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CSFV、PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及其应用
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作者 顾文源 范京惠 +3 位作者 邸晶美 罗尚星 刘宝京 左玉柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期193-197,共5页
由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引... 由猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的繁殖障碍性疫病在中国的不断暴发,增加了猪的发病率和死亡率。为了建立同时检测这3种病毒的多重PCR方法,本研究根据GenBank中这3种病毒的参考基因序列设计引物,并对反应中的影响因素进行优化,建立了同时检测CSFV、PRV和PRRSV的多重PCR方法。该方法扩增的基因片段大小分别为570(CSFV),232 (PRRSV)和173bp(PRV)。敏感性和特异性试验结果显示,该方法对3种病毒的核酸最低检出量分别为23.88(CSFV),13.10(PRRSV)和14.60pg(PRV),对大肠杆菌(Ec.oli)、沙门菌(Salmonella)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。对2015年5月至2016年1月收集的168份临床样本检测结果显示,CSFV阳性率为24.4%,PRRSV阳性率为21.4%,提示河北省该段时间内引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原为CSFV和PRRSV。经多重PCR检测为PRRSV、PRV或CSFV阳性的临床样本,再次使用商品化的试剂盒进行检测,符合率为100.0%。这些结果表明,本试验建立的多重PCR方法省时、高效,可用于PRRSV、PRV和CSFV感染的临床诊断。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 伪狂犬病病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重PCR
猪繁殖与呼吸综合征类NADC30与HP-PRRSV毒株RT-PCR鉴别方法的建立与应用 预览
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作者 徐雷 赵军 +3 位作者 杨晓宇 殷鑫欢 张继宗 朱玲 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第1期109-113,共5页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播,导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒,其特性为变异快,存在毒株间的重组。因此,病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播,导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒,其特性为变异快,存在毒株间的重组。因此,病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30与HP-PRRSV毒株的检测方法,根据nsp2基因的高变区的比对结果,选择其保守序列,设计一对检测引物,类NADC30扩增片段大小为334bp,HP-PRRSV毒株扩增片段大小为514bp,通过优化反应条件,最终建立了一种一对引物就可以区分检测类NADC30与HP-PRRSV毒株的RT-PCR检测方法。应用本试验所建立的RT-PCR方法对2017年12月至2018年2月采至四川多地区的疑似PRRSV感染发病的46份肺脏进行检测。结果显示,类NADC30检出率为32.6%,高于HP-PRRSV毒株的检出率(10.9%)。该方法的建立,为类NADC30和HP-PRRSV毒株的快速鉴别诊断提供了方法,具有重要意义。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征 类NADC30 HP-PRRSV 鉴别诊断 RT-PCR
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猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断 预览
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作者 张海龙 陈盛楠 +2 位作者 谢博 李丽 黄良宗 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第6期1856-1864,共9页
为确诊广东省阳江市某规模化猪场(存栏800头母猪)保育猪发病死亡的原因,本试验对从该发病猪场采集的3份肺脏、肝脏、脾脏临床样品进行细菌学检测及药敏试验,采用PCR/RT-PCR检测临床样品中猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖... 为确诊广东省阳江市某规模化猪场(存栏800头母猪)保育猪发病死亡的原因,本试验对从该发病猪场采集的3份肺脏、肝脏、脾脏临床样品进行细菌学检测及药敏试验,采用PCR/RT-PCR检测临床样品中猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪肺炎支原体等病原。对特异性扩增的3株PRRSV的ORF5基因产物进行序列测定,与VR2332、HuN4、JXA1、CH-1a等代表毒株进行核苷酸序列同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,试验分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌(Hps),对7种临床常用药如阿莫西林、头孢拉定等均有较强的敏感性。同源性比对结果表明,3株PRRSV(LJW1、LJW2和LJW3)ORF5基因核苷酸同源性为99.3%~99.8%,与欧洲型代表毒株Lelystad核苷酸同源性为64.0%~64.2%,与HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4、CH-1a和TJ核苷酸同源性较高,分别为99.2%~99.5%、99.0%~99.3%、94.5%~94.9%和98.8%~99.2%;与中国河南和广西分离的HP-PRRSV毒株HeNzm1-16和GXLZ05-2015核苷酸同源性较高,分别为99.3%~99.7%和99.2%~99.7%,与美洲型经典疫苗株MLV、美洲型标准株NC、美洲型经典株VR2332核苷酸同源性较低,分别为88.5%~88.8%、85.2%~85.5%和82.3%~82.6%。PRRSV ORF5基因系统进化树分析表明,3株PRRSV均属于美洲型毒株,与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ等处于同一分支,亲缘关系较近。本研究揭示了该场保育猪发病病原,并从分子水平上明确了分离的3株PRRSV与不同代表毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRSV提供了参考依据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 副猪嗜血杆菌(Hps) ORF5基因 遗传进化
