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甘露聚糖酶Man1602中的色氨酸修饰及其突变体性质的研究 预览
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作者 雍婕 高晗 +1 位作者 吴永尧 周海燕 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期45-49,共5页
为了揭示色氨酸残基与Man1602酶活力的关系,提高Man1602的表达量,笔者通过研究色氨酸专一化学修饰剂与甘露聚糖酶Man1602的反应,同时根据甘露聚糖酶Man1602的序列比对结果,推测色氨酸残基与酶活的关系,对保守位点的色氨酸进行定点突变,... 为了揭示色氨酸残基与Man1602酶活力的关系,提高Man1602的表达量,笔者通过研究色氨酸专一化学修饰剂与甘露聚糖酶Man1602的反应,同时根据甘露聚糖酶Man1602的序列比对结果,推测色氨酸残基与酶活的关系,对保守位点的色氨酸进行定点突变,检测各突变体酶的活力变化。结果表明,色氨酸为甘露聚糖酶Man1602的活性必需氨基酸,其中W196和W199位点的突变导致酶活几乎完全丧失,可以推断W196和W199为活性中心的氨基酸,W198也具有较高保守性,但对其突变并未造成酶的完全失活,推断W198是维持活性中心疏水性的重要氨基酸。 展开更多
关键词 甘露聚糖酶 色氨酸 化学修饰 定点突变
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解淀粉芽孢杆菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢杆菌中的高效表达 预览
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作者 邱锦 黄火清 +1 位作者 姚斌 罗会颖 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期134-143,共10页
α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1, 4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具... α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1, 4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具有重要的研究意义。以目前广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的中温中性淀粉酶 BAMYA 出发,通过理性设计在该淀粉酶的C 端结构域设计突变位点,利用定点突变提高其水解活力,并在枯草芽孢杆菌中实现高效表达。野生型酶 BAMYA 的最适作用温度和 pH 分别为 55℃和 6.0,比活为 6 835 U/mg。突变体 BAMYA-L473K/K474H/N475K 最适作用温度为 60℃,较野生型提高了 5℃,作用的最适 pH 没有发生变化。突变体比活为 10 148 U/mg,比野生型提高 48%。野生型 BAMYA 和突变体 BAMYA-L473K/K474H/N475K 的 Km 值、催化效率分别为 3.58 mg/mL 和 2.21 mg/mL,以及 1 577 mL/(s·mg)和 4 760 mL/(s·mg)。催化效率较野生型相比提高了 2 倍以上。该突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,降低应用成本。 展开更多
关键词 Α-淀粉酶 定点突变 枯草芽孢杆菌 催化效率
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羊毛硫细菌素变体及其生物活性研究进展
3
作者 叶德晓 钟雪晴 +1 位作者 付鸣佳 杨志海 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期1649-1657,共9页
羊毛硫细菌素是由细菌核糖体上合成并经翻译后加工修饰而成的一类抗菌肽。已经在多种G+细菌中发现有羊毛硫细菌素,大多对G+细菌有抑菌作用。羊毛硫细菌素的基因工程无法从单一的表达羊毛硫细菌素结构基因获得高活性的成熟羊毛硫细菌素... 羊毛硫细菌素是由细菌核糖体上合成并经翻译后加工修饰而成的一类抗菌肽。已经在多种G+细菌中发现有羊毛硫细菌素,大多对G+细菌有抑菌作用。羊毛硫细菌素的基因工程无法从单一的表达羊毛硫细菌素结构基因获得高活性的成熟羊毛硫细菌素。本研究综述了羊毛硫细菌素前体分子定向位点突变后,由修饰酶重新识别和修饰可产生结构变异的可分泌的变体分子和无法分泌的变体分子,对羊毛硫细菌素分子突变位点进行了分类和归纳,并总结了羊毛硫细菌素分子突变位点与其生物活性的关系。在现有羊毛硫细菌素应用成果有限的条件下,对于工程改造羊毛硫细菌素和增强其抑菌活性具有重要意义。 展开更多
关键词 羊毛硫细菌素 定向位点突变 变体 抗菌活性
TALEN介导水稻OsTZF9基因定点突变研究 预览
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作者 周淑芬 施惠芳 《福建农业科技》 2019年第2期11-15,共5页
