。 展开更多
关键词 绿色棉 离体培养 光质 基因表达 纤维发育 黄酮合成
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体外构建合成成纤维细胞生长因子-1mRNA及其表达的初步研究 预览 被引量:1
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作者 吴志敏 李光明 +4 位作者 白洁 王金鑫 贾欣雨 杜晓玲 朱泽 《天津医科大学学报》 2015年第5期375-378,384共5页
目的:参照m RNA稳定性理论,设计并体外转录合成具有一定稳定性的FGF1 m RNA,对其表达进行初步验证。方法:在p T7TS载体上加poly A、βglobin 3′、5′UTR,增加GC含量优化设计FGF1序列,并结合m RNA二级结构分析其稳定性,目的序列琼脂... 目的:参照m RNA稳定性理论,设计并体外转录合成具有一定稳定性的FGF1 m RNA,对其表达进行初步验证。方法:在p T7TS载体上加poly A、βglobin 3′、5′UTR,增加GC含量优化设计FGF1序列,并结合m RNA二级结构分析其稳定性,目的序列琼脂糖凝胶电泳及测序验证后,体外转录合成FGF1 m RNA,待浓度及片段大小验证后,行动物实验,通过ELISA法检测FGF1 m RNA表达。结果:二级结构分析显示,优化后FGF1序列稳定性更高;双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示p T7TS-FGF1重组载体构建成功,测序验证正确;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示合成m RNA大小正确。ELISA检测显示,实验组(92.48 pg/m L)小鼠血清中FGF1蛋白含量较对照组(13.59 pg/m L和15.54 pg/m L)明显升高,差异有统计学意义(P〈0.01);对照组间FGF1蛋白含量接近,二者无统计学差别(P〉0.05)。结论:成功构建并体外转录合成稳定的FGF1 m RNA,m RNA与鱼精蛋白结合后回输小鼠在体内成功表达。 展开更多
关键词 体外转录 MRNA稳定性 成纤维细胞生长因子-1 体内表达
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朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶真核表达载体构建及在293T细胞中表达条件 预览 被引量:1
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作者 韩晶玉 楼怡宁 +3 位作者 师光禄 陈青 彭博 卜春亚 《北京农学院学报》 2015年第4期24-28,共5页
乙酰胆碱酯酶(AChE;EC 3.1.1.7)是神经传导中调节神经递质乙酰胆碱水平的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标。目前关于朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的真核表达还未见报道。本研究拟构建朱砂叶螨AChE的真核表达载体,进行在2... 乙酰胆碱酯酶(AChE;EC 3.1.1.7)是神经传导中调节神经递质乙酰胆碱水平的一种关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的主要作用靶标。目前关于朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的真核表达还未见报道。本研究拟构建朱砂叶螨AChE的真核表达载体,进行在293T细胞中表达条件摸索。将朱砂叶螨野生型ace完整读框和去掉3’疏水区的ace基因分别插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,经PCR和双酶切鉴定及测序验证后,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/ace。采用GFP报告基因确定在293T细胞中表达条件摸索,结果表明293T细胞的最适转染时间为48h和LipofectamineTM2000转染试剂的最适加样量为20μL。本试验成功构建了朱砂叶螨AChE的真核表达载体,确定了在293T细胞中的表达条件,为后续筛选新型选择性AChE抑制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 乙酰胆碱酯酶 朱砂叶螨 293T细胞 转染 体外表达
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KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的影响
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作者 刘虹 孔刚 +3 位作者 龚志军 卿笃桔 李恩就 黎飞 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期2708-2711,共4页