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转录组测序技术在猪繁殖与呼吸综合征病毒研究中的应用 预览
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作者 梁婉 周丹娜 +8 位作者 彭忠 杨克礼 段正赢 郭锐 刘威 吴斌 陈文杰 孟丽 田永祥 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期37-44,共8页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能导致母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难等症状,严重威胁全球养猪业的健康发展。目前,PRRSV的致病机制及其与宿主的互作机理并不完全清楚。近年来,随着... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能导致母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难等症状,严重威胁全球养猪业的健康发展。目前,PRRSV的致病机制及其与宿主的互作机理并不完全清楚。近年来,随着高通量测序技术的快速发展,转录组测序技术已被广泛应用于PRRSV的研究中,为深入解析PRRSV的致病机理及其与宿主的互作机制提供了一种全新的研究工具。作者从感染应答、蛋白功能、毒株、疫苗、抗病品种5个方面对近年来转录组测序技术在PRRSV研究中的应用进行了综述分析,对其筛选的差异表达基因(DEGs)和通路进行总结,以期为未来PRRSV转录组学研究提供参考。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 转录组测序 差异表达基因 通路
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猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用 预览
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作者 李晓菲 陈婷 +6 位作者 魏笑笑 孙爱荣 黄艳 葛晓杰 徐婷 王彩宏 秦立廷 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第1期239-246,共8页
为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC... 为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101~108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%~0.90%和0.65%~2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) TaqMan-MGB实时荧光定量方法 临床样品
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健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病学调查 预览
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作者 饶继红 何彪 +3 位作者 涂长春 张家宁 葛淑敏 龚文杰 《安徽农业科学》 CAS 2019年第11期111-114,118共5页
为进一步了解我国规模化猪场健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的情况,对2017年采自我国25个省(市)38个规模化猪场的断奶仔猪咽拭子、肛拭子、血清共4059份样品进行了高通量测序,然后对检测到的病毒进行RT-PCR或PCR验证。... 为进一步了解我国规模化猪场健康断奶仔猪携带猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的情况,对2017年采自我国25个省(市)38个规模化猪场的断奶仔猪咽拭子、肛拭子、血清共4059份样品进行了高通量测序,然后对检测到的病毒进行RT-PCR或PCR验证。基于高通量测序的宏基因组学结果显示,健康断奶仔猪的咽拭子、肛拭子、血清中共出现1706条动脉炎病毒科的病毒基因Reads,其中包括PRRSV。通过RT-PCR扩增从咽拭子和肛拭子中共检测出46个PRRSV样品,样品阳性率为1.1%,猪场阳性率为39.5%。同时,试验成功扩增出7个毒株的ORF5基因,并进行了序列测定。基于ORF5基因核苷酸序列的系统进化分析发现,该试验获得的PRRSV流行毒株为高致病性毒株,属于TypeⅡ中的Subgroup4。对健康断奶仔猪携带PRRSV的研究结果可为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供科学数据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 断奶仔猪 ORF5 遗传进化分析
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猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达
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作者 沈克飞 杨柳 +3 位作者 杨睿 周雪 张素辉 付利芝 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第1期29-32,共4页