RRTZF锌指基因在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。利用TALEN基因组编辑技术定点突变水稻RRTZF基因OsTZF9,结果表明:根据日本晴基因组中的OsTZF9基因序列,设计3对TALEN靶序列,并构建相应的3个TALEN植物敲除表达载体;通过农杆菌介... RRTZF锌指基因在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。利用TALEN基因组编辑技术定点突变水稻RRTZF基因OsTZF9,结果表明:根据日本晴基因组中的OsTZF9基因序列,设计3对TALEN靶序列,并构建相应的3个TALEN植物敲除表达载体;通过农杆菌介导法分别将3个TALEN敲除载体导入水稻明恢86和秀水134的胚性愈伤组织中,获得了100个转化再生植株,PCR检测获得87个阳性植株;PCR扩增转基因植株靶突变区并测序列,发现所有转基因植株均未出现靶突变。 展开更多
关键词 水稻 OsTZF9基因 TALEN 定点突变
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环糊精水解酶cds1-3底物通道氨基酸的定点突变研究 预览
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作者 汤宏赤 莫莉 +3 位作者 闭海 林丽华 郭媛 庞浩 《广西科学》 CAS 2019年第4期410-416,共7页
本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形... 本研究对具有大分子水解能力的环糊精水解酶cds1-3的蛋白结构进行分析,选取底物通道相关氨基酸进行定点突变。通过比较突变酶和野生酶的功能差异,定位决定cds1-3特殊功能的氨基酸。采用sybyl 1.2进行蛋白质底物结合分析,选取和多聚体形成、底物结合以及底物通道相关的氨基酸Glu66、Pro48、Phe289为突变位点,反向PCR构建pSE380/E66G、pSE380/P48H、pSE380/F289A表达质粒并进行表达,获得酶活突变体并与原始酶进行底物特异性比较分析。其结果显示,突变酶E66G降解大分子底物木薯淀粉和支链淀粉的相对酶活力分别提高26.96%和23.15%,而对小分子底物普鲁兰糖的水解能力下降13.14%。因此,cds1-3是一个能水解大分子底物的特殊环糊精水解酶,氨基酸Glu66是cds1-3水解大分子支链淀粉的关键氨基酸之一。 展开更多
关键词 环糊精水解酶 同源建模 底物通道 定点突变 蛋白结构 氨基酸
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采用随机突变方法对β-琼胶酶YM01-3活性位点的研究
6
作者 曲雯雯 吴蕾蕾 +2 位作者 周顺 史晓翀 张晓华 《微生物学通报》 CSCD 北大核心 2018年第9期2000-2005,共6页
【背景】琼胶酶是一种多糖水解酶,在保健食品、医药、科研及化妆品等行业极具价值。本实验室发现来源自嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3具有较高的酶活性,在最适条件下的比酶活可达到1.14×10~4U/mg。【... 【背景】琼胶酶是一种多糖水解酶,在保健食品、医药、科研及化妆品等行业极具价值。本实验室发现来源自嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3具有较高的酶活性,在最适条件下的比酶活可达到1.14×10~4U/mg。【目的】探讨不同位点的突变对β-琼胶酶YM01-3酶活力的作用,发现影响其酶活力的新位点。【方法】通过易错PCR在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)表达系统中构建随机突变文库,从约10 000个克隆中筛选出227株有效突变体,从中选取80株进行测序。【结果】对突变体序列进行分析和定点突变验证发现,137位和237位氨基酸发生突变后酶活力丧失90%以上。【结论】位于催化腔内的137位和237位氨基酸,对于维持β-琼胶酶YM01-3酶活力具有重要作用。该研究结果为β-琼胶酶的催化机理研究及分子改造提供了借鉴。 展开更多
关键词 β-琼胶酶YM01-3 随机突变 定点突变
分子模拟对接和定点突变提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶的活力 预览
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作者 欧阳萍兰 黄佳俊 +5 位作者 林淑玲 魏韬 林俊芳 郭丽琼 刘俊峰 刘绮倩 《华南农业大学学报》 CSCD 北大核心 2018年第5期87-92,共6页
【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰CoA的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠... 【目的】提高10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶(DBAT)活力,从而更高效地体外酶促合成巴卡亭Ⅲ。【方法】通过DBAT与其天然底物乙酰CoA的计算机分子模拟对接,选定C165W、N300I、F160C 3个氨基酸残基进行单点定点突变。突变基因经大肠埃希菌重组表达,突变重组酶特性经体外酶促反应测定。【结果】3种突变重组酶的相对分子质量为67 000;最适反应温度均为32.5℃,与野生酶DBAT一致;DBAT^F160C与DBAT的最适反应pH为7.5,略高于DBAT^C165W和DBAT^N300I的最适反应pH(7.0);DBAT^C165W、DBAT^F160C和DBAT^N300I的比活力与DBAT相比分别提高了61.5%、59.6%和19.2%,催化效率分别提高了55.4%、35.1%和2.9%,3种突变酶的米式常数(Km)和最大反应速率(vmax)均高于DBAT。【结论】疏水突变导致突变酶的比活力相比野生型均有显著提高,研究结果为体外高效酶促合成紫杉醇化学半合成的直接前体物巴卡亭Ⅲ奠定了基础。 展开更多