目的 观察KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的作用和对其生物学功能的影响.方法 通过基因转染法使KISS-1在结肠癌细胞株HT29中稳定表达,应用噻唑蓝(MTT)法和Transwell侵袭实验检测KISS-1表达对结肠癌细胞株HT29的增殖和侵袭能力... 目的 观察KISS-1基因对结肠癌细胞株HT29体外表达的作用和对其生物学功能的影响.方法 通过基因转染法使KISS-1在结肠癌细胞株HT29中稳定表达,应用噻唑蓝(MTT)法和Transwell侵袭实验检测KISS-1表达对结肠癌细胞株HT29的增殖和侵袭能力的作用和影响;通过免疫组织化学法和实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测KISS-1基因mRNA在体外结肠癌细胞株HT29中的表达水平,并用Real-time PCR测定转染后结肠癌细胞株HT29中c-fos、c-jun mRNA水平表达变化,并通过显微镜、透射电镜等观察凋亡细胞的形态学改变.结果 (1)Real-time PCR和免疫细胞组织化学证实转染后结肠癌细胞中有KISS-1稳定表达.(2)MTt法表明:培养0、24 h时各组HT29细胞数差异无统计学意义(P>0.05),48 h后,随着培养时间延长,转染组HT29细胞数明显低于空白对照组与阴性对照组(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组HT29细胞数差异无统计学意义(P>0.05).(3) Transwell侵袭实验结果:转染KISS-1基因的结肠癌细胞HT29穿透Matrigel基底膜的细胞数显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞(P<0.01),侵袭指数显著降低(P<0.01),侵袭力抑制率达到56.5%,显著低于空质粒转染组及空白对照组细胞(P<0.01).空质粒转染组及空白对照组细胞比较,侵袭穿膜细胞数差异无统计学意义(P>0.05).(4)KISS-1作用于结肠癌细胞株HT29 24 h后,形态学观察结肠癌细胞株HT29发生凋亡或坏死.(5)Real-time PCR:转染组c-jun和c-fos吸光度值为0.87 ±0.16和0.44±0.12,阴性对照组吸光度值为1.82±0.39和1.76±0.34,空白对照组吸光度值为1.65±0.36和1.58±0.31.与对照组比较,转染组c-jun和c-fos扩增产物条带吸光度值均显著降低(P<0.01).结论 KISS-1基因对体外结肠癌细胞株HT29具有抑制增殖和促进凋亡作用,其可能是通过负性调控信号通路降低结肠癌细胞中 展开更多
关键词 结肠癌细胞 KISS-1基因 体外表达
Isolation, Expression and Characterization of rbc L Gene from Ulva prolifera J. Agardh(Ulvophyceae, Chlorophyta) 预览
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作者 SHAO Zhanru LI Wei +1 位作者 GUO Hui DUAN Delin 《中国海洋大学学报:英文版》 SCIE CAS 2015年第6期1087-1095,共9页
Ulva prolifera is a typical green alga in subtidal areas and can grow tremendously fast. A highly efficient Rubisco enzyme which is encoded by Up Rbc L gene may contribute to the rapid growth. In this study, the full-... Ulva prolifera is a typical green alga in subtidal areas and can grow tremendously fast. A highly efficient Rubisco enzyme which is encoded by Up Rbc L gene may contribute to the rapid growth. In this study, the full-length Up Rbc L open reading frame(ORF) was identified, which encoded a protein of 474 amino acids. Phylogenetic analysis of Up Rbc L sequences revealed that Chlorophyta had a closer genetic relationship with higher plants than with Rhodophyta and Phaeophyta. The two distinct residues(aa11 and aa91) were presumed to be unique for Rubisco catalytic activity. The predicted three-dimensional structure showed that one α/β-barrel existed in the C-terminal region, and the sites for Mg~(2+)coordination and CO_2 fixation were also located in