目的乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位。方法按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2 ... 目的乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位。方法按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2 ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒p NZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12%SDS-PAGE分析。结果重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确。嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96%以上,浓度约1 mg/mL,产量可达60 mg/L细菌培养物。结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 猪繁殖及呼吸综合征病毒 嵌合抗原表位 乳酸乳球菌
PRRSV 2b蛋白互作宿主细胞蛋白的筛选
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作者 崔一龙 邓守全 +2 位作者 杨达汉 薛江东 马德慧 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第4期403-407,共5页
目的通过酵母双杂交筛选技术从猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)c DNA文库中筛选与猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)2b蛋白互作的宿主细胞蛋白。方法将PRRSV 2b基... 目的通过酵母双杂交筛选技术从猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)c DNA文库中筛选与猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)2b蛋白互作的宿主细胞蛋白。方法将PRRSV 2b基因扩增产物克隆至p GBKT7质粒上,构建重组钓饵载体p GBKT7-2b,转化至Y2H Gold酵母感受态中制备钓饵菌株后,进行自激活和毒性检测;将PAM c DNA文库菌株与钓饵菌株进行杂交融合,经DDO/X/A平板筛选后,对筛选的菌株进行PCR鉴定及测序分析。结果构建的钓饵菌株无毒性和自激活现象;共获得LGALS1、RPL12、LGALS3和RPS20 4种蛋白。结论成功构建了可用于双杂交筛选的钓饵菌株,筛选出4种与PRRSV 2b蛋白互作的PAM蛋白,其中LGALS1出现概率最高。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 2b蛋白 互作蛋白 猪肺泡巨噬细胞
河北省PRRSV流行毒株的分离鉴定
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作者 刘玄福 郝建香 +7 位作者 宋涛 辛树阳 张守聪 田瑞 芮萍 王秋悦 刘谢荣 马增军 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期198-203,共6页
为了全面调查猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在河北省的流行情况,本研究共收集河北省833份病死猪临床样品,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测,共检出419份阳性病料,阳性率高达50.3... 为了全面调查猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在河北省的流行情况,本研究共收集河北省833份病死猪临床样品,利用RT-PCR方法对其进行PRRSV检测,共检出419份阳性病料,阳性率高达50.3%。其中NADC30-like PRRSV阳性率为49.1%;HP-PRRSV阳性率为3.1%;经典株PRRSV没有检出;HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV共感染样品为16份,共感染率为1.9%。此外,本研究成功地分离到3株NADC30-like毒株,并测通其全基因组序列,与国内外流行毒株进行序列比对和基因重组分析发现,这3个毒株中的QHD1株为重组毒株,亲本可能为PRRSV NADC30毒株和疫苗株RespPRRS MLV,2处重组分别位于7 913~8 015nt和12 780~13 158nt处。本研究为河北省PRRSV的深入研究和防控奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NADC30-like毒株 遗传变异 基因重组
两株田间重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定、进化分析及其致病性研究 被引量:1
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作者 王新港 王傲杰 +4 位作者 周峰 崔丹丹 常洪涛 陈陆 王川庆 《病毒学报》 CSCD 北大核心 2018年第3期362-371,共10页
为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的... 为了解2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV2)田间毒株重组特征,本研究对两株分离物(HENXX-8、HENJY-2)进行全基因测序、进化分析及毒力测定,并对其全基因序列进行重组分析。结果显示,两个毒株均属于PRRSV 2,两者与其代表株VR-2332的核苷酸相似性分别为85.6%、85.7%;与高致病性PRRSV(HPPRRSV)毒株JXA1、TJ和WUH4株分别为85.7%-85.8%、85.4%-85.5%;与经典毒株CH-1a、HB-2(sh)分别为84.7%-85.7%、84.5%-85.7%;而与所有NADC30类毒株均在90.0%以上。全基因、ORF5及Nsp2序列进化分析结果均显示两个分离物与国内报道的类NADC30毒株遗传距离较近,同处于一个分支。全基因组重组分析结果表明,两个分离毒株存在明显重组现象,且重组模式均以类NADC30毒株为骨架病毒,与HP-PRRSV毒株发生重组。但重组对象不同:HENJY-2是由类NADC30毒株与TJ株发生重组;而HENXX-8则是由类NADC30毒株与WUH4、TJ株发生3毒株间重组。由于重组部位序列缺乏特异性分子标志,因此无法确定与类NADC30发生重组的是HP-PRRSV还是其减毒的疫苗毒株。两株分离物的重组部位与早期分离毒株HENANHEB、JL580等有所不同,均未涉及到ORF5基因,而是集中在Nsp1-Nsp2以及ORF2a-ORF3区域,主要发生在病毒基因组的靠5#端(30-7 000bp)和3#端(11 000-13 000bp)处。对部分重要基因的核苷酸相似性分析结果显示,两个分离株的ORF2a、ORF3基因与HP-PRRSV毒株相似性最高,表明重组病毒的这两个基因可能来自HPPRRSV毒株。致病性试验结果表明,参考毒株HENXC-4的毒力略高于分离毒株HENXX-8,主要表现在体温升高、日均增重降低和肺部病变上。但两个分离物均未引起发病猪死亡。以上结果表明,目前PRRSV2在田间的基因重组事件存在随机性,提示不同毒株在田间的存在会加剧PRRSV重组事件的发生和流行、毒株类型更加复杂,从而增加了临床防控难度。因此,慎重使用活疫苗� 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 病毒分离鉴定 NADC30 HP-PRRSV 全序列 遗传进化分析 重组分析 致病性