关键词 10β–去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶 分子模拟对接 定点突变 比活力 酶促反应 巴卡亭Ⅲ
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HaV01 Pol内部半胱氨酸对其剪接活性的影响 预览
8
作者 李佳 孟清 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期13-17,共5页
希望获得一个内部不含有半胱氨酸的蛋白质内含子作为标记和修饰的工具。通过定点突变和搭桥PCR技术对 HaV01 Pol内部4个半胱氨酸Cys进行突变和替换,然后通过Western Blot检测对应的蛋白质内含子活性。结果发现,位于112位的半胱氨酸突... 希望获得一个内部不含有半胱氨酸的蛋白质内含子作为标记和修饰的工具。通过定点突变和搭桥PCR技术对 HaV01 Pol内部4个半胱氨酸Cys进行突变和替换,然后通过Western Blot检测对应的蛋白质内含子活性。结果发现,位于112位的半胱氨酸突变可以影响 HaV01 Pol的剪接活性,其余3个对其剪接活性则没有任何影响,用甘氨酸Gly和苏氨酸Thr替换112Cys后,可以挽救 HaV01 Pol的剪接活性。第一次发现一个非保守区的半胱氨酸可以决定蛋白质内含子的活性。通过Gly和Thr替换成功获得了2个没有半胱氨酸的 HaV01 Pol蛋白质内含子,为 HaV01 Pol进一步改造和应用奠定了基础。 展开更多
关键词 半胱氨酸 蛋白剪接 定点突变
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高效定点突变肠道病毒71 VP1基因的研究
9
作者 王欢 《生物技术》 2018年第5期450-454,共5页
[目的]肠道病毒71(Enterovirus 71,EV71)是引发手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)的主要病原体之一,为了筛选EV71抗原表位,开发新型EV71疫苗,利用优化后的PCR点突变技术定点突变EV71VP1基因。[方法]设计含有突变位点的互补引... [目的]肠道病毒71(Enterovirus 71,EV71)是引发手足口病(Hand-foot-mouth Disease,HFMD)的主要病原体之一,为了筛选EV71抗原表位,开发新型EV71疫苗,利用优化后的PCR点突变技术定点突变EV71VP1基因。[方法]设计含有突变位点的互补引物,模板使用量为10 ng,进行单引物PCR,将PCR产物混合后复性,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆并测序。[结果]测序结果表明VP1基因突变率为40%~45%。[结论]该方法对传统的PCR点突变技术进行改进,降低模板使用量,使用单引物PCR,省略DpnⅠ酶解过程,可达到40%~45%的定点突变率,从而降低实验成本、简化操作流程。 展开更多
关键词 EV71 VP1 PCR 定点突变
分子改造提高谷氨酰胺转氨酶的催化活性 预览
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作者 任蕊蕊 刘松 +2 位作者 李江华 堵国成 陈坚 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2018年第9期9-14,共6页
谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13,Transglutaminase,TGase)是一种重要的食品酶。为提高其催化活性,通过Discovery Studio 2017预测了Streptomyces mobaraense TGase中影响其与底物α-N-CBZ-GLN-GLY结合自由能的氨基酸位点,构建得到结合... 谷氨酰胺转氨酶(EC2.3.2.13,Transglutaminase,TGase)是一种重要的食品酶。为提高其催化活性,通过Discovery Studio 2017预测了Streptomyces mobaraense TGase中影响其与底物α-N-CBZ-GLN-GLY结合自由能的氨基酸位点,构建得到结合自由能下降的TGase突变体:Y24W、E300W和Y302R。与野生TGase相比,E300W的比酶活提高了31%;K m、k cat和k cat/K m值分别提高了10%、42%和29%,说明E300W比酶活的提高主要是由于酶转换数的增加。Y24W、E300W和Y302R的热稳定性均有不同程度下降。作用力分析发现,Y24W、E300W和Y302R主链-主链氢键分别减少1、2和4个。上述结果表明,基于蛋白质结合自由能分析的策略能迅速鉴定影响TGase催化活性关键氨基酸,进一步突变能有效提高其催化活性。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转氨酶 解脂耶氏酵母 定点突变 高效表达 酶学性质