this region. Gene expression profile indicated that Up Rbc L was expressed at a higher level under light exposure than in darkness. When the culture temperature reached 35℃, the expression level of Up Rbc L was 2.5-fold lower than at 15℃, and the carboxylase activity exhibited 13.8-fold decrease. Up Rbc L was heterologously expressed in E. coli and was purified by Ni~(2+) affinity chromatography. The physiological and biochemical characterization of recombinant Rubisco will be explored in the future. 展开更多
关键词 Ribulose-1 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit sequence analysis real-time PCR in vitro expres-sion ULVA PROLIFERA
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疏风宣肺方和解表清里方体外干预甲型流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子分泌作用的研究 预览 被引量:1
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作者 葛世杰 刘晓婷 +6 位作者 张沂 卢娜娜 顾立刚 吴珺 邱泽计 张洪春 晁恩祥 《河北中医》 2015年第6期863-866,891共5页
目的:研究疏风宣肺方和解表清里方对甲型流感病毒H1 N1感染的人肺腺癌上皮细胞(A549)中炎性细胞因子的影响。方法培养 A549,甲型流感病毒 H1N1感染 A549后,分为细胞对照组、H1V1感染组、奥司他韦对照组、疏风宣肺组及解表清里组。... 目的:研究疏风宣肺方和解表清里方对甲型流感病毒H1 N1感染的人肺腺癌上皮细胞(A549)中炎性细胞因子的影响。方法培养 A549,甲型流感病毒 H1N1感染 A549后,分为细胞对照组、H1V1感染组、奥司他韦对照组、疏风宣肺组及解表清里组。采用实时定量聚合酶链式反应(RT -PCR)和Western blotting 法检测各组细胞中炎症相关的白细胞介素(IL)1、肿瘤坏死因子α(TNF -α)、IL -6、IL -10、单核细胞趋化蛋白1(MCP -1)、调节活化正常 T 细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)的 mRNA 及蛋白表达的变化。结果基因芯片结果提示,与细胞对照组比较,H1N1感染组差异表达基因 Il1β、Thf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明显上调。与 H1N1感染组比较,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组差异基因 Thf、Il1β、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2表达显著下调。 RT -PCR 结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组 IL -1、TNF -α、IL -6、IL-10、MCP -1、RANTES 的 mRNA 表达均显著升高(P <0.01)。与 H1N1感染组比较,疏风宣肺组 IL -1、TNF-α、IL -6、IL -10、MCP -1的 mRNA 表达均明显降低(P <0.01,P <0.05),解表清里组 IL -1、TNF -α、IL -6、MCP -1的 mRNA 表达均明显降低(P <0.01,P <0.05)。 Western blotting 结果显示,H1N1感染组 IL -1、TNF -α、IL -6、IL -10、MCP -1、RANTES 蛋白表达较细胞对照组显著升高(P <0.05);与 H1N1感染组比较,疏风宣肺组及解表清里组 IL -1、TNF -α、IL -6、IL -10、MCP -1、RANTES 蛋白表达均显著降低(P <0.05,P<0.01)。结论疏风宣肺方和解表清里方均可抑制流感病毒感染后炎性细胞因子 IL -1、TNF -α、IL -6、MCP -1的 mRNA 过表达及蛋白分泌,减轻炎症反应,并恢复机体免疫功能的稳定和平衡。 展开更多
关键词 流感病毒A型 H1N1亚型 抗病毒药(中药) 炎症趋化因子类 体外研究 基因表达调控 病毒
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人脐带间充质干细胞体外传代遗传特性的研究
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作者 岑双庆 刘宇 +7 位作者 高雪华 李晓瑞 邓银 郑东明 田奕 李江林 胡忠国 张蓉 《现代医学》 2015年第9期1093-1098,共6页