PRRSV诱导猪体内肺泡巨噬细胞炎症模型的建立 预览 被引量:2
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作者 罗文涓 杨剑 +6 位作者 敖妙 刘妍璨 覃一峰 文露婷 黎江 韦英益 胡庭俊 《南方农业学报》 CSCD 北大核心 2018年第1期155-163,共9页
【目的】建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)诱导体内猪肺泡巨噬细胞(PAM)炎症模型,评价PRRSV感染对仔猪免疫系统的影响,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断及科学防控提供参考依据。【方法】以PRRSVGXNN1396株人工感染30日龄健康断... 【目的】建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)诱导体内猪肺泡巨噬细胞(PAM)炎症模型,评价PRRSV感染对仔猪免疫系统的影响,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断及科学防控提供参考依据。【方法】以PRRSVGXNN1396株人工感染30日龄健康断奶仔猪,复制出PRRS病症,剖杀后采集病料,通过组织病理学和RT-PCR检测观察各免疫器官组织的病理变化及其病毒分布情况,并检测PAM细胞内的COX-1、COX-2等酶活性变化及IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、MCP-1和TNF-α等炎性细胞因子水平变化。【结果】断奶仔猪接种PRRSV-GXNN1396株后第3d开始表现出典型的PRRS病症,PRRSV主要集中在肺脏、颌下淋巴结、血液和扁桃体等样品组织中,攻毒仔猪各主要器官的实质细胞及有关淋巴细胞均出现不同程度坏死和炎症细胞浸入现象,尤其以肺脏、肾脏、脾脏等器官受损严重,出现巨噬细胞和淋巴细胞浸润。PRRSV感染早期(第3d)仔猪PAM细胞中的ROS水平及COX-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等因子水平均呈升高趋势,且COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α因子水平极显著升高(P<0.01);随着感染天数的增加,PAM细胞内的COX-2、IL-6和IL-8因子水平呈下降趋势,TNF-α因子水平呈上升趋势。【结论】成功建立了PRRSV诱导仔猪体内PAM细胞炎症模型,进一步佐证PRRSV主要侵害猪的免疫器官组织,以达到免疫抑制的效果,并推断感染第3d是病猪炎症反应的高峰期。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 肺泡巨噬细胞(PAM) 炎症模型 炎性细胞因子
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2016-2017年广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因遗传变异分析
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作者 王艳午 覃燕灵 +5 位作者 董建国 于林洋 刘燕玲 张乐宜 吴志君 宋长绪 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第23期96-101,共6页
为了深入了解2016—2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR法对从广东省规模化猪场采集的106份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的肺脏病料进行鉴定,并对分离的PRRSV毒株NSP2基因构建遗传进化... 为了深入了解2016—2017年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR法对从广东省规模化猪场采集的106份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的肺脏病料进行鉴定,并对分离的PRRSV毒株NSP2基因构建遗传进化树,以及进行同源性分析和氨基酸序列比对。结果表明:经RT-PCR法检测有12份病料为阳性,阳性率为11.32%;分离毒株均为美洲型毒株,有11株毒株与高致病性猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(Highly-pathogenicPRRSV,HP-PRRSV)毒株在同一分支上,1株毒株与以NADC30为代表的毒株在同一分支上;同源性分析显示,PRRSVNSP2基因序列与VR-2332的同源性为53.0%~76.7%,与CH-1a的同源性为51.9%~92.5%,与HuN4的同源性为51.3%~98.2%,与JXA1的同源性为51.6%~98.3%,与NADC30的同源性为51.5%~92.2%,与JXA1-P80的同源性为50.9%~98.3%;氨基酸序列比对结果显示,与美洲型代表株VR-2332和低致病性毒株CH-1a相比,除GDth毒株外其余11株PRRSV毒株在高变区均有多处氨基酸位点发生突变。说明2016—2017年广东地区PRRSV流行株以高致病性毒株为主,并且出现NADC30样毒株。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 肺脏 高致病性 病毒分离 非结构蛋白2(NSP2) 流行病学分析
不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立
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作者 马思续 崔春晓 +6 位作者 张留君 冯延 魏凤灵 许瑞勤 杨国宇 夏平安 张改平 《中国兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第6期1082-1087,共6页