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α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化 预览 被引量:1
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作者 秦海彬 熊涛 +1 位作者 张博 牛坤 《生物技术通报》 CSCD 北大核心 2017年第8期180-185,共6页
3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活... 3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn~(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。 展开更多
关键词 α-酮戊二酸半醛脱氢酶 定点突变 表达纯化 酶学性质
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米根霉α-淀粉酶高麦芽糖生成能力相关氨基酸的初步分析 预览
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作者 田方源 汤斌 +1 位作者 李松 杨倩 《食品与发酵工业》 CSCD 北大核心 2017年第8期27-32,共6页
利用计算机辅助模拟分析技术对米根霉α-淀粉酶与麦芽三糖进行分子对接,并选择可能与该酶的高麦芽糖生成能力相关的氨基酸残基进行突变和分析。研究表明:突变体YHR和H286L最适作用温度分别比原酶的最适作用温度(50℃)提高了10℃和5... 利用计算机辅助模拟分析技术对米根霉α-淀粉酶与麦芽三糖进行分子对接,并选择可能与该酶的高麦芽糖生成能力相关的氨基酸残基进行突变和分析。研究表明:突变体YHR和H286L最适作用温度分别比原酶的最适作用温度(50℃)提高了10℃和5℃;突变体H286L的最适作用pH下降了0.5。与原酶相比,突变体YHR和H286L作用麦芽三糖终产物中麦芽糖含量分别提高了18.87%和16.87%,作用可溶性淀粉终产物中麦芽糖含量分别提高了11.67%和10.32%。初步确定H286与该酶高麦芽糖生成能力之间的关系最为密切,其次为Y80和R333。 展开更多
关键词 真菌01.淀粉酶 麦芽糖 蛋白质结构 定点突变
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利用Red重组系统在腺病毒大质粒上快速实现单碱基点突变
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作者 羊嬉春 王芃 +5 位作者 杨巧玲 周建光 王健 黄芳 李山虎 郑继平 《军事医学》 CSCD 北大核心 2017年第12期962-967,共6页
目的在包含腺病毒全基因组40 kb的大质粒上快速实现单碱基突变。方法通过重叠PCR方法扩增出含有突变位点的打靶DNA,将腺病毒大质粒和打靶DNA共同转化入Red高重组率大肠杆菌中,通过菌落PCR联合酶切鉴定的方法,筛选到携带突变位点大质粒... 目的在包含腺病毒全基因组40 kb的大质粒上快速实现单碱基突变。方法通过重叠PCR方法扩增出含有突变位点的打靶DNA,将腺病毒大质粒和打靶DNA共同转化入Red高重组率大肠杆菌中,通过菌落PCR联合酶切鉴定的方法,筛选到携带突变位点大质粒的菌株。并将得到的突变大质粒再次转化入质粒高稳定菌株DH10B中,以保持质粒骨架的稳定性。结果通过该法在腺病毒的9171位点和24410位点连续引入了2个单碱基突变。酶切鉴定了骨架质粒的稳定性,测序结果显示突变位点正确。结论成功建立了一种快速在40 kb的腺病毒大质粒上实现单碱基突变的技术,阳性突变位点检出率在5%~15%,该法的建立为研究腺病毒的毒理作用提供了技术平台。 展开更多
关键词 RED重组 腺病毒科 质粒 定点突变
定点突变Ca2+平衡位点对粘质沙雷氏菌脂肪的影响
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作者 陈英 陈小玲 黄俊 《基因组学与应用生物学》 CSCD 北大核心 2017年第12期5205-5209,共5页
为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca2+对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca2+的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由4... 为了研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)脂肪酶lip A中的Ca2+对酶活力的影响,采用定点突变的方法对平衡Ca2+的位点D388进行定点突变,对突变体进行诱导表达后,纯化目的蛋白并进行酶学性质分析。与野生酶相比,突变酶的最适温度由40℃降低到25℃,最适p H值由8.5降到8.0,T1/2值比野生酶提高了2℃。由此可知,该Ca2+对脂肪酶lip A酶学性质有着至关重要的作用。 展开更多