目的:研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为hUC-MSCs临床应用的安全性提供理论依据。方法:观察无血清培养基培养的1、3、5、7、10、13、17和20代hUC-MSCs的细胞形态,对细胞周期、表面标记... 目的:研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为hUC-MSCs临床应用的安全性提供理论依据。方法:观察无血清培养基培养的1、3、5、7、10、13、17和20代hUC-MSCs的细胞形态,对细胞周期、表面标记物、染色体核型进行分析,并对相关基因和细胞因子作定量分析。结果:hUC-MSCs传代至第7代后细胞生长速度开始明显减慢;细胞形态无明显变化,呈长梭形。细胞周期分析发现,处于G2期和S期的细胞百分比保持稳定;染色体核型无明显缺失、易位和倒位等变化。待测基因表达量略有差异,各代细胞培养基中分泌的细胞因子保持稳定。结论:利用无血清培养基培养的hUCMSCs在体外培养10代以内基本安全。 展开更多
关键词 脐带间充质干细胞 体外培养 细胞因子 基因表达
人脂肪间充质干细胞体外传代的遗传特性分析 预览
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作者 李晓瑞 邓银 +9 位作者 陈思翔 郑东明 马明 刘宇 高雪华 刘大成 赵令卉 岑双庆 张蓉 李俊 《基础医学与临床》 CSCD 2015年第11期1514-1519,共6页
目的研究人脂肪间充质干细胞(ADSCs)在体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为脂肪间充质干细胞的基础研究及临床应用安全性提供理论依据和新的细胞来源。方法利用无血清培养基培养ADSCs,对1、3、5、7、10、14和15代体外培养细... 目的研究人脂肪间充质干细胞(ADSCs)在体外传代过程中生物学特性及遗传特性的变化,为脂肪间充质干细胞的基础研究及临床应用安全性提供理论依据和新的细胞来源。方法利用无血清培养基培养ADSCs,对1、3、5、7、10、14和15代体外培养细胞进行了形态观察,流式细胞术分析细胞周期及免疫表型,G显带法分析染色体核型,实时荧光定量分析相关基因表达量,ELISA定量分析细胞因子的表达量。结果 ADSCs传代至第7代后,细胞增殖速度开始减慢,10代后细胞增殖速度显著减慢。细胞形态为长梭形并保持稳定。处于G2期和S期细胞百分比基本保持稳定。染色体细胞核型没有明显易位和缺失等变化,相关基因表达量略有差异,培养基内分泌的细胞因子保持稳定。结论利用无血清培养基培养的脂肪间充质干细胞在体外培养5代以内基本安全。 展开更多
关键词 脂肪间充质干细胞 体外培养 细胞因子 基因表达
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母体糖尿病环境对体外受精胚胎早期发育的影响 预览 被引量:1
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作者 强苏静 陶凌云 +2 位作者 刘丽均 徐平 高诚 《实验动物与比较医学》 CAS 2015年第2期155-160,共6页
目的通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建小鼠糖尿病(diabetesmellitus,DM)模型后,运用体外受精技术研究母体高血糖环境对早期胚胎发育的影响。方法选取6~8周龄ICR雌鼠经2次腹腔注射小剂量STZ构建小鼠糖尿病模型,... 目的通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建小鼠糖尿病(diabetesmellitus,DM)模型后,运用体外受精技术研究母体高血糖环境对早期胚胎发育的影响。方法选取6~8周龄ICR雌鼠经2次腹腔注射小剂量STZ构建小鼠糖尿病模型,并设实验对照组。实验母鼠体外受精得到2-细胞胚胎,统计受精率等,并将2.细胞胚胎移植至代孕母鼠体内。取14d胎龄的胚胎提取总RNA,用Agilent2100 Bioanalyzer系统对总RNA进行质检合格后,经过逆转录、标记、杂交、洗脱,芯片结果用Affymetrix Scanner3000进行扫描,用Command Console Software3.1读取原始数据,实验重复3次,比较实验组与对照组的基因表达的差异情况。结果较高血糖组陋潍为9.5~15.5mmol/L)母鼠卵子体外受精后发育到2-细胞胚胎的比例为52.3%与对照组的72.1%存在显著统计学差异(P〈0.01),高血糖组(血糖值〉15.5retool/L),%胎发育到2-细胞的比例为44.2%与对照组相比也存在显著统计学差异(P〈0.01)。芯片筛选出差异表达基因121个(P〈0.05),其中有119个基因实验组的表达量是对照组的0.5倍以下,2个基因实验组的表达量是对照组的2倍以上。结论糖尿病小鼠的卵子与正常精子体外受精后发育到2.细胞的比例较对照组小鼠低,并且血糖值越高比例越低。由此说明母体糖尿病环境能影响其卵子的生长发育,并且这些影响可能是通过上调代谢相关基因和下调发育相关基因产生的。 展开更多
关键词 链脲佐菌素(STZ) 体外受精 基因芯片 差异表达
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