为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,... 为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的间接ELISA方法,本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因,将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中,成功构建重组质粒pET32a—GP4、pET-32a-N和pET-32a—GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4N融合蛋白,并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原,通过不断优化反应条件,最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体,并与商品化试剂盒进行比较,结果显示,GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82.7%,N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87.2%,GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85.5%;因此,N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP4蛋白 N蛋白 原核表达 间接ELISA方法
2015年、2016年我国部分地区猪群猪繁殖与呼吸综合征的分子流行病学研究
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作者 赵蕾 吴发兴 +3 位作者 张锋 董雅琴 杨增岐 李晓成 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2018年第10期96-100,244共6页
为了解我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和流行趋势,试验利用RT-PCR方法对2015年、2016年全国超过20个省份的3 078份疑似PRRS病料进行检测,并扩增部分阳性病料的ORF5基因进行测序和遗传变异分析。结... 为了解我国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况和流行趋势,试验利用RT-PCR方法对2015年、2016年全国超过20个省份的3 078份疑似PRRS病料进行检测,并扩增部分阳性病料的ORF5基因进行测序和遗传变异分析。结果表明:PRRSV阳性样本共889份,阳性率为28.88%。扩增得到177个ORF5的基因序列,通过序列分析发现,我国流行的PRRSV主要为美洲型,其中90份与高致病性PRRSV(HP-PRRSV)高度同源,53份与经典PRRSV高度同源,34份与NADC30-like PRRSV高度同源,其中14份流行毒株的GP5蛋白糖基化位点N34发生缺失。说明监测地区主要流行HP-PRRSV,同时NADC30-like PRRSV已经形成一个相对独立的分支在我国流行,提示有必要加强PRRSV变异毒株的流行和变异的监测,同时对其致病性等生物学特性进行深入研究。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) NADC30-like株 流行病学 RT-PCR ORF5基因 遗传演化分析
定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用 预览
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作者 夏文龙 吴植 +5 位作者 郭长明 朱善元 余树培 张鑫宇 夏晓莉 孙怀昌 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第4期881-887,共7页
为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离... 为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4 ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54 ng/mL,持续时间为15 d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 游离受体 夹心ELISA 定量检测
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LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响 被引量:1
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作者 甘利鹏 张婧 +10 位作者 孙普 白伟杰 王治家 曹轶梅 李坤 白兴文 包慧芳 李平花 李冬 刘在新 卢曾军 《中国兽医科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期537-544,共8页
应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_0017904... 应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。 展开更多
关键词 PRRSV LncRNA TCONS00179042 MARC-145细胞 过表达 复制
猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的正调节作用 预览
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作者 魏凤灵 张莹莹 +7 位作者 许瑞勤 李闻 李想通 孙杨杨 张留君 杨国宇 夏平安 张改平 《畜牧兽医学报》 CSCD 北大核心 2018年第12期2680-2689,共10页