关键词 粘质沙雷氏菌 脂肪酶lipA CA2+ 定点突变
恩拉霉素生产菌株的遗传改造 被引量:1
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作者 牟慧艳 刘扬 +3 位作者 王应东 刘宝爱 魏建军 张会图 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期126-132,共7页
【目的】提高杀真菌素链霉菌发酵生产恩拉霉素的产量。【方法】利用定点突变技术,对恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌F1中影响细胞次级代谢及抗生素合成的核糖体S12蛋白的编码基因rps L进行改造,将第43位的赖氨酸(Lys)分别替换为天冬... 【目的】提高杀真菌素链霉菌发酵生产恩拉霉素的产量。【方法】利用定点突变技术,对恩拉霉素生产菌株杀真菌素链霉菌F1中影响细胞次级代谢及抗生素合成的核糖体S12蛋白的编码基因rps L进行改造,将第43位的赖氨酸(Lys)分别替换为天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg),并对改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的生长特性、抗生素合成以及摇瓶发酵性能进行研究。【结果】与野生型菌株相比,改造菌株的生长特性及生理生化特性均发生了明显的改变:产孢周期明显缩短,野生型菌株在MS培养基中,28°C下需要培养5-7 d后才能产生孢子,而在相同条件下,改造菌株3 d后就能产生大量的孢子;恩拉霉素产量相对提高,摇瓶发酵条件下,改造菌株L-M1(Asn43)和L-M2(Arg43)的恩拉霉素产量分别可达到1 334 U/m L和1 456 U/m L,与野生型菌株F1相比分别提高了11.9%和22.1%。【结论】通过遗传改造,恩拉霉素的产量得到了提高,为其他位点的遗传改造提供了可行性。 展开更多
关键词 恩拉霉素 抗生素 抗真菌素链霉菌 遗传改造 核糖体S12蛋白 定点突变
人IL-29定点突变体抗肿瘤细胞增殖活性分析 预览
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作者 李利云 陆源 +5 位作者 葛春蕾 彭荣刚 李昕哲 谭敬 陈永康 陈伟 《食品与生物技术学报》 CSCD 北大核心 2017年第5期553-559,共7页
为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获... 为分析人白细胞介素-29(h IL-29)变异体抗肿瘤细胞增殖活性,采用大引物PCR方法对人h IL-29基因第104位碱基进行点突变,使h IL-29肽链第35位Arg定点改造为Lys。得到的h IL-29变异体基因经重组后转化毕赤酵母GS115和诱导表达,经纯化获得重组蛋白rh IL-29^mut35。SDS-PAGE分析显示rh IL-29^mut35的相对分子质量约23×10^3,Western Blotting鉴定显示其与羊抗人IL-29多克隆抗体发生特异性结合反应。用CCK-8试剂检测rh IL-29^mut35对肿瘤细胞增殖的影响,rh IL-29^mut35在不同质量浓度时对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8的增殖均有抑制作用,高剂量组(1 000 ng/m L)rh IL-29mut35对胃癌细胞SGC7901、肝癌细胞BEL7402、肺腺癌细胞A549和结肠癌细胞HCT8增值的抑制率分别为(34.20±1.50)%、(27.30±0.31)%、(30.20±0.68)%、(29.13±1.40)%,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P〈0.01)。而且高剂量组的抗增殖效应高于野生型rh IL-29的(P〈0.01),这为进一步研制开发IL-29的抗肿瘤药物奠定基础。 展开更多
关键词 人白细胞介素-29 定点突变 重组蛋白 抗肿瘤活性
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定点突变法构建人尼古丁受体α5亚单位突变体(Asn398)慢病毒表达载体
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作者 赵祝香 彭芳 +2 位作者 何桦 李裕军 赵子文 《广州医科大学学报》 2017年第2期6-10,共5页
目的:克隆人尼古丁受体α5亚单位(CHRNA5),以野生型CHRNA5为模板,通过定点突变法构建CHRNA5突变体(Asn398)慢病毒真核表达载体,为Asn398功能研究提供基础。方法:RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,运用重叠延伸PCR法进行定点突变,定向克隆... 目的:克隆人尼古丁受体α5亚单位(CHRNA5),以野生型CHRNA5为模板,通过定点突变法构建CHRNA5突变体(Asn398)慢病毒真核表达载体,为Asn398功能研究提供基础。方法:RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,运用重叠延伸PCR法进行定点突变,定向克隆至EX-Q0146-LV201,序列分析鉴定野生及突变重组子,将CHRNA5突变体Asn398及未突变体定向克隆到EX-Q0146-LV201慢病病毒表达质粒上。并转染至HEK293T细胞中,RT-PCR检CHRNA5 mRNA表达,Westernblot检测其蛋白表达。结果:重组子目的基因的序列分析结果显示成功克隆CHRNA5 cDNA基因,并成功将CHRNA5第398位氨基酸天冬氨酸(Asp)转变为天冬酰胺(Asn),突变体及未突变在转染细胞中均获得CHRNA5 mRNA及蛋白表达。结论:成功构建CHRNA5突变体Asn398慢病毒表达载体,证实其在293细胞中有mRNA转录及其蛋白表达,为下一步进行功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 尼古丁受体 定点突变 慢病毒 突变