为了研究PRRSVM蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的激活机制,以PRRSVHn-1/06毒株cDNA为模板扩增ORF6基因片段,分别构建了重组质粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM(缺失ITIM基序)。将重组质粒分别转染Marc-145细胞,用荧光定量PCR方法检测TRI... 为了研究PRRSVM蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的激活机制,以PRRSVHn-1/06毒株cDNA为模板扩增ORF6基因片段,分别构建了重组质粒pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM(缺失ITIM基序)。将重组质粒分别转染Marc-145细胞,用荧光定量PCR方法检测TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-β的mRNA转录水平;结果表明,pcDNA3.0-GP6组与pcDNA3.0-GP6△ITIM组相比:TRIF、IRF3、IRF7mRNA转录水平上调(此处为总体趋势,个别时间点可能不完全相符,下同),MyD88、TRAF6mRNA转录水平下调。分别将重组质粒和Poly(I:C)共转染Marc-145细胞,检测TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-βmRNA转录水平;结果表明,pcDNA3.0-GP6组与pcDNA3.0-GP6△ITIM组相比,TRIF、IRF3、IRF7mRNA转录水平上调,NF-κB、IFN-βmRNA转录水平在36h上调。将SHP-1-siRNA-781、SHP-2-siRNA-1335分别与pcDNA3.0-GP6、pcDNA3.0-GP6△ITIM重组质粒共转染Marc-145细胞,通过荧光定量PCR方法检测TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-βmRNA转录水平;结果表明,沉默SHP-1后,pcDNA3.0-GP6组与pcDNA3.0-GP6△ITIM组相比,TRIF、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平12h后显著下调;而沉默SHP-2后,TRIF、IRF3、NF-κB、IFN-βmRNA转录水平均为先升高再降低,后趋于稳定,而IRF7mRNA转录水平被持续上调到48h。M蛋白的ITIM基序可能通过调节TLR3-TRIF依赖型信号通路激活IFN-β的产生;SHP-1在M蛋白的ITIM基序激活Ⅰ型干扰素的信号传导途径中可能起关键调节作用,而ITIM基序与SHP-2的关系还需要进一步探索。本试验结果为进一步明确ITIM基序的作用机制提供参考。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) M蛋白 ITIM基序 荧光定量PCR IFN-Β
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An Attenuated Highly Pathogenic Chinese PRRS Viral Vaccine Confers Cross Protection to Pigs against Challenge with the Emerging PRRSV NADC30-Like Strain
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作者 Hewei Zhang Mingqi Xia +10 位作者 Wei Wang Decai Ju Long Cao Bai Wu Xin Wang Ying Wu Ni Song Jiaxin Hu Changxiao Tian Shucheng Zhang Hua Wu 《中国病毒学:英文版》 CAS CSCD 2018年第2期153-161,共9页
关键词 PRRSV 中国人 小猪 疫苗 保护 病原 稀释 病毒
2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF 5基因变异分析 预览
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作者 袁为锋 张帆帆 +10 位作者 李龙显 李昊 张付华 刘小萍 叶昱 李凯 黄冬艳 丁珍 吴琼 宋德平 唐玉新 《中国畜牧兽医》 北大核心 2018年第10期2831-2839,共9页
为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病... 为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF 5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF 5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF 5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株(HP-PRRSV);3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF 5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株(HP-PRRSV)为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 分子流行病学 ORF 5基因 变异分析
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2016~2017年四川地区PRRS病毒ORF5基因的遗传变异分析 预览
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作者 丁梦蝶 朱佳文 +3 位作者 梁璐琪 张毅 陈斌 邵靓 《四川畜牧兽医》 2018年第7期31-33,共3页
为了解四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,本试验对2016~2017年四川地区的12份PRRSV阳性样本的ORF5基因进行了测序及遗传进化分析。结果 显示:12个样本毒株的ORF5基因的核苷酸序列同源性为82.3%~99.8%... 为了解四川地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,本试验对2016~2017年四川地区的12份PRRSV阳性样本的ORF5基因进行了测序及遗传进化分析。结果 显示:12个样本毒株的ORF5基因的核苷酸序列同源性为82.3%~99.8%,推导的氨基酸同源性为81.1%~99.5%,与美洲型和欧洲型代表毒株的核苷酸序列同源性分别为82.8%~99.5%和61.4%~64.6%。氨基酸序列比对结果表明在抗原表位区域存在氨基酸变异;进化分析表明12个毒株均属于美洲型,其中10株属于JXA1-like亚群,1株属于NADC30亚群、1株属于QYYZ亚群。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因 遗传变异
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