CRISPR/Cas技术的研究进展
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作者 贺冬梅 曹宗喜 +5 位作者 田语诗 魏玉情 徐静伟 叶保国 林哲敏 陈朝喜 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第11期49-53,共5页
定点基因编辑技术是目前研究的热点,它对于基因功能研究、寻找合适药物作用靶标具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白( clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR... 定点基因编辑技术是目前研究的热点,它对于基因功能研究、寻找合适药物作用靶标具有重要意义。成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白( clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR - associated proteins, CRISPR/Cas) 技术作为一种新兴的定点基因编辑技术工具应用范围较广,成为改变物种基因的新方法。文章就其结构、原理、运用范围、最新研究进展和发展前景进行了阐述,希望为该研究提供有益的参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 定点基因编辑 Cas9 crRNAs 定点突变
定点突变提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性 被引量:1
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作者 叶双双 周丽 周哲敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1243-1254,共12页
嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表... 嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比原始酶(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比原始酶(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示原始酶和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的T_m值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃和54.8℃。蛋白三维结构模拟推测突变体热稳定性提高机理为:突变体K94R中Arg94与Ile95之间形成额外氢键,稳定其所在的柔性区域;突变体G221A中Ala221与Leu281产生疏水作用,稳定酶分子C-端柔性区。该研究结果为蛋白质热稳定性改造提供了参考,也为苯丙氨酸羟化酶在功能性食品领域的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 苯丙氨酸羟化酶 热稳定性 定点突变 丙氨酸突变 精氨酸突变
耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响 预览 被引量:1
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作者 申莹莹 郑宏臣 +3 位作者 李树芳 付晓平 徐健勇 宋诙 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期12-17,共6页
通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pu... 通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A^Y14A、Pul A^D16A、Pul A^K62A和Pul A^R96A。其中,突变酶Pul A^Y14A和Pul A^R96A的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A^Y14A和Pul A^R96A的最适作用温度均降低了10℃,Pul A^R96A的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 耐热普鲁兰酶 CBM68 定点突变 底物亲和力 催化效